免疫蛍光アッセイ による 患者由来卵巣がんオルガノイド中のDNA損傷修復タンパク質の可視化(英語)

卵巣がんは、婦人科の悪性腫瘍による主要な死因です。患者の大多数はカルボプラチンなどのDNA損傷薬で治療されており、相同組換え修復(HRR)欠損腫瘍の患者には、ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(PARP)阻害剤を投与することができます^1,2。しかし、ほとんどの患者はこれらの治療法に対する耐性を発達させ、診断から5年以内に死亡します。DNA損傷応答(DDR)の調節不全は、卵巣癌の発症、および化学療法とPARP阻害剤耐性の両方に関連しています³。したがって、DDRの研究は、卵巣癌の病態生理学、潜在的なバイオマーカー、および新しい標的療法を理解する上で不可欠です。

DDRを評価する現在の方法は、免疫蛍光(IF)を利用しており、これにより、DNA損傷タンパク質およびヌクレオチド類似体の正確な同定および局在化が可能になる。DNAに二本鎖切断(DSB)があると、ヒストンタンパク質H2AXは急速にリン酸化され、DNA損傷修復タンパク質が集まる焦点を形成します⁴。このリン酸化は、IFを利用して容易に同定することができる。実際、ɣ-H2AXアッセイは、DSB 5,6,7,8,9の誘導を確認するために一般的に採用されています。DNA損傷の増加は、プラチナ感受性およびDNA損傷剤の有効性と関連しており¹⁰、¹¹、^12、およびɣ-H2AXは、他の癌治療における化学療法応答に関連するバイオマーカーとして提案されている¹³。DSBでは、HRRに堪能な細胞が一連のイベントを実行し、BRCA1およびBRCA2がRAD51をリクルートして複製タンパク質A(RPA)を置き換え、DNAに結合します。HRR修復は、DNAテンプレートを使用してDSBを忠実に修復します。しかし、腫瘍がHRRを欠損している場合、それらは非相同末端結合(NHEJ)などの代替修復経路に依存する。NHEJはエラーを起こしやすいことが知られており、細胞に高い突然変異負荷を生じさせ、53BP1を正の調節因子として使用する¹⁴。これらのDNA損傷タンパク質は、いずれもIFを用いて病巣として正確に同定することができる。IFは、タンパク質の染色に加えて、フォーク保護と一本鎖DNAギャップ形成の研究にも使用できます。安定したフォークを有する能力は白金応答と相関しており、そして最近、ギャップアッセイはPARP阻害剤に対する応答を予測する可能性を示している⁶、¹⁵、^16、17。したがって、ゲノムへの導入後のヌクレオチド類似体に対する染色は、DDRを研究する別の方法である。

今日まで、卵巣癌におけるDDRの評価は、in vivo腫瘍のクローン不均一性、微小環境、または構造を再現しない均質な2D細胞株に大きく限定されていました^18,19。最近の研究では、DDR^{メカニズム6}などの複雑な生物学的プロセスの研究において、オルガノイドが2D細胞株よりも優れていることが示唆されています。本手法では、PDO中のRAD51、ɣ-H2AX、53BP1、RPA、およびゲミニンを評価します。これらの方法は、インタクトなオルガノイドを評価し、in vivo腫瘍微小環境により類似した環境でのDDRメカニズムの研究を可能にします。共焦点顕微鏡および自動病巣カウントとともに、この方法論は卵巣癌のDDR経路を理解し、患者の治療計画をパーソナライズするのに役立ちます。

腫瘍組織および腹水は、セントルイスのワシントン大学治験審査委員会(IRB)によって承認された婦人科腫瘍学バイオリポジトリの一部として患者の同意を得た後に取得されました。進行期の高悪性度漿液性卵巣癌(HGSOC)の患者を組み入れた。全ての手順は、特に断らない限りベンチ上で室温で行った。すべての試薬は室温で調製し(特に指示がない限り)、4°Cで保存しました。

1. オルガノイド生成

1. 以前に発表されたレポート²⁰に従ってオルガノイドを生成します。

2. オルガノイドのめっきと照射

1. 培養にオルガノイドを使用して、ピペットチップを手動で操作することにより、オルガノイドのタブを培養皿から取り除きます。オルガノイドを15 mLのコニカルチューブに集めます。
2. コニカルチューブを1,650 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 ピペットを使用して、上清を注意深く吸引します。
3. 1,000 μLの動物由来を含まない組換え酵素をペレットに加えます( 材料表を参照)。溶液を混合し、37°Cで15分間インキュベートします。
4. 溶液を1,650 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 ピペットを使用して、上清を注意深く吸引します。
5. 遠心分離と吸引の後、ペレットを1,000 μLのリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁します。
6. 10 μLの溶液を1.5 mLの微量遠心チューブに移し、10 μLのトリパンブルーと混合します。
7. 10 μLのトリパンブルー細胞溶液を細胞計数チャンバースライドに入れ、細胞計数機に挿入します( 材料表を参照)。
8. 基底膜抽出物(BME)20 μLあたり40,000細胞を8ウェルガラスチャンバースライドにプレートします( 材料の表を参照)。これにより、オルガノイドが3〜5日間維持され、細胞がオルガノイドを形成し、適切なサイズに成長できるようになります。
9. 二本鎖DNA切断を誘導するには、メッキされたオルガノイドに10グレイ(Gy)のɣ照射を照射します(照射器の詳細については 、材料の表 を参照してください)。
   注意: これには最大5〜10分かかる場合があります。
10. 培養液中のオルガノイドを加湿インキュベーター内で37°C、5%_CO2 で4時間インキュベートします。

3. 免疫蛍光染色

注:容量とは、8ウェルチャンバースライド(~300 μL)のウェルあたりの量を指します。

1. オルガノイドの照射およびインキュベーション後、3Dマトリックスを破壊しないように注意深く、ピペットで培地を吸引します。300 μLのPBSで洗浄します。
2. オルガノイドを300 μLの2%パラホルムアルデヒド(PFA)に10分間固定します。
   注意: BMEは解重合して吸引される可能性があるため、長時間放置しないでください。
3. オルガノイドを300 μLの染色バッファーで洗浄します( 材料表を参照)。シェーカーに5分間置きます。
4. 透過処理のために、300 μLの透過処理バッファー( 材料の表を参照)を穏やかに加え、20分間インキュベートします。300 μLの染色バッファーで洗浄します。シェーカーに5分間置きます。
5. 300 μLの染色バッファーを加えて、透過処理ステップをブロックします。シェーカーに30分間置きます。ピペットを使用して染色バッファーを吸引除去します。
6. 染色バッファーで希釈した300 μLの一次抗体(ウサギ抗RAD51、マウス抗ジェミニン、ウサギ抗RPA、マウス抗ɣH2AX、ウサギ抗ジェミニン、マウス抗53BP1; 材料の表を参照)を追加します。4°Cで16時間インキュベートします。
   注:同じ宿主動物との共染色は避けてください。抗体が隣接するウェルに混ざらないように、蓋を外したままにします。
7. 一次抗体溶液を除去します。300 μLの染色バッファーでシェーカー上でそれぞれ5分間3回洗浄します。
8. 染色バッファーで希釈した二次抗体(ヤギ抗マウスAlexaフルアー488およびヤギ抗ウサギAlexaフルアー647; 材料の表を参照)溶液300 μLを加え、暗所で1時間インキュベートします。
   メモ: 以降の手順はすべて、暗闇の中で実行する必要があります。
9. 二次抗体溶液を吸引する。300 μLの希釈DAPIを加えます。シェーカーに5分間置きます。
10. 300 μLの染色バッファーでシェーカー上でそれぞれ5分間3回洗浄します。染色バッファーを除去し、チャンバースライドに含まれている除去キットを使用してチャンバーを取り外します(材料の表を参照)。
    注意: 3Dマトリックスを乱すために、前方に押しすぎないようにしてください。
11. チップを切り落としたp200ピペットチップを使用して、封入剤( 材料表を参照)を加えて、各ウェルをオルガノイドタブで覆います(例:.、各オルガノイドタブに20〜30 μL)。
12. 気泡を避けて、標本の上にカバーガラスを置きます。
13. 透明なマニキュアを取り、カバーガラスの側面にペイントしてスライドをシールします。1時間硬化させ、-20°Cに置きます。
    注:イメージング後、スライドは蛍光の損失を最小限に抑えて少なくとも6か月間保存できます。

4. イメージング

1. 共焦点顕微鏡( 材料表を参照)を使用して、液浸油を含む63倍の対物レンズで画像を取得します。
   注:核タンパク質をイメージングする場合、63倍が有利ですが、40倍も許容されます。
2. DAPIを使用して、接眼レンズを通してオルガノイドを見つけます。使用する蛍光色素に基づいて、顕微鏡に適したフィルターを選択してください。Z スタック画像をキャプチャするためのパラメーターを設定します。
   注:本研究で使用した蛍光色素は、DAPI、488、および647でした。405、488、および638レーザーをオンにして、染色を視覚化しました。
   注:推奨されるZスタックは、対物レンズの解像力によって異なります。
3. ライブ画像を調整します:フォーカス、レーザー強度などを設定します。
   注意: レーザー強度が高いほど、サンプルが光退色する可能性が高くなります。したがって、最適なレーザー強度を選択してください。
4. Z スタックを取得します。
   注意: これには最大5〜10分かかる場合があります。
5. zスタックに収集された画像から、スタックごとに少なくとも3つの画像のスクリーンショットを撮ります。
   注:定量化時に核を複製しないように、スタック全体でスクリーンショットを取得してください。
6. 各ファイルをTIFFとして保存し、分析に進みます(手順5)。

5. 分析

注:以前に公開されたレポート²¹に続くすべての画像分析にJCountProを使用してください。このソフトウェアを入手するには、関連する資料を参照してください。

1. ファイル選択タブ(プログラムの下部)のオブジェクト分析パネル(プログラムの上部)で、 TIFF ファイルを選択します。
2. [ 追加 ] をクリックして、選択したファイルを選択したファイル グループに移動します。 [ディスプレイ] を選択します。
3. [セグメンテーション]タブで、核の色として 青 を選択します。 自動セグメンテーション を選択して、核の閾値を最適化します。
   注意: 自動セグメンテーションでオブジェクトを正確に識別できない場合、ユーザーは画像の微調整と生のチューニングを調整するか、ユーザーマニュアルを参照してセグメンテーションをさらに最適化できます。
4. オブジェクトパネルで、[大きなオブジェクトを 自動分割 し、核のサイズを最適化する]を選択します。
   注: 核のサイズは通常 5,000 ピクセルですが、条件付きサイズは 1,500 ピクセルです。オブジェクトのサイズをさらに最適化するには、ユーザーマニュアルを参照してください。
5. [ オブジェクトの識別 ] を選択して、パラメーターをテストします。
   注意: これらのパラメータが正確でない場合は、サイズとチューニングを他の設定と一緒に調整できます。さらなる最適化に関する手順については、ユーザーマニュアルを参照してください。
6. 画像のパラメータを調整した後、[すべての 画像内のオブジェクトを識別] を選択して、選択したすべての画像の核を識別します。
7. 焦点分析パネル(プログラムの上部)を選択します。
8. [ファイルの選択]タブ(プログラムの下部)で、オブジェクト分析に使用された TIFF ファイルを選択し、 矢印ボタン (>>)を選択して画像を画像ファイルグループに移動します。
9. 移動したイメージ ファイルの下のディレクトリ グループで、[ 手動編集 ] フォルダーをダブルクリックし、ioc ファイルをオブジェクト コレクション ファイル グループに移動することを選択します。
   注: 選択したすべての TIFF は、IOC ファイルと一致する必要があります。
10. [選択]を押して、選択したファイル グループにファイルを移動します。プログラムの下部にある[病巣カウント]タブを選択します。
11. 以下の手順に従ってパラメータを最適化します。
    1. トップハット設定インデックス:12。
    2. フォーカスチャンネル:焦点の色を選択します(緑:ɣ-H2AX、赤:RAD51)。
    3. Hドーム設定:ドーム高さ%:30;しきい値 %: 28 および 28。
    4. 形状/サイズ設定: 最小フォーカスサイズ、ピクセル: 5 . [形状/サイズの適用] を選択します。最大フォーカスサイズ(条件付き):32。最小真円度、x100:96。最大フォーカス、ピクセル: 60.
    5. ノイズフィルター:サイズ1。
       注:核がゲミニン染色に対して陽性であるかどうかを判断する場合は、2番目のチャネルで緑色を選択し、分析で強度を選択します。
12. パラメータセットをテストするには、以下のボタンを順番に選択します: トップハット>Hドーム>病巣数。
    注意: これらのパラメータが機能しない場合は、サイズとチューニングを他の設定とともに調整できます。画像をさらに最適化する方法の詳細については、ユーザーマニュアルを参照してください。
13. 選択した画像に対してパラメータが最適化されたら、[自動カウント]を選択して、核ごとに各画像の焦点を カウント します。2番目のチャンネルが必要な場合、プログラムは使用できる強度を決定します。

提示されたプロトコルは、オルガノイド中の核DNA損傷修復タンパク質を正常に染色、視覚化、および定量することができます。この手法は、照射前と照射後の両方でPDOの染色と評価に使用されました。PDOは10Gyの放射線に被曝し、次のバイオマーカーについて評価されました:DNA損傷のマーカーであるɣ-H2AX(図1)。RAD51(図2)、HRRのマーカー。53BP1、NHEJのマーカー;RPA、複製ストレスのマーカー(図3)。ゲミニン、G2/S期細胞周期マーカー14。10Gyの用量は、卵巣癌におけるDNA損傷を研究する以前に発表された研究に基づいて選択されました6,22。JCountProソフトウェアを使用して、核を識別し、図示されているパラメータ13を使用して核内の病巣の数を定量化しました(図4)。ソフトウェアは核を識別し(図4A、B)、次に核病巣を識別し(図4C)、ジェミニン陽性細胞から病巣をフィルタリングします(図4D)。

図1:照射前後のPDOにおけるɣ-H2AX病巣。 63倍の挿入図で10倍の照射前後のPDOにおけるDAPIおよびɣ-H2AX病巣の代表的な画像。スケールバー:10 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:照射前後のPDOにおけるRAD51病巣とゲミニン。 DAPI、ゲミニン、RAD51、および63倍の挿入図で10倍で照射する前後のゲミニン/RAD51病巣PDOの共染色の代表的な画像。スケールバー:10 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:照射前後のPDOにおけるRPAと53BP1。 (A)DAPI、RPAの代表的な画像。(B)ゲミニン、53BP1、および63倍の挿入図で10倍でゲミニン/53BP1病巣の共染色。スケールバー:10 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:JCountProソフトウェアの定量化ワークフロー 。 (A)物体分析では、青いチャンネルを選択して青い物体、核を特定し、自動セグメンテーション(赤い矢印)を選択することで自動的に最適化されます。(B)自動分割では、オブジェクトのサイズ(核)が画像のサイズと倍率に適合します。[オブジェクトの識別] ボタンはパラメータをテストするために選択され (1)、すべての画像内のオブジェクトを識別 (赤い矢印) ボタンは各画像のオブジェクト (核) を識別するために選択されます。(C)焦点分析タブでは、画像が入力され、焦点カウントパラメータが設定されます:最初に、焦点の色がフォーカスチャネルの下で選択され、緑色になります。トップハットインデックスは12に設定されています。H ドーム設定は、ドームの高さの割合が 30、しきい値の割合が 28 に設定されています。焦点の形状とサイズは、60での最大フォーカスサイズピクセルと96での最小真円度x100の手動パラメータを使用して画像サイズに最適化されます。最後に、ノイズフィルタが適用されます。設定は、シルクハット、Hドーム、および焦点数(1〜3)を適用してテストされます。細胞あたりのɣ-H2AX病巣を定量化するには、スタート(赤い矢印)を押します。(D)RAD51病巣の場合、赤に変更されたフォーカスチャネルを除いて、ɣ-H2AX病巣の図のように設定が適用されます。ただし、ゲミニンで染色された核を特定するために、2番目のチャネルを緑色に選択し、分析を強度に変更します。パラメータは、シルクハット、Hドーム、および病巣数(1〜3)を適用し、開始(赤い矢印)を押してすべてのRAD51病巣を定量化し、各画像の細胞あたりの緑の強度を評価することによってテストされます。スケールバー:10μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

著者は開示するものは何もありません。