形態学的観察および細菌細胞損傷解析のための迅速技術としての接触モード原子間力顕微鏡法

サマリー

ここでは、細菌の特性評価のための簡単で迅速な方法としての原子間力顕微鏡(AFM)の応用を紹介し、細菌のサイズと形状、細菌培養バイオフィルム、殺菌剤としてのナノ粒子の活性などの詳細を分析します。

要約

電子顕微鏡は、細胞構造を特徴付けるために必要なツールの1つです。しかし、観察のための試料調製のため、手順は複雑で費用がかかります。原子間力顕微鏡(AFM)は、3次元での分解能が高く、真空やサンプルの導電率を必要としないため、非常に有用な特性評価技術です。AFMは、さまざまなトポグラフィーとさまざまな種類の材料でさまざまなサンプルをイメージングできます。

AFMは、オングストロームレベルからミクロンスケールまでの高解像度の3Dトポグラフィー情報を提供します。従来の顕微鏡とは異なり、AFMはプローブを使用してサンプルの表面トポグラフィーの画像を生成します。このプロトコルでは、このタイプの顕微鏡の使用は、支持体上に固定された細菌の形態学的および細胞損傷の特性評価のために示唆されている。 黄色ブドウ 球菌(ATCC 25923)、 大腸菌 (ATCC 25922)、および シュードモナス・フナネンシス (ニンニク球根サンプルから分離)の株を使用しました。この研究では、細菌細胞を特定の培地で増殖させました。細胞の損傷を観察するために、 黄色ブドウ 球菌と 大腸菌 を異なる濃度のナノ粒子(NP)とともにインキュベートしました。

一滴の細菌懸濁液をガラス支持体上に固定し、AFMを用いて異なるスケールで画像を撮影した。得られた画像は、細菌の形態学的特徴を示した。また、AFMを採用して、NPsの効果による細胞構造の損傷を観察することができた。 得られた画像に基づいて、接触AFMを使用して、支持体上に固定された細菌細胞の形態を特徴付けることができる。AFMは、細菌に対するNPの影響を調査するための適切なツールでもあります。電子顕微鏡と比較して、AFMは安価で使いやすい技術です。

概要

さまざまな細菌の形は、17世紀にアントニーファンレーウェンフックによって最初に注目されました¹。細菌は古来より球体から枝分かれ細胞まで多種多様な形で存在してきました²。細胞の形状は、細菌分類学者が各細菌種を記述および分類するための基本的な条件であり、主にグラム陽性門とグラム陰性門³の形態学的分離のために。細菌の細胞形態を決定するいくつかの要素が知られており、そのすべてが細胞壁および膜の構成要素として、ならびに細胞骨格において細胞カバーおよび支持体に関与している。このようにして、科学者たちは、細菌の形状を定義する遺伝子のクラスターによって定義される細菌細胞の形態を決定することに関係する化学的、生化学的、物理的メカニズムとプロセスをまだ解明しています^2,4。

さらに、科学者たちは、この細胞の形状が細胞の重要なパラメータで最適に見えるため、桿体の形状が細菌細胞の祖先の形態である可能性が高いことを示しました。したがって、球菌、らせん状、ビブリオ状、糸状、およびその他の形態は、さまざまな環境への適応と見なされます。実際、特定の形態は独立して何度も進化しており、細菌の形状が特定の環境に適応している可能性があることを示唆しています^3,5。しかし、細菌の細胞のライフサイクルを通じて、細胞の形状が変化し、これは有害な環境条件に対する遺伝的応答としても発生します³。細菌細胞の形状とサイズは、細菌の剛性、堅牢性、および表面対体積比を強く決定し、この特性はバイオテクノロジープロセスに利用できます⁶。

電子顕微鏡は、光ベースの顕微鏡を超えて到達できる高倍率のために、生物学的サンプルを研究するために使用されます。透過型電子顕微鏡(TEM)と走査型電子顕微鏡(SEM)は、この目的のために最も一般的に使用される技術です。ただし、サンプルは、適切な画像を取得するために、顕微鏡のチャンバーに入れる前にいくつかの処理が必要です。サンプルには金のカバーが必要であり、画像全体の取得に使用される時間は長すぎないようにする必要があります。対照的に、原子間力顕微鏡(AFM)は、表面の分析に広く使用されている技術ですが、生物学的サンプルの研究にも採用されています。

表面分析で使用されるAFMモードには、接触モード、非接触モードまたはタッピング、磁力顕微鏡(MFM)、導電性AFM、圧電力顕微鏡(PFM)、ピーク力タッピング(PFT)、接触共振、力量など、いくつかのタイプがあります。各モードは材料の分析に使用され、材料の表面とその機械的および物理的特性に関するさまざまな情報を提供します。しかしながら、PFTは^{液体培地7}中の細胞に関する地形的および機械的データを得ることを可能にするので、PFTのようないくつかのAFMモードはin vitroでの生物学的試料の分析に使用される。

この作業では、すべての古くてシンプルなAFMモデルに含まれる最も基本的なモードであるコンタクトモードを使用しました。AFMは、鋭利なプローブ(直径約<50 nm)を使用して、100 μm未満の領域をスキャンします。プローブは、サンプルに関連する力場と相互作用するためにサンプルに位置合わせされます。表面はプローブでスキャンされ、力を一定に保ちます。次に、カンチレバーが表面を横切って移動するときのカンチレバーの動きを監視することにより、表面の画像が生成されます。収集された情報は、接着性、弾性、粘度、せん断などの表面のナノ機械的特性を提供します。

AFM接触モードでは、カンチレバーは一定のたわみでサンプル全体をスキャンされます。これにより、サンプルの高さ(Z)を決定することができ、これは他の電子顕微鏡技術よりも優れています。AFMソフトウェアは、先端と試料表面の相互作用による3D画像スキャンの生成を可能にし、先端のたわみはレーザーと検出器を介して試料の高さと相関します。

一定の力を持つ静的モード(接触モード)では、出力は高さ(z地形)とたわみまたはエラー信号の2つの異なる画像を表示します。静的モードは、特に静的モードによって加えられる高負荷とねじり力を処理できる空気中の堅牢なサンプルにとって、貴重でシンプルなイメージングモードです。たわみまたは誤差モードは、定力モードで動作します。しかしながら、トポグラフィ画像は、表面構造に偏向信号を加えることによってさらに強調される。このモードでは、たわみはフィードバックパラメータであるため、たわみ信号はエラー信号とも呼ばれます。このチャネルに現れる特徴や形態は、フィードバックループの「エラー」によるものか、一定のたわみ設定値を維持するために必要なフィードバックループによるものです。

AFMのユニークな設計により、コンパクトになり、卓上に収まるほど小さく、原子ステップを解決するのに十分な高解像度を実現しています。AFM装置は、他の電子顕微鏡用の装置よりも低コストであり、メンテナンスコストは最小限です。顕微鏡は、クリーンルームや隔離されたスペースなどの特別な条件を備えたラボを必要としません。必要なのは振動のないデスクだけです。AFMの場合、サンプルは他の技術(金カバー、痩身)のように精巧な準備をする必要はありません。サンプルホルダーには、乾燥サンプルのみを取り付ける必要があります。

AFM接触モードを用いて、細菌の形態やNPの影響を観察しています。支持体上に固定された細菌の集団および細胞形態、ならびに細菌種上のナノ粒子によって生じる細胞損傷を観察することができる。AFMコンタクトモードで得られた画像は、AFMが強力なツールであり、試薬や複雑な手順に制限されないことを確認し、細菌の特性評価のためのシンプルで高速かつ経済的な方法になります。

プロトコル

1.細菌の分離と同定

1. ニンニク球根分裂組織からの内生株の単離:
   1. 以前に皮をむき、消毒し、カットしたニンニクの球根から2 mmの分裂組織の断片を、豊富な増殖培地としてトリプチカーゼ大豆寒天培地(TSA)に置き、25°Cで1日間インキュベートします。
   2. 細菌コロニーの形態学的違い(形状、サイズ、色、エッジ、透過光、反射光、テクスチャー、粘稠度、および色素産生)に基づいて、観察されたさまざまな形態型を記述し、各形態型の代表的なコロニーを交差ストリーキングすることによって精製します。
   3. 精製されたすべての細菌株を-80°Cの30%グリセロールで保存します。
   4. 16S rDNAのシーケンシングにより、無作為に選択した株(9AP)を同定します。ホフマンとウィンストン^8の方法に従ってDNAを抽出します。
   5. 100 ng の DNA、1 x ポリメラーゼバッファー、4 mM MgCl₂、0.4 mM dNTP、27F/1492r ユニバーサルオリゴヌクレオチド各 10 pmol、および 1 U の DNA ポリメラーゼ⁹ を用いたポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) により、16S rRNA を増幅します。次のサーマルサイクラー条件を使用します:最初の変性のために5分間95°C。続いて、脱変性温度として94°Cで1分、ハイブリダイゼーション温度として56°Cで1分、伸長温度として72°Cで1分の35サイクル;その後、最終伸長として72°Cで10分間行った。
   6. 同じオリゴヌクレオチドを用いたPCR産物のキャピラリー配列;キャピラリーシーケンシング¹⁰用のマトリックスインストールキットとともにジデオキシターミナル法を使用し、自動マルチキャピラリーシステム¹¹で電気泳動を実行します。
   7. 配列を手動で編集し、BLAST検索を使用して配列をGenBankライブラリと比較し、最も近い種^12,13と少なくとも98.7%の同一性のゴールドスタンダードで株を暫定的に特定します。
      注:株9APは、株P.フナネンシスLV(JX545210)の配列と99.86%の同一性で、シュードモナス・フナネンシスの種に属すると同定されました。

2. AFMによる形態観察のための細菌試料調製

1. 無菌条件下で、細菌懸濁液(シュードモナス・フナネンシス、 黄色ブドウ球菌) を一滴ガラススライド上に置きます。
2. 乾式加熱によりサンプルをスライドに固定します。サンプルが乾くまで、スライドを炎の上に数回静かに通します。
   注:サンプルの固定は、固定された原核生物を観察し、生細胞としての構造を可能な限りシミュレートするための微生物学における日常的な技術です。
3. 固定したサンプルをシャーレに入れ、AFM装置に持って行って観察します。
   注意: サンプルは時間の経過とともに気象条件によって変化する可能性があるため、AFM機器での分析には最大24時間を確保してください。サンプルにほこりがないようにしてください。

3. MgOナノ粒子の細菌に対する抗菌効果

注:MgO NPの合成と特性評価は以前に公開されています¹⁴。この研究では、ナノ材料の抗菌活性を、阻害のためのマクロ希釈および微量希釈法を使用して、臨床検査基準研究所(CLSI)のマニュアルに基づいて推定しました^15,16。

1. 最小阻害活性(MIC)および殺菌剤(CMB)の推定
   1. 菌株の予備増殖
      1. 適量の大腸菌または黄色ブドウ球菌を栄養価の高いブロスに接種して、最終濃度1 × 10⁸ CFU / mLにします。
      2. 懸濁液を37°C(± 2°C)で18〜24時間インキュベートします。
   2. 順応株の増殖後
      1. 滅菌細菌学的ループを懸濁液に浸し、チューブの底に触れます。
      2. エオジンとメチレンブルー寒天と栄養寒天にループでストリーキングを行います。
      3. 寒天プレートを37°C(± 2°C)で24時間インキュベートします。
   3. 標準化接種材料の調製のためのコロニーの選択
      1. 細菌学的ループでペトリ皿のコロニーの上部に触れることにより、同じ形態学的タイプのコロニーを3〜5個取ります。
      2. 選択範囲を移し、3〜5 mLのミュラーヒントンブロスに浸します。
      3. 37 °C(± 2 °C)でインキュベートして、濁度を1 × 10⁸ CFU/mLまたは2 × 10⁸ CFU/mLにします。
         注:この研究では、マクファーランド濁度基準が細菌学的懸濁液の基準として使用されました。具体的には、0.5標準は、1.5 ×^{10 8}細胞/mLの均一な大腸菌懸濁液にほぼ対応します。UV-Vis分光光度計を用いて濁度を測定した。
      4. 1 mLを取り、9 mLの滅菌ブロスに加えます。この希釈液200 μLを取り、19.8 mLの滅菌ブロスに加えて、最終濃度5 ×^{10 5} CFU / mLを得ます。
   4. MgOナノ粒子の必要濃度
      1. 溶液の調製のために超音波装置を使用する。
      2. ナノ材料を滅菌水に懸濁し、連続溶液を得るのに必要な濃度の2倍にします。
      3. これらの懸濁液をミュラーヒントンブロスを含む滅菌チューブに加えて、実験に必要な新しい濃度範囲を実現します。
         注:次のMgO NPs濃度を微量希釈に適用しました:30 ppm、60 ppm、120 ppm、250 ppm、500 ppm、1,000 ppm、2,000 ppm、3,000 ppm、4,000 ppm、および8,000 ppm。
   5. 微量希釈液¹⁵の調製
      1. 新しい滅菌済みの96ウェルマイクロタイタープレート(マイクロプレート)を準備します。マイクロプレートのカラム番号12を無菌カラムとして標識;カラム番号11を成長制御カラムとして標識した。
      2. 異なる濃度のナノ粒子懸濁液120 μLをカラムNo.1-10に加えます。
      3. 120 μL の細菌 (5 × 10⁵ CFU/mL) をカラム No.1-10 のウェルに接種します。
         注:この研究では、行Gと行Hは、CLSI標準で示唆されている濃度のセフトリアキソンを含む対照でした:8 ppm、4 ppm、2 ppm、1 ppm、0.5 ppm、0.25 ppm、0.125 ppm、0.06 ppm、および0.03 ppm。
      4. 96ウェルマイクロプレートを37°C(35°C±2°C)で24時間インキュベートします。最後に、井戸を分析します。
2. MgOナノ粒子による細菌株の形態構造変化のAFMによる観察
   1. 微量希釈試験のウェルから250 μLを取り出し、750 μLの滅菌水と混合し、2,000 × gで5°Cで2分から5分間遠心分離します。
   2. 沈殿物を毎回1 mLの滅菌水で3回洗浄し、洗浄の最後に500 μLの水を加えます。
   3. AFM画像を取得するには、各スターティングウェルの最終懸濁液を10〜20μL採取し、以前に超音波で洗浄したスライドに塗抹標本を行い(30分)、室温で1時間乾燥させます。

4. AFM測定

注:ここでは、接触モードの原子間力顕微鏡を防振ワークステーションに取り付け、顕微鏡を機械的振動源から隔離し、システムを水平に保ちました。電気的干渉は、ラインフィルタとサージ保護によって減少します。ここで使用されるAFMは、レーザービームを光検出器に自動位置合わせします。

1. コンピュータとAFMの電源を入れ、ソフトウェアツールで コンタクトモード、 contAI-Gプローブ、および 自動スロープ オプションを選択します。Zコントローラのデフォルト値は、 セットポイント = 20nM、Pゲイン = 10,000、Iゲイン = 1,000、 Dゲイン = 0、 チップ電圧 = 0 mVです。
2. 70 μmのスキャンレンジヘッドを使用して、サンプルをAFMコンタクトモードにします。バネ定数が0.13 N/mのContAI-Gシリコンカンチレバーを使用しました。
3. スキャンヘッドに組み込まれた2つのレンズに取り付けられたカメラデバイスを使用して、プローブの下の領域の表面をすばやく表示します。
4. 目的の領域を選択するために、XY平面で変位を手動で実行します。プローブは、接触条件に達するまで表面サンプルに電子的に近づくように作られています。XY方向の傾きを小さくすることで、スキャナーとサンプル表面のXY測定面を電子的に調整します。
5. ソフトウェアの標準パラメータを使用します:1行あたり 256ポイントで1秒あたり1行。
6. まず、70 μm x 70 μmの領域のフルスキャン範囲を実行します。次に、 ズームツールを使用してより小さな領域を選択します。AFMは、Z単位のチャート範囲を自動的に最適化します。
   注意: ライン/秒の時間を減らすと、合計スキャン時間が長くなり、スキャンの品質がより明確になり、測定からのノイズも除去されます。
7. サンプルから新しい領域を選択するには、カンチレバーを電子的に収縮させ、サンプルをXY平面に沿って移動します。手順 4.5 および手順 4.6 で説明されている手順を使用して、新しいスキャンを実現します。
   注:得られたスキャンは単色のバースケールで表示され、明るい色はより高い高度に関連付けられ、暗い色はより深い高度に関連付けられます。AFMソフトウェアは、測定された表面の詳細を把握できるスキャンの3Dビューを生成します。
8. フィルター選択の画像の [ツール] メニューの行ごとの レベリングを使用してデータ処理を実行します。これは、最も使用され、最も単純なレベリング方法です。
   注:このレベリング方法は、AFM画像で生成されたすべての水平または垂直線を取得し、それを多項式に適合させます。
9. 最適な画像解像度を得るために、右側のカラーバーの最大高さと最小高さを最適化します。
10. ツールバーの [ 解析 ] メニューを使用して、画像解析を実行します。目的のツールを選択したら、最初と最後のポイントを選択して、高さと距離を決定します。
    注: ユーザーは、レベリング プロセスで使用される平坦化によるヒント イメージのアーティファクトを回避するために、[ ツール ] メニューのさまざまなフィルターを試す必要があります。画像アーティファクトは縞線として表示され、一部のAFM画像に表示されます。

結果

黄色ブドウ球菌株とP. hunanensis株の形態とサイズの画像、および両方の株の集団構成を、接触モードで原子間力顕微鏡で撮影しました。黄色ブドウ球菌の画像は、その個体群が球菌の集合体を持つゾーンによって分布していることを示しました(図1A)。規模が大きくなるにつれて、球菌の個体群分布と形態に対する認識が高まりました(図1B)。顕微鏡検査の報告は、黄色ブドウ球菌の隣接する細胞に疑似半球構造が存在することを示しましたが、一般に、AFM画像で以前に示されているように、細菌は細胞分裂後に球菌の形で球状の形態を示しました。さらに、AFM接触モード画像により、球菌のサイズを決定することができ、平均幅は1.25μmでした。20個のセルの測定から得られた値を図2に示す。

P. hunanensisの場合、ガラス支持体の表面全体...

ディスカッション

顕微鏡法は、生物学的サンプルの構造、サイズ、形態、および細胞配置の調査を可能にする生物学実験室で一般的に使用される技術です。この技術を改善するために、機器の分解能を決定する光学的または電子的特性の点で互いに異なるいくつかのタイプの顕微鏡を使用することができる。

科学研究では、細菌細胞の特性評価には顕微鏡の使用が必要です。例えば、顕微鏡検査は、NaClが大腸菌株の熱抵抗と細胞形態に影響を与えること、チョウセンゴミシ抽出物が黄色ブドウ球菌に対して抗菌効果を示すこと、黄色ブドウ球菌が致死性熱ショック後に耐熱性を発達させること、および大腸菌のバイオミネラル化が白金^{23,24,25,26,27}

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
AFM EasyScan 2	NanoSurf	製造中止	測定媒体
細菌ループ	アプリケーションなし		細菌接種用機器
BigDye Terminator v3.1	ThermoFisher Scientific	4337455	Matrix インストールキット
Bioedit	非該当	バージョン 7.2.5	シーケンスアライメントエディタ
Cary 60 分光計	Agilent Technologies	適用
セフトリアゾン	メルク	適用不可	抗生物質
遠心分離機	エッペンドルフ		AFM
ContAI-G シリコンカンチレバー	BudgetSensors	ContAl-G-10	測定 媒体
エオシンとメチレンブルー 寒天	メルク	該当しない	細菌培養培地
Escherichia coli	American Type Culture Collection	ATCC 25922	細菌株
GoTaq Flexi DNA ポリメラーゼ	Promega	M8295	PCR of 16S rRNA gene
microplate	Thermo Scientific	10558295	for microdilution analysis
Müller-Hintonブロス	メルク	は適用できません	細菌培養培
栄養寒天	メルク	は適用できません	細菌培養培
栄養ブロス	メルク	は適用できません	細菌培養培地
ペトリ皿	は適用できません		細菌の増殖
Pseudomonas hunanensis 9AP	該当なし	なし	CNRGによってニンニク球根から分離
サンガーシーケンシング	Macrogen	該当なし	シーケンシングサービス
ScienceDesk Anti-Vibration workstation	ThorLabs
スライド	該当なし	細菌サンプル分析用のガラスホルダー
Staphylococcus aureus	アメリカンタイプカルチャーコレクション	ATCC 25923	細菌株
Thermalcycler	応用バイオシステムズ	Veriti-4375786	PCR増幅
トリプチカセイン大豆寒天	BD	BA-256665	成長培地
超音波処理装置	コールパーマー超音波プロセッサ、220 VAC	粒子希釈液の混合には	適用できません