方法論記事

肺由来サンプルからの微小血管および大血管内皮細胞の単離および精製(英語)

DOI：

10.3791/64885

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2023年2月3日

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1Department of Medical, Oral and Biotechnological Sciences, “G. d’Annunzio” University of Chieti-Pescara, 2Center on Advanced Studies and Technology (CAST), “G. d’Annunzio” University of Chieti-Pescara, 3Department of Medicine and Aging Sciences, University “G. d’Annunzio” of Chieti-Pescara, 4U.O. di Chirurgia Toracica e dei Trapianti di Polmone, Fondazione IRCCS Ca’ Granda - Ospedale Maggiore Policlinico di Milano, 5Dipartimento di Fisiopatologia Medico-Chirurgica e dei Trapianti, Università degli Studi di Milano, 6Department of Pharmaceutical Sciences, Università degli Studi di Milano, 7Unit of Cell and Molecular Biology in Cardiovascular Diseases, Centro Cardiologico Monzino IRCCS

この記事について

サマリー

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挑戦的ですが、肺内皮細胞の単離は肺炎症の研究に不可欠です。本プロトコルは、大血管内皮細胞および微小血管内皮細胞の高収率、高純度単離のための手順を記載する。

要約

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健康な組織や病気の組織や臓器から分離された細胞の入手可能性は、個別化医療アプローチの重要な要素を表しています。バイオバンクは、生物医学研究のために初代細胞と不死化細胞の幅広いコレクションを提供できますが、これらはすべての実験ニーズ、特に特定の疾患や遺伝子型に関連するニーズをカバーするわけではありません。血管内皮細胞(EC)は免疫炎症反応の重要な構成要素であり、したがって、さまざまな障害の病因において中心的な役割を果たします。特に、異なる部位のECは異なる生化学的および機能的特性を示すため、信頼性の高い実験を設計するには、特定のECタイプ(すなわち、大血管、微小血管、動脈、および静脈)の利用可能性が不可欠です。ここでは、肺動脈および肺実質から高収率で事実上純粋なヒト大血管および微小血管内皮細胞を得るための簡単な手順が詳細に示されている。この方法論は、商業的供給源からの独立性を達成し、まだ利用できないEC表現型/遺伝子型を得るために、どの研究室でも比較的低コストで容易に再現することができる。

概要

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血管内皮は血管の内面を裏打ちします。血液凝固、血管緊張、および免疫炎症反応の調節に重要な役割を果たします1,2,3,4。ヒト検体から分離した内皮細胞(EC)の培養は研究目的に不可欠ですが、異なる血管(動脈、静脈、毛細血管)からのECには特定の機能があることに留意する必要があります。これらは、血管内皮の病態生理学の研究で容易に入手でき、広く使用されているヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)では完全に再現できません5,6。たとえば、ヒト肺微小血管内皮細胞(HLMVEC)は、白血球の動員と蓄積を制御することにより、肺の炎症に重要な役割を果たします4,7。したがって、肺の炎症を忠実度の高い状態で再現することを目的とした実験設定には、HLMVECを含める必要があります。一方、EC機能障害はいくつかの病状で観察できます。したがって、患者からのECは、疾患の信頼性の高いin vitroモデルを構築するための基本です。たとえば、嚢胞性線維症(CF)に冒された人々の外植肺から解剖された肺動脈(HPAEC)からのECの断片の分離により、この病気の内皮機能障害のメカニズムを明らかにすることができました8,9。

したがって、疾患状態にあるさまざまなソース/臓器からのECの分離を最適化することを目的としたプロトコルは、特にこれらのツールが市販されていない場合に、研究者に貴重な研究ツールを提供するために不可欠です。HLMVECおよびHPAEC単離プロトコルは、以前に報告されている10、11、12、13、14、15、16、17、18、19。すべての場合において、肺検体の酵素消化により混合細胞集団が得られ、アドホック選択培地および磁気ビーズまたはサイトメトリーベースの細胞選別を使用して精製されました。これらのプロトコルのさらなる最適化は、EC分離における2つの主要な問題に対処する必要があります:(1)細胞および組織の汚染、EC複製老化を最小限に抑えるために可能な限り早い培養継代で解決する必要があります20;(2)一次EC分離株の収率が低い。

この研究では、HLMVECおよびHPAECの高収率、高純度単離のための新しいプロトコルについて説明します。この手順は簡単に適用でき、数ステップで実質的に純粋な大血管および微小血管ECが得られます。

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プロトコル

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この研究は承認され、プロトコルはキエティペスカーラ大学の人間の研究倫理委員会のガイドラインに従いました(#237_2018bis)。 図 1は、気胸や葉切除術などのさまざまな理由で胸部手術を受けている非同定されたヒト被験者(書面による同意付き)からの肺実質または肺動脈のセグメント(長さ1〜3 cm)からの内皮細胞の分離を示しています。この後者の場合、外科医は肺動脈セグメントも収集した。特に、外科医は癌のないサンプルを収集するように正確に指示されました。提示されたプロトコルは、可能な限り最大の収率と純度が得られるように最適化されました。

1. 実験準備

  1. コラゲナーゼの再構成
    1. コラゲナーゼ粉末をCaCl2およびMgCl2を含まないリン酸緩衝生理食塩水(PBS−−、材料表を参照)に2 mg/mL濃度で溶解し、0.22 μmの細孔フィルターを使用して溶液をろ過します。
    2. 5 mLアリコートを調製し、-20°Cで保存します。 使用前にアリコートを解凍して37°Cに予熱してください。
  2. プレートコーティング
    1. プレートコーティングの場合は、1.5%ゼラチン溶液または50 μg/mLフィブロネクチン( 材料表を参照)を培養プレートにピペットで入れ(6ウェルプレートの各ウェルの表面を覆うには500 μLで十分です)、37°Cで1時間インキュベートします。
    2. インキュベーション後、余分なゼラチンを取り除き、ウェルをPBS−−で洗浄します。PBS--を吸引し、プレートを滅菌フードで乾燥させます。
      注:ゼラチンを再構成するには、粉末を水に溶かして1.5%溶液を作り、オートクレーブして4°Cで保存します。 1.5%のゼラチンは4°Cでは液体ではありません。したがって、プレートコーティングの前にウォームアップする必要があります。あるいは、細胞培養に適した任意の市販のゼラチン溶液をプレートコーティングに使用することができる。

2. サンプル調製

  1. 肺実質
    1. 採取したサンプルをPBS−−の入った50 mLチューブに浸して洗浄します。
    2. サンプルを滅菌ペトリ皿に移し、外科用ハサミ(最適サイズ:>2 cm)を使用してサンプルをそれぞれ約3〜4 mmの小さな断片に手動で切り刻みます。
  2. 動脈セグメント
    1. 採取したサンプルをPBS−−の入った50 mLチューブに浸して洗浄します。
    2. 断片化は動脈セグメントの断面の表面積を増加させ、したがって非ECを単離する可能性を増加させるので、それを粉砕せずに滅菌ペトリ皿に移す。

3.酵素消化

  1. さいの目に切った肺実質または肺動脈セグメントをPBSで2回洗浄します--。このステップにより、残留血液の大部分が除去されます。
  2. サンプルを15 mLチューブに入れ、5 mLの2型コラゲナーゼ( 材料の表を参照)とともに37°Cおよび5%CO2で10分間インキュベートします。このインキュベーションの間、細胞外マトリックスの分解は、単一細胞および細胞凝集体を放出する。

4.消化された細胞の回収

  1. 滅菌済みのスチール/金属ストレーナー(つまり、メッシュサイズが~1 mmの茶ストレーナー)を50 mLの収集チューブの上部に置きます。
  2. 15 mLチューブの内容物全体をストレーナーに注ぎ、消化した組織をスパチュラで優しくマッサージし、収集チューブが満たされるまでサンプルをPBS−−ですすいでください。
    注:このステップにより、ミリメートルスケールの大きな組織片が除去され、後続のろ過ステップの効率が向上します。

5.ろ過による非EC除去

  1. ステップ4.2で採取した流出液をメッシュサイズ70 μmのセルストレーナーでろ過し、新しい50 mLチューブに流出液を採取します。
  2. 次に、メッシュサイズ40μmのセルストレーナーを使用し、流出液を新しい50 mLチューブに回収します。このチューブに「チューブ1」というラベルを付けます。
    注:ステップ5.1およびステップ5.2のこれらのろ過は、混合細胞集団で構成されることが多い大きな細胞凝集体を除去します。

6. 細胞クラスターの沈降と細胞播種

  1. サンプルを30 x g で室温で5分間遠心分離し、細胞クラスターを沈降させます。
  2. 滅菌ピペット(注がないでください)を使用して上清を慎重に取り除き、新しい50 mLチューブ(「チューブ2」)に入れます。
  3. ペレットを「チューブ1」に懸濁し、チューブを最大50 mLのPBS−−で満たします。「チューブ2」を最大50 mLにPBS−−で充填します。
    注意: このステップ以降、両方のチューブは同じ方法で処理されます。
  4. サンプルを300 x g で室温で5分間遠心分離します。
  5. ペレットを2 mLの増殖培地で懸濁し( 材料の表を参照)、プレコートされた6ウェルプレートの2つの別々のウェルに懸濁液を播種します(ステップ1.2)。
    注:このステップから、ソーティング用の妥当な数の細胞を得るために、コンフルエントに達するまで(サンプルサイズに応じて約1週間)2日ごとに細胞に増殖培地を供給します。

7.細胞の拡大

  1. CaCl2およびMgCl 2を含む2 mLのPBS(PBS ++、材料表を参照)で細胞を洗浄して、残留血球を除去します(細胞の剥離を避けるためにPBS ++を使用することが重要です)。
  2. PBS++を取り出し、新鮮な培地を加えます。
  3. 細胞がコンフルエンシーに達するまで、ステップ7.1とステップ7.2を繰り返します(サンプルサイズに応じて約1週間)。

8.セルソーティング

  1. 500 μLのトリプシン-EDTA(0.05%、 材料の表を参照)を使用して細胞を剥離し、遠心分離し、ペレットを190 μLのPBS--で再懸濁します。
  2. 蛍光コンジュゲート抗ヒトCD31-FITC抗体(1:20希釈、 材料表を参照)を10 μL加え、細胞懸濁液を4°Cで30分間インキュベートします。
  3. 10 mLのPBS--を使用して細胞を洗浄し、室温で300 x g で5分間遠心分離し、ペレットを300 μLのPBS--に再懸濁します。
  4. 100 μmノズルを使用した蛍光活性化セルソーティング(FACS)によりCD31陽性(CD31+)細胞を単離・回収し、チューブに回収します。
    1. ゲーティング戦略に従って、最初に側方散乱領域パラメータSSC-AおよびFSC-Aを使用して細胞形態を定義します。次に、FSC−面積/FSC−高さまたはSSC−面積/SSC−高さドットプロットを用いて単一細胞を選択し、染色されていない対照サンプルに対してマークされたサンプル中の陽性細胞を定義し、蛍光細胞を収集チューブ21に向ける。
  5. 細胞懸濁液を室温で300 x g で5分間遠心分離し、6ウェルプレートのプレコートウェルに播種するための2 mL増殖培地にペレットを懸濁します。

9.ソート後の拡張

  1. 細胞選別の2日後に、馴化培地を新鮮な増殖培地と交換します。
  2. 細胞増殖のために、ステップ7.1とステップ7.2を2日ごとに繰り返します。

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結果

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HLMEC 分離
HLMVECの単離中の主な問題は、微細な毛細血管を間質組織から容易に分離することができないため、汚染細胞の存在である。したがって、単離プロセスの初期段階で可能な限り最高の純度を達成することは、培養継代、ひいては細胞の老化を減らすために重要です。同様に、最適な分離プロトコルは、純粋なHLMVECの可能な限り高い収率を提供する必要があります。これらの目標を達成するために、前述のプロトコル10、11、12、14、15に基づいて新しい手順が設定された。

肺実質は高度に血管新生しているため、HLMVECの優れた供給源を表していますが、主に平滑筋細胞(SMC)、コラーゲン線維、および線維芽細胞が生息しています。これ...

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ディスカッション

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ヒトの病態生理学において血管内皮細胞が果たす複数の役割により、これらの細胞は in vitro の病態学的および薬理学的研究に不可欠なツールとなっています。異なる血管部位/臓器由来のECは独特の特徴と機能を示すため、目的の臓器からの健康なECと疾患のECの利用可能性は、研究目的にとって理想的です。たとえば、HLMVECは肺の炎症に関する研究に不可欠です。したがって、これらの細胞の高収率、高純度単離のための方法論は、さまざまな研究分野に利益をもたらします。

HLMVECを単離する方法は、様々なグループによって報告されている10、11、12、14、15、17、18、<...

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開示事項

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著者らは、この研究は、潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または金銭的関係なしに実施されたと宣言しています。

謝辞

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この研究は、イタリア大学研究省(ex60%2021および2022)からR.P.への資金提供と、イタリア嚢胞性線維症財団(FFC#23/2014)およびイタリア保健省(L548/93)からM.R.への助成金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.05% トリプシン-EDTA 1XGIBCO25300-054培養プレートから細胞を剥離するために使用される
抗CD31抗体、クローンWM59DakoM0823免疫細胞化学におけるCD-31染色に使用される。使用希釈:1:50
抗vWF抗体サーモフィッシャーサイエンティフィックMA5-14029免疫細胞化学におけるフォン・ヴィレブランド因子染色に使用。作業希釈:1:100
クレーブ可能な手術用ハサミ任意の標本のチョッピングに使用
細胞ストレーナー 40 & マイクロ;mCorning4317502回目のろ過中に使用
セルストレーナー 70 & マイクロ;mCorning431751最初のろ過中に
使用するコラゲナーゼ、タイプ2ワージントンLS004177酵素消化に使用されるタイプ2コラゲナーゼ。使用濃度:2 mg / mL
結合抗CD31抗体BDバイオサイエンス555445細胞選別に使用(1:20希釈)
ダルベッコ&プライム;リン酸緩衝生理食塩水(PBS)と CaCl2およびMgCl2Sigma-AldrichD8662培地交換前の細胞洗浄に使用されます
Dulbecco′CaCl2およびMgCl2Sigma-AldrichD8537トリプシン化前の手術標本および細胞の洗浄に使用
内皮細胞増殖培地 MVPromoCellC-22020HLMVEC増殖培地
フィブロネクチンSigma-AldrichF0895プレートコーティングに使用されるヒト血漿からのフィブロネクチン。作業濃度:50 & マイクロ;g/mL
豚皮由来ゼラチン、タイプASigma-AldrichG2500プレートコーティングに使用
タイプAゼラチンSigma-Aldrichg-2500プレートコーティングに使用される豚皮由来のゼラチン。作業濃度:1.5%
オートを含まないリン酸緩衝生理食塩水(PBS)

参考文献

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