卵巣組織移植を研究するためのツールとしてのひよこ絨毛膜(CAM)モデル

サマリー

ここでは、ヒト卵巣組織のニワトリ絨毛膜(CAM)異種移植モデルを開発するためのプロトコルについて説明し、技術の有効性、移植片血行再建術の時間枠、および6日間の移植期間にわたる組織の生存率を示します。

要約

卵巣組織の凍結保存と移植は、妊孕性を維持するための効果的な戦略ですが、1つの大きな欠点があります、すなわち、異常な卵胞の活性化と死のために再移植直後に発生する大量の卵胞喪失です。げっ歯類は卵胞の活性化を調査するためのベンチマークモデルですが、コスト、時間、および倫理的考慮事項がますます法外になりつつあるため、代替法の開発が推進されています。ニワトリ絨毛膜(CAM)モデルは特に魅力的で、安価で、受精後17日目まで自然免疫不全を維持するため、ヒト卵巣組織の短期異種移植の研究に理想的です。また、CAMは高度に血管新生しており、血管新生を探索するためのモデルとして広く使用されています。これにより、 in vitro モデルよりも優れた利点が得られ、移植後の卵胞喪失プロセスの初期に影響を与えるメカニズムの調査が可能になります。本稿で概説するプロトコルは、ヒト卵巣組織のCAM異種移植モデルの開発を説明することを目的としており、技術の有効性、移植片血行再建術の時間枠、および6日間の移植期間にわたる組織生存率に関する具体的な洞察を備えています。

概要

腫瘍学的および良性の適応症、および社会的理由による妊孕性温存の需要は、ここ数十年で劇的に増加しています。しかし、悪性疾患や非悪性疾患の治療に用いられる様々な治療法は、生殖腺に対して非常に毒性が高く、医原性早期卵巣不全を引き起こし、最終的に不^{妊症につながる可能性があります}1。妊孕性温存のための確立された技術には、胚凍結保存、未熟または成熟卵母細胞のガラス化、および卵巣組織凍結保存が含まれます^2,3,4。卵巣組織の凍結は、思春期前の女児または即時のがん治療を必要とする女性の生殖能力を維持するために利用可能な唯一の選択肢です。卵巣組織移植後の内分泌機能の回復は、被験者の95%以上で発生し、出生率は18%から42%の範囲です^5,6,7,8,9。

凍結融解した卵巣組織の移植は成功しているが、まだ改善の余地がある。実際、卵巣皮質断片は血管吻合なしで移植されるため、移植片血行再建術が行われる低酸素状態の期間を経験します10,11,12。ヒトの卵巣組織移植を調査する研究の大部分は、卵巣組織を免疫不全マウスに移植する異種移植モデルを使用していました。異種移植片の完全な血行再建術には約10日かかり、宿主血管と移植血管の両方が機能血管の形成に寄与します12,13,14。卵胞予備力の約50%〜90%は、移植片血行再建術が完了する前のこの低酸素ウィンドウ中に失われます10,15,16。この大規模な卵胞の喪失は、移植後に残された卵胞の絶対数の減少によって示されるように、直接的な卵胞死と、卵胞の成長率の増加に対する卵胞の割合の変化によって示されるように、原始卵胞の成長の活性化の両方によって起こることが強く示唆されています^17,18。

興味深いことに、腹膜の典型的な移植部位を模倣した体質を持つニワトリ絨毛膜(CAM)に移植されたさまざまな動物の卵巣組織を使用した以前の研究研究では、自発的な卵胞活性化の阻害が報告されており、原始卵胞予備能は最大10日間無傷のままです^19,20,21,22.私たちのチームは以前、凍結融解したヒト卵巣組織のCAMへの移植が、最初の虚血期のヒト卵巣組織移植を調査するための信頼できるアプローチを構成することを実証し²³、最近、この移植法が卵胞の活性化を打ち消すことができることを示しました²⁴。

CAMモデルは、卵子がマウスよりもはるかに安価であるだけでなく、CAMの高度に血管新生する性質により、卵胞の活性化と卵巣移植片血行再建術との関連を精査できるため、特に魅力的です。鳥類系は、実際、血管新生を研究する最も一般的で用途の広い方法の1つです²⁵。ニワトリの胚発生(ED)は孵化まで21日かかり、CAMは尿膜と絨毛膜の融合により最初の4〜5日以内に形成されます²⁶。特に、ニワトリ胚はEDの17日目までは自然に免疫不全の宿主であるため、異種移植実験は移植片拒絶反応のリスクなしに実行できます^27,28。さらに、CAMモデルアプローチは、欧州法²⁹の観点から倫理的または法的懸念を生じさせないため、他の動物モデルに代わる魅力的な選択肢となっています。繁殖条件に関しては、ニワトリの胚は、相対湿度が40%〜60%の37°Cに設定されたインキュベーターのみを必要とします。これらの限られた実験要件は、免疫不全マウスの使用と比較して研究コストを大幅に削減します。

本明細書で提示するプロトコルは、ヒト卵巣組織のCAM異種移植モデルの開発を説明し、技術の有効性、移植片血行再建術の時間枠、および6日間の移植期間にわたる組織生存率に関する特定の洞察を提供することを目的としています。このプロトコルは、移植後の早期卵胞喪失の背後にあるメカニズムを調査し、この現象に対するいくつかの薬剤(成長因子、ホルモンなど)の影響を研究するために非常に興味深いものになる可能性があります。

プロトコル

人体組織の使用は、ルーヴァン・カトリック大学の治験審査委員会によって承認されました。患者は、研究目的で卵巣組織を使用することについて、書面によるインフォームドコンセントを与えました。

1.受胎可能性が高い0日目の卵子を注文する

1. 主に雛の年齢に依存する胚卵の割合が高いと報告している、認定されたラボグレードのローマンが選択した白いレグホーン卵のサプライヤーを見つけてください。

2.卵を孵化させる準備

1. 卵が到着する前に、卵インキュベーターを組み立てて、相対湿度37%〜40%で60°Cに平衡化します。温度計と湿度計をインキュベーターに挿入して、温度と湿度を監視します。インキュベーターの蓋にガラス窓が付いており、インキュベーターを開けなくても内部パラメータを確認できるようにしてください(図1)。
2. ローマンが選択した白いレグホーンの雛から認定された実験室グレードの卵サプライヤーから0日目の卵を受け取ったら、加湿した紙で殻の表面をきれいにし、すぐに乾燥させます。
   注:卵殻膜は多孔質であるため、汚染リスクを最小限に抑えるために、卵の表面を洗浄し、インキュベーター内の湿度を制御するためにオートクレーブ水を使用できます。
3. マーカー(日付や卵子番号など)を使用して卵にラベルを付けます。
4. 尖った端を下に向けて卵を孵化させ、回転させてCAMを発達させます。1日に2〜3回、手動で卵を180°回転させるか、自動回転器を使用します。
   注意: 卵が実際に回転していることを確認するために、卵の殻には、鉛筆またはマーカーを使用して、反対側の2つの側面に「X」と「O」のマークを付けることができます。インキュベーターの蓋にあるガラス窓により、装置を開かずに卵の回転を確認できます。

3. ED3日目に卵の殻を開ける

注:EDの3日目に卵の殻に長方形の窓が作られます。

1. 無菌状態で作業するために、層流フードを準備します。以下の器具をボンネットの下に置き、70%エタノールで消毒します(まだ滅菌されていない場合)。
   -エッグラック
   -エッグキャンドラーまたは焦点冷光源
   -マーカー
   -滅菌ストレートピン
   -滅菌済み19G針
   -5 mL滅菌シリンジ
   -スクロールソーブレード (Scroll saw blade)
   -滅菌鉗子 (Sterile forceps)
   -粘着テープ
2. 1つの卵をインキュベーターからフードの下に置かれたエッグラックに移し、エッグローテーターの電源を切ります。
3. 暗闇の中で、卵のキャンドル(または焦点の冷光源)を卵の殻に当てて、卵のエアポケットを特定します。エアポケットは卵の鈍い端に局在しています。マーカーを使用して、卵殻のエアポケットの中心を特定します。
4. ライトを点灯します。滅菌したまっすぐなピンをそっと回転させて、卵の殻に印が付けられている場所に小さな穴を開けます。通常、直径約1mmの小さな開口部で十分です。
   注意: ピンを卵に完全に押し込まないように注意してください。このような場合は、卵を捨ててください。
5. 滅菌済みの 19 G 針を滅菌済みの 5 mL シリンジに接続します。
6. 暗闇の中で、卵キャンドル(または焦点冷光源)を使用して卵黄嚢を見つけ、卵の底に向かって45°の角度で滅菌した19Gの針を使用して、手順3.4で開けた穴から卵に穴を開けます。卵黄嚢を破壊しないように細心の注意を払ってください。1.5〜2 mLの卵白を吸引してCAMをシェルから剥がし、粘着テープで穴を塞ぎます。
   注:吸引中に卵黄嚢が破壊された場合、シリンジ内の吸引液は透明(卵白)ではなく黄色になります。その場合は、針とシリンジを交換してください。比較的大量の卵黄を吸い上げると、胚の生存率が損なわれる可能性があります。
7. ライトを点灯します。卵を水平に置き、マーカーで1cm×1.5cmの長方形の窓を描きます。窓を通常の粘着テープの幅よりも大きくしないでください。
8. 卵を片手で持ち、スクロールソーの刃を使用して、前に描いた窓を卵の殻にそっとのこぎりで切ります。シェルに亀裂が入らないようにし、押し下げた CAM まで切り込まないようにします。定期的に吹き飛ばして、シェルのほこりや破片を取り除きます。
9. 鋸で挽いたシェルの長方形の部分の下に滅菌鉗子をスライドさせ、巧みにつかんでCAMを損傷することなくきれいに取り外します。さらに、白い外殻膜を捨てて、胚とそのCAMを確認できるようにします。
   注意: 卵殻のほこりや破片がCAMに落ちた場合は、CAMを引き裂かないように細心の注意を払って、滅菌鉗子を使用して取り除くことができます。
10. 生存可能な胚卵子を特定します。それらは、透明な卵白と胚の周りの血管リングによって識別でき、この段階(EDの3日目)でも心臓の鼓動が検出されることがあります。未受精または死んだ胚を廃棄します。
11. 脱水症状を防ぐために、新しく作成した窓に粘着テープを貼ります。取り外しやすいように、必ず片方の端を折りたたんでください。
12. 開いた窓を上に向けて、テープがCAMに触れないように卵をインキュベーターに戻します。折りたたんだ紙または卵ラックの一部を使用して、卵が転がるのを止めます。回転トレイがオフになっていることを確認します。
13. 手順3.2〜3.12を繰り返して、残りの卵を開きます。

4. 凍結融解したヒト卵巣組織をCAMに移植

注:CAMへの移植は、理想的にはEDの7〜10日目の間に開始する必要があります。

1. 凍結保存された卵巣皮質ストリップを、他の場所に記載されているプロトコルに従って層流フードの下で融解します³⁰。
2. 皮質ストリップを4 mm x 2 mm x 1 mmの3つの断片に切断します。1枚を非移植対照として使用し、他の2枚を1日または6日間の異種移植に使用します。
   注意: 十分な組織が利用可能な場合は、二重に作業します。
3. 1つの卵をインキュベーターからフードの下にあるエッグラックに移し、窓を上に向けてください。
4. 窓からテープをはがし、胚が生存可能であることを確認します。この段階では、生存可能な胚は、広範な血管系、透明な卵白、目に見える心拍、およびいくつかの胚の動きを特徴としています。
5. 1 cm² の滅菌エーテル抽出レンズペーパーを上皮表面に置き、すぐに取り除くことにより、CAM の小さな領域に穏やかな外傷を与えることにより、移植部位を準備します。
   注:CAMは、二重上皮層の上部皮周囲部分の除去によって膜が外傷を受け、基底層が無傷のままでない限り、侵入できないバリアです。この技術は、創傷治癒を活性化することにより、血行再建プロセスも強化します。滅菌エーテル抽出レンズペーパーがCAMに長く留まると、メンブレンがレンズペーパーに付着して破れる可能性があります。このような場合は、卵を捨ててください。
6. 凍結融解した卵巣皮質ストリップ(4 mm x 2 mm x 1 mm)をマイクロサージェリー鉗子でつかみ、髄様側をCAMに当てて外傷を負ったCAMに置きます。卵1個につき1つのティッシュ片を移植します。
7. 窓を粘着テープで覆い、卵を慎重にインキュベーターに戻します。卵の殻の開口部が直立し、卵がしっかりしていることを確認してください。
8. 残りのすべての組織を移植するために、手順4.1〜4.7を繰り返します。
   注:インプラントは、胚の生存率を評価し、血管系の変化を監視するために、移植日ごとにチェックする必要があります。

5.接ぎ木の採取

注:異種移植片は、胚の免疫系が18日目から成熟して有能になるため、遅くともEDの17日目までに収穫する必要があります。

1. 卵をラックに置き、卵殻の窓を大きくして、移植片の視覚化と操作を容易にします。
2. 移植片を肉眼的に評価し、移植片に対するCAMの血管反応に特に注意を払います。記録のためにデジタル写真またはビデオを撮ります。
3. 鉗子で組織または周囲のCAMをつかみ、ハサミまたはメスを使用してCAMから移植片を慎重に切除します。
   注:移植片は、移植の3日目頃にCAMの2番目の層で覆われ、最終的にカプセル化されます。また、6日目までに卵の中を移動した可能性があり、場合によっては回収が困難になります。
4. 切除した組織を、特定の実験に適した方法で分析します。本研究では、組織片をパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋し、以下に概説する手順に従ってヘマトキシリンとエオシンで染色しました。
   1. フラグメントを 4% パラホルムアルデヒドで 24 時間固定し、 表 1 に示す手順で自動包埋装置を使用してパラフィンに包埋します。
   2. パラフィン包埋ブロックを4°Cで一晩放置してから、ミクロトームで厚さ5μmに切断します。
   3. ホットプレート(30°C)に置いたスライドガラス上に組織切片を広げ、2時間乾燥させた後、37°Cのオーブンで24時間放置します。
   4. その後、スライドをヘマトキシリンとエオシンで染色し、他の場所で説明するプロトコルに従って³¹。その後、スライドスキャナーでサンプルをデジタル化し、画像解析ソフトで解析します。

結果

ニワトリ胚の生存率
ウィンドウ化(EDの3日目)から卵巣組織移植(EDの7日目)までの胚生存率は79%(33/42)でした。0日目の胚卵の割合は不明であるため、十分な胚卵を接ぎ木に利用できるようにするために、ローマンが選択した白いレグホーン鶏の0日目の卵を過剰に注文しました。合計23個の生存可能な7日目の卵子が移植に使用され、そのうちの1個は最初の24時間で死亡し、移植後の全胚生存率は96%(22/23)でした。

移植片の巨視的側面
移植の1日後、移植片は100%(10/10)の症例で生存可能に見え、すでに少なくとも部分的にCAMに接着しており、血管新生に必要な血管のホイールスポークパターンを示しました(図2A、B)。移植の6日後、CAMに付着しなかった2つのインプラントを除いて、すべてのインプラントは依然として接着していました(図2C)。それらは壊死...

ディスカッション

ここで説明するプロトコールの最も困難な部分は、窓を作成する前に卵白を卵殻から取り外すために卵白を吸引するために必要な小さな穴を開けることです。圧力をかけすぎると、過剰に浸透したり、卵子にひびが入って破壊したりして、CAMとその血管系に取り返しのつかない損傷を与える可能性があります。CAMを分離する最初の試みで間違いを最小限に抑えるために、まっすぐなピンを使用して、受精していない食料品で購入した卵の卵殻に小さな穴を開ける練習をすることを強くお勧めします。さらに、バッチ間での受胎能の自然な変動性、およびすべての胚が手順を生き残るわけではないという事実を考えると、卵子供給業者から過剰な卵子を入手することをお勧めします。最適な胚生存率と十分に発達したCAMを達成するためには、卵を理想的な条件で孵化させる必要があります。生存率が低い場合は、さまざまな側面が原因であり、調査が必要です。この時点では、供給者からの胚の生存率が単に低い可能性があるため、卵子供給者に連絡する必要があります。卵子の生存率が低いのは、インキュベーターの設定が不正確または不適切であることが原因である可能性もあり、CAMの発育を損なう可能性があります。独立した湿度計と温度計を使用...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アガニ皮下注射針、19G	テルモヨーロッパ	AN*1950R1	19 G 卵白吸引針
テルモシリンジ、5mL同心円ルアーロック	テルモヨーロッパ	SS*05LE1	5mL滅菌シリンジ
Caseviewer v2.2	3DHISTECH		画像解析ソフトウェア
ジエチルエーテル	メルクケミカルズ	603-022-00-4	CAMをトラウマにするための滅菌エーテル
エオシンY水溶液0.5%	メルク	1098441000	染色溶液
ムアルデヒド4%緩衝液(ホルマリン10%)	VWR	97139010	ホルムアルデヒド組織固定に使用されるホルムアルデヒド
	Liebherr	7081260	冷蔵庫4°C;パラフィン包埋に使用したC
加熱プレート	ショット	SLK2	スライドの乾燥に使用したホットプレート
インキュベーター	サーモフォーマ サイエンティフィック 3111	10365156	スライドインキュベーションに使用したオーブン
ライカ CLS 150 XE 顕微鏡冷光源	ライカ	CLS 150 XE	卵をキャンドルでつなげる焦点冷光源
レンズクリーニングティッシュ、グレード541	VWR	111-5003	CAM
Mayerのヘマトキシリン	MERCK	1092491000	染色液
メタノール	VWR	20847307	メタノール
ミクロトーム	ThermoScientific-MICROM	HM325-2	ミクロトーム
Pannoramic P250 Flash III	3DHISTECH	/	スライドスキャナー 20倍
パラホルムアルデヒド	メルク	1,04,00,51,000	パラフィン包埋溶液
パラプラスプラス R	シグマ	P3683-1KG	パラフィン
ペトリ皿、60x15 mm、滅菌	グライナー	628161	滅菌ペトリ皿
ピンホルダー	ファインサイエンスツール	26016-12	ピンホルダー
ポリハッチ	ブリンシー	CP01F	自動回転子
付き卵インキュベータースクロールソーブレード、132 mm	センシス	/	ソーブレードで卵殻に窓を作成します
ステンレス鋼インサートピン	ファインサイエンスツール	26007-02	卵殻に穴を開けるストレートピン
Steril-Helios	Angelantoni Industrie	ST-00275400000	層流フード
Superfrost Plus bords rodé90°C;	VWR	631-9483	スライドガラス
Tissue-Tek VIP 6Al	Sakura	60320417-0711 VID6E3-1	自動埋め込み装置
チタン鉗子	ファインサイエンスツール	11602-16	卵殻除去および卵巣組織操作用鉗子
トルエン、pa	VWR	28701364	パラフィン包埋ソリューション

ホル冷蔵庫倍