方法論記事

タンパク質アルギニンメチル化の研究:アプローチと方法

DOI：

10.3791/64821

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2023年1月20日

1Pharmacology and Toxicology and Structural Genomics Consortium, University of Toronto

この記事について

要約

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議論された記事:

Hutchinson, A., Seitova, A. バキュロウイルス発現ベクターシステムを用いた組換えPRMTタンパク質の作製.視覚化された実験のジャーナル。(173)、DOI:10.3791/62510(2021)。

Maniaci, M., Marini, F., Massignani, E., Bonaldi, T.質量分析に基づくプロテオミクスアプローチによる、グローバルで信頼性の高いタンパク質R-メチル化解析。視覚化された実験のジャーナル。(182)、DOI:10.3791/62409(2022年)。

Habisch, H., Zhang, F., Zhou, Q., Madl, T. 核磁気共鳴分光法によるアルギニンメチロームの探索.視覚化された実験のジャーナル。(178)、DOI:10.3791/63245(2021)。

Szewczyk, M. M., Vu, V., Barsyte-Lovejoy, D. 細胞内のタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ1-9活性を研究する定量的方法.視覚化された実験のジャーナル。(174)、DOI:10.3791/62418(2021)。

Poulard, C., Jacquemetton, J., Valantin, J., Treilleux, I., Le Romancer, M. 近接ライゲーションアッセイは、固定組織におけるタンパク質アルギニンメチル化の検出、局在化、および定量を可能にします。視覚化された実験のジャーナル。(185)、DOI:10.3791/64294(2022)。

編集記事

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タンパク質アルギニンメチル化は、広範囲の生物学的プロセスの調節に関与する翻訳後修飾です1,2,3。タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ(PRMT)ファミリーの9つのメンバーは、アルギニンをモノメチルおよびジメチルの対称または不斉の方法でメチル化できます。PRMTの機能的影響を理解し、メチル化基質をカタログ化することで、PRMT酵素の理解が劇的に進歩し、疾患との関連が促進されました2。さらに、強力で選択的な阻害剤の開発により、PRMT を研究するためのケミカルバイオロジーに基づくアプローチが可能になり、PRMT 標的薬の臨床開発が加速しました3。PRMTの分野が進むにつれて、新しい方法とその応用により、これらの酵素の制御と生物学の解明がさらに可能になります。

このメソッドコレクションでは、PRMTタンパク質の組換え産生に関する記事が、バキュロウイルスベースの発現系の詳細な説明を提供します4。細菌の発現を使用して、いくつかのPRMTを生成できます。ただし、PRMT7やPRMT5などのより大きなまたは複雑な依存性PRMTには、昆虫細胞発現システムが必要です。この方法は、PRMT の基質を決定するための多くの in vitro 研究にすでに恩恵をもたらしています。

細胞環境におけるPRMT基質の研究には、高度な検出アプローチが必要です。このコレクションの2つの論文は、メチル化アルギニンの抗体濃縮とそれに続く質量分析定量または核磁気共鳴(NMR)を使用した抗体非依存定量に依存する異なる方法論を示しています。異なるメチル化状態を認識するいくつかの抗体が開発され、PRMT基質を同定する研究で使用されています5。質量分析法は、代謝標識、その後の高度な分離技術、および抗体ベースの濃縮を採用することにより、細胞タンパク質アルギニンメチル化の定量的評価を可能にします6。PRMTファミリーのいくつかのメンバーは、タンパク質の本質的に無秩序な領域に存在する反復RGGモチーフに見られるメチル化アルギニンを好みます7。NMR分光法に基づく方法は、すべてのアルギニン誘導体(モノおよびジ、対称および非対称)のメチル化状態と位置を決定することができ、複雑な生物学的サンプル内で確実に定量することができます8。

最後に、特定のタンパク質中のメチル化アルギニン残基を同定するために、2つの論文でウェスタンブロッティングと近接ライゲーションアッセイ(PLA)に基づくアプローチを提供しています。これらの方法はどちらも抗体ベースの検出を利用しますが、検出方法と提供される情報が異なります。ウェスタンブロット法は定量的であり、化学プローブの特性評価に有用です9。PLAは、モノまたはジメチルアルギニンの標的タンパク質抗体とジェネリック抗体を使用するため、メチル化アルギニンの空間的位置に関する情報を提供し、したがって特異的抗体を生成する必要性を回避し、固定組織10に著しく使用することができる。

これらの多様な方法論を組み合わせることで、さまざまな細胞系や疾患状態におけるメチル化アルギニンの堅牢な発見が可能になり、PRMT 酵素の生物学的機能に関する基礎知識がさらに進歩します。

開示事項

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著者らは開示するものは何もない。

謝辞

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D.B.L. は、カナダ自然科学工学研究評議会 (NSERC) の支援を受けています。Structural Genomics Consortiumは、バイエルAG、ベーリンガーインゲルハイム、ブリストル・マイヤーズ スクイブ、ジェネンテック、オンタリオ・ゲノミクス研究所を通じてゲノム・カナダから資金提供を受けている登録慈善団体(番号:1097737)、EU/EFPIA/OICR/McGill/KTH/Diamond Innovative Medicines Initiative 2 Joint Undertaking [EUbOPEN grant 875510]、ヤンセン、メルクKGaA(カナダおよび米国ではEMD)、ファイザー、武田薬品工業から資金提供を受けています。

参考文献

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  1. Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
  2. Blanc, R. S., Richard, S. Arginine methylation: The coming of age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
  3. Wu, Q., Schapira, M., Arrowsmith, C. H., Barsyte-Lovejoy, D. Protein arginine methylation: from enigmatic functions to therapeutic targeting. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (7), 509-530 (2021).
  4. Hutchinson, A., Seitova, A. Production of recombinant PRMT proteins using the baculovirus expression vector system. Journal of Visualized Experiments. (173), e62510(2021).
  5. Dhar, S., et al. Loss of the major Type I arginine methyltransferase PRMT1 causes substrate scavenging by other PRMTs. Scientific Reports. 3, 1311(2013).
  6. Maniaci, M., Marini, F., Massignani, E., Bonaldi, T. A mass spectrometry-based proteomics approach for global and high-confidence protein R-methylation analysis. Journal of Visualized Experiments. (182), e62409(2022).
  7. Thandapani, P., O'Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S. Defining the RGG/RG motif. Molecular Cell. 50 (5), 613-623 (2013).
  8. Habisch, H., Zhang, F., Zhou, Q., Madl, T. Exploring the arginine methylome by nuclear magnetic resonance spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (178), e63245(2021).
  9. Szewczyk, M. M., Vu, V., Barsyte-Lovejoy, D. Quantitative methods to study protein arginine methyltransferase 1-9 activity in cells. Journal of Visualized Experiments. (174), e62418(2021).
  10. Poulard, C., Jacquemetton, J., Valantin, J., Treilleux, I., Le Romancer, M. Proximity ligation assay allows the detection, localization, and quantification of protein arginine methylation in fixed tissue. Journal of Visualized Experiments. (185), e64294(2022).

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