患者由来オルガノイド(PDO)は、 in vitroで腫瘍環境を模倣できる3次元(3D)培養です。高悪性度漿液性卵巣がんにおいて、PDOは新しいバイオマーカーと治療法を研究するためのモデルです。
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方法論記事
高悪性度漿液性卵巣癌患者由来オルガノイドの作製と培養
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
オルガノイドは、患者由来の卵巣腫瘍組織、腹水、または胸水から正常に増殖できる3D動的腫瘍モデルであり、卵巣癌の新しい治療法と予測バイオマーカーの発見に役立ちます。 これらのモデルは、クローンの不均一性、腫瘍微小環境、および細胞間および細胞-マトリックス相互作用を再現しています。さらに、それらは形態学的、細胞学的、免疫組織化学的、および遺伝的に原発腫瘍と一致することが示されています。したがって、オルガノイドは腫瘍細胞および腫瘍微小環境に関する研究を容易にし、細胞株よりも優れています。本プロトコルは、97%を超える成功率で患者の腫瘍、腹水、および胸水サンプルから患者由来の卵巣癌オルガノイドを生成するための異なる方法について説明しています。患者サンプルは、機械的消化と酵素消化の両方によって細胞懸濁液に分離されます。次に、基底膜抽出物(BME)を利用して細胞を播種し、高悪性度漿液性卵巣癌(HGSOC)の培養に特異的なサプリメントを含む最適化された増殖培地でサポートします。最初のオルガノイドを形成した後、PDOは、その後の実験のための増殖のための継代を含む、長期間の培養を維持することができる。
概要
2021年には、米国で約21,410人の女性が新たに上皮性卵巣がんと診断され、12,940人の女性がこの病気で死亡しました1。手術と化学療法は十分に進歩していますが、進行性疾患の患者の70%以上が化学療法耐性を発症し、診断から5年以内に死亡します2,3。したがって、この致命的な病気を治療するための新しい戦略と、前臨床研究のための代表的な信頼できるモデルが緊急に必要とされています。
原発性卵巣腫瘍から作製されたがん細胞株および患者由来異種移植片(PDX)は、卵巣がん研究で使用される主要な機器です。がん細胞株の主な利点は、その急速な拡大です。しかし、それらの継続的な培養は、表現型および遺伝子型の変化をもたらし、癌細胞株を元の原発癌腫瘍サンプルから逸脱させる。がん細胞株と原発腫瘍の間には既存の違いがあるため、細胞株でプラスの効果がある薬物アッセイは、臨床試験でこれらの同じ効果をもたらすことができません2。これらの制限を克服するために、PDXモデルが使用されます。これらのモデルは、免疫不全マウスに新鮮な卵巣癌組織を移植することによって作成されます。それらは in vivo モデルであるため、ヒトの生物学的特性により正確に似ており、薬物の結果をより予測します....
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プロトコル
研究のために収集されたすべてのヒト組織標本は、治験審査委員会(IRB)が承認したプロトコルに従って取得されました。以下に概説するプロトコルは、無菌ヒト組織培養環境で実施した。インフォームド書面による同意は、ヒト被験者から得られた。適格な患者は、卵巣がんの診断または推定診断を受け、インフォームドコンセントに署名する意思と能力があり、18歳以上でなければなりませんでした。腫瘍組織(悪性原発腫瘍または転移部位)、腹水、および胸水は、処置時に同意した患者から入手しました。これらの標本は直ちに実験室に輸送され、以下に概説する方法を使用してオルガノイド生成のために処理されました。
1. メディアの準備
- 完全なオルガノイド培地調製
- R-スポンジン1/ノギン馴化培地を調製し、以前に発表された第7報告書に続いて調製する。
注:R-spondin-1/Noggin馴化培地は、市販の組換えタンパク質に代わるより手頃な代替品です。レンチウイルスを介した形質導入を介してR-スポンジン-1とノギンを安定して分泌するHEK293T細胞は、セントルイスのワシントン大学医学部のロン・ボーズとニューヨーク長老派/コロンビア大学アーヴィング医療センターのアニル・ラストギからの寛大な贈り物でした8,9,10。....
- R-スポンジン1/ノギン馴化培地を調製し、以前に発表された第7報告書に続いて調製する。
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結果
PDOを生成するために、サンプルを機械的および酵素的に単一細胞懸濁液に消化しました。次に、細胞をBMEに再懸濁し、特別に操作された培地を添加しました(図3)。オルガノイドは通常、10日間の時間枠で樹立され、その後、培養中に個別のオルガノイドを示します(図4)。
図3:オルガノイドに形成された患者コレクションの概略図。患者の組織、腹水、または胸.......
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ディスカッション
卵巣癌は、診断時の進行段階、および化学療法耐性の一般的な発達のために非常に致命的です。卵巣がん研究における多くの進歩は、がん細胞株とPDXモデルを利用することによってなされてきました。ただし、より代表的で手頃な価格の in vitro モデルが明らかに必要です。PDOは、腫瘍の不均一性、腫瘍微小環境、および原発腫瘍のゲノムおよびトランスクリプトームの特徴を正確に表すことが証明されているため、薬物療法におけるオルガノイドモデルの実装など、さまざまな研究アプローチに理想的な前臨床モデルです16。
ここで説明するプロトコルは、97%の成功率で示されているように、非常に効果的で信頼性があります。現在の議定書には、慎重な注意を払うべき重要なステップがあることを強調することが重要です。まず、組織からオルガノイドを採取する場合、サンプルが完全に均質化されていることを確認することが不可欠です。これには、必要に応じて解離プログラムを複数回実行する必要があります。サンプルが均質でない場合、残りの組織片がオルガノイドの成長を損なう可能性が.......
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開示事項
著者は開示するものは何もありません。
謝辞
このプロトコルを確立する上で、ロン・ボーズ医学博士の指導とバーバラ・ブラクート医学博士の支援に感謝しています。また、セントルイスの産婦人科および婦人科腫瘍学部門のワシントン大学医学部、ワシントン大学の学部長の奨学生プログラム、および生殖科学者開発プログラムに、このプロジェクトを支援してくれたことに感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| 1% ペニシリン-ストレプトマイシン | Fisher Scientific | 30002CI | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | ジェネシー・サイエンティフィック | 14125 | |
| 10 cm ティッシュカルチャーディッシュ | TPP | 93100 | |
| 10 mL 血清ピペット | |||
| 100 & マイクロ;m Cell Filter | MidSci | 100ICS | |
| 15 mL 遠心分離チューブ | Corning | 430052 | |
| 2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
| 2% パラホルムアルデヒド固定剤 | Sigma-Aldrich | ||
| 37 °Cウォーターバス | NEST | 602052 | |
| 3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement | Millipore Sigma | SCM104 | |
| 6ウェルプレート | TPP | 92006 | |
| 70% エタノール | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
| Agar | Lamda Biotech | C121 | |
| B-27 | Life Technologies | 17504044 | |
| 遠心分離機 | |||
| カルトレックス タイプ2 | R&D Systems | 3533-010-02 | 基底膜抽出物 |
| DNase I | ニューイングランドバイオラボ | M0303S | |
| DNase I 反応バッファー | ニューイングランドバイオラボ | M0303S | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | シグマ・アルドリッチ | F2442 | |
| FGF-10 | ペプロテック | 100-26 | |
| FGF2 | ペプロテック | 100-18B | |
| ジェントルMACS C チューブ | ミルテニー・バイオテック | 130-096-334 | |
| ジェントルMACS オクト・ディスソシエーター・ヒーター付き | ミルテニー・バイオテック | 130-096-427 | メーカーのプロトコルを使用しています。 |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | ジペプチド、L-アラニル-L-グルタミン |
| ヘマトキシリンおよびエオシン染色キット | フィッシャー・サイエンティフィック | NC1470670 | |
| ヒストプラスト・パラフィン・ワックス | フィッシャー・サイエンティフィ | 22900700 | |
| マイクロ遠心分離機 | |||
| Mr. Frosty 冷凍コンテナ | Fisher Scientific | 07202363S | |
| N-アセチルシステイン | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| ニコチンアミド | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| p1000 ピペット ヒント付き | |||
| p200 ピペット ヒント付き | |||
| パスツールピペット 9インチ | フィッシャーサイエンティフィ | 1367820D | |
| PBS | フィッシャーサイエンティフィ | MT21031CM | |
| ピペットコントローラー | |||
| プロスタグランジン E2 | R&Dシステムズ | 2296 | |
| ピューロマイシン | ThermoFisher | A1113802 | |
| Recombinant Mouse Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648010 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | R&D Systems | 1254/1 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| T75 Flask | MidSci | TP90076 | |
| 組織培養フード | |||
| 組織包埋カセット | |||
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | 動物由来不使用の組換え酵素 |
| II型コラゲナーゼ | Life Technologies | 17101015 | |
| Vortex |
参考文献
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Drost, J., Clevers, H. Organ....
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