Method Article

Proteomeサンプル調製のヒントとコツ

DOI:

10.3791/64830

⸱

February 3rd, 2023

1Department of Chemistry, Dalhousie University

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

議論された記事:

Kovalchuk, S. I., Ziganshin, R., Shelukhina, I. FlashPackアプローチによるシンプルな社内超高性能キャピラリーカラム製造。視覚化された実験のジャーナル。(178)、E62522(2021)。

Sirois, I., Isabelle, M., Duquette, J. D., Saab, F., Caron, E. Immunopeptidomics: 質量分析のためのマウスおよびヒトMHCクラスIおよびII関連ペプチドの単離.視覚化された実験のジャーナル。(176)、E63052(2021)。

Han, Y., Thomas, C. T., Wennersten, S. A., Lau, E., Lam, M. P. Y. オープンソースのラボロボットによって自動化されたショットガンプロテオミクスサンプル処理。視覚化された実験のジャーナル。(176)、E63092(2021)。

Nickerson, J. L. et al. 質量分析に先立って堅牢なプロテオーム精製のための有機溶媒ベースのタンパク質沈殿。視覚化された実験のジャーナル。(180)、E63503(2022)。

Li, D., Liang, J., Zhang, Y., Zhang, G.FDRコントロールベースのノンターゲットメタボロームの同定と定量の統合ワークフロー。視覚化された実験のジャーナル。土井: 10.3791/63625-V (2022)。

Petelski, A. A., Nikolai Slavov, N., Specht, N. 凍結熱溶解と等重体担体を用いた質量分析のためのシングルセルプロテオミクス調製。視覚化された実験のジャーナル。土井: 10.3791/63802 (2022).

Discussion

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最新の質量分析 (MS) は、感度、速度、多用途性の顕著な向上により、研究者にプロテオームの特性評価の機会を提供します。技術の向上に伴い、研究者は結果により高いレベルの厳格さを求めています。したがって、プロテオミクスワークフローと同様に重要なのは、MSに先立って複雑なプロテオミクス混合物を単離、分離、および処理するために考案された革新的なサンプル前処理戦略です。プロテオミクスシステムの化学的多様性により、サンプル調製に対する「画一的な」アプローチは妨げられます。ただし、このメソッドの収集からわかるように、MSデータの品質と信頼性を最大化するために複数のプロトコルが利用可能です。このコレクションは、プロテオミクスおよびメタボロミクスのワークフローの期待される結果を向上させるために設計された、実装が簡単なツールとトリックを研究者に提供することを目的としています。

キャピラリーHPLCおよびUPLCカラムは、包括的なプロテオミクスワークフローにほぼユビキタスです。自己充填キャピラリーカラムは市販のカラムに代わる低コストの代替品ですが、独自のカラムを充填しようとした人は、一貫性のない充填速度とさまざまなカラム品質に精通しているかもしれません。ロシア科学アカデミーの Kovalchuk らは、UPLC キャピラリーカラムの効率的かつ一貫した充塡を保証するFlashPack アプローチを実証します 1。正確に制御された変数の組み合わせにより、キャピラリー入口でのキューポラの形成が減少し、低圧パッキングボムを使用してカラムを迅速に充填できます。

免疫ペプチドミクスは、プロテオミクスの新たな下位分野であり、腫瘍学および免疫療法に臨床的意味を持っています。信頼性の高いMS分析には、MHCクラスI/IIまたはヒト白血球抗原(HLA)ペプチドリガンドの単離が必要です。この単離プロトコルの再現性を向上させるために、モントリオール大学のSiroisらは、回収された免疫ペプチドーム2の予想されるMS結果とともに、小規模なビーズベースのアフィニティーキャプチャーワークフローを実証しました。

プロテオミクスデータの厳密さをさらに改善し、大量のサンプルのハイスループット処理を促進するために、研究者はサンプル処理ステップを自動化するためにロボットプラットフォームにますます注目しています。低コストのロボットプラットフォームが利用可能ですが、これにはユーザーが目的の操作ステップをプログラムする必要があり、このデバイスの使用の障壁となる可能性があります。コロラド大学アンシュッツメディカルキャンパスのHanらは、シンプルなオープンソースのコーディングパッケージを考案し、Opentrons OT-2ロボットプラットフォーム3でタンパク質消化に関わる基本的なステップを実証しました。

SDSなどの界面活性剤は、MSに先立って細胞抽出とプロテオームの可溶化を促進するために一般的に使用されています。ただし、SDSの除去が不完全であるか、サンプルが失われるリスクがあります。ダルハウジー大学のNickersonらは、タンパク質沈殿のプロセスを自動化する使い捨てカートリッジを実証しました4。塩と有機溶媒の組み合わせは、タンパク質の回収率を最大化するために重要であり、最短の時間で高収率で実行できます。

メタボロミクスはプロテオーム解析の足跡をたどっており、ターゲットおよび非ターゲットワークフローで未知の代謝物を特定するために参照MSスペクトルのデータベースが増えています。プロテオミクス分析と同様に、スペクトル同定は偽陽性の一致が発生しやすいため、信頼度の低い結果をフィルタリングするには、誤発見率(FDR)の統計的報告が不可欠です。済南大学のLiと同僚は、Chi-Biotech Co.と提携して、XY-Metaプログラムに基づいてWebベースのワークフローを作成し、代謝物のターゲットデコイデータベースを生成しました5。ターゲットデータベースを生成し、目的のFDRに基づいてメタボロミクス結果をフィルタリングする手順を示します。

最後に、単一細胞プロテオーム単離のプロトコルは、ノースイースタン大学のPetelskiらによって実証されました6。Single-Cell ProtEomics (SCoPE2) プロトコルにより、研究者は同重体担体を使用してサンプル損失を減らし、1 回の実験で数百から数千のタンパク質を定量できます。このプロトコルの鍵は、細胞を溶解するための迅速な熱サイクルステップと、通常よりも大量の酵素を使用した効率的なトリプシン消化と、TMTタグによる同重体標識です。

プロテオミクスにおける数十年の経験にもかかわらず、この成熟した分野は、より困難な問題に取り組むために進化してきました。データ出力の一貫性と信頼性を高めながら、より多くのサンプルまたは少量の材料を処理できる能力は、技術革新を推進し続けています。化学操作、機器、情報学のアプローチに関連するアイデアの交換は、この分野の成長に不可欠です。ある研究者の「問題」は、課題を克服するための単純な「ヒントやコツ」ですでに解決されているかもしれません。したがって、プロテオーム解析のための非常に多くの独自の戦略が利用可能であることは前向きな兆候です。残っている課題については、誰かがすでに可能な解決策に取り組んでいる可能性があります。

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は開示するものは何もありません。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この作業は、カナダ自然科学工学研究評議会(NSERC RGPIN 05145-17)の支援を受けました。

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kovalchuk, S. I., Ziganshin, R., Shelukhina, I. Simple in-house ultra-high performance capillary column manufacturing with the FlashPack approach. Journal of Visualized Experiments. (178), e62522(2021).
  2. Sirois, I., Isabelle, M., Duquette, J. D., Saab, F., Caron, E. Immunopeptidomics: Isolation of mouse and human MHC Class I- and II-associated peptides for mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments. (176), e63052(2021).
  3. Han, Y., Thomas, C. T., Wennersten, S. A., Lau, E., Lam, M. P. Y. Shotgun proteomics sample processing automated by an open-source lab robot. Journal of Visualized Experiments. (176), e63092(2021).
  4. Nickerson, J. L., et al. Organic solvent-based protein precipitation for robust proteome purification ahead of mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (180), e63503(2022).
  5. Li, D., Liang, J., Zhang, Y., Zhang, G. An integrated workflow of identification and quantification on FDR control-based untargeted metabolome. Journal of Visualized Experiments. , e63625(2022).
  6. Petelski, A. A., Nikolai Slavov, N., Specht, N. Single-cell proteomics preparation for mass spectrometry analysis using freeze-heat lysis and an isobaric carrier. Journal of Visualized Experiments. , e63802(2022).

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