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方法論記事

ノルマザーミックEx-situ灌流異所性心臓移植のラットモデル

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DOI:

10.3791/64954

⸱

2023年4月21日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Science, Chonnam National University Graduate School, 2Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Chonnam National University Hospital and Medical School, 3Cardiovascular and Respiratory Research Team, Chonnam National University Hospital, 4Department of Internal Medicine, Chonnam National University Hospital and Medical School, 5Departments of Surgery, Chonnam National University Hospital and Medical School, 6Department of Pediatrics, Chonnam National University Children’s Hospital, and Medical School

* These authors contributed equally

この記事について

訂正のお知らせ

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サマリー

ここでは、ラットモデルにおける正常体温 exsitu 保存後の異所性移植心臓の評価プロトコルを提示します。

要約

心臓移植は末期心不全の最も効果的な治療法です。治療アプローチと介入の改善にもかかわらず、移植を待っている心不全患者の数は依然として増加しています。通常の外 場 保存技術は、従来の静的冷蔵技術に匹敵する方法として確立されています。この技術の主な利点は、ドナーの心臓を生理学的状態で最大12時間保存できることです。さらに、この技術は、循環死後のドナー心臓の蘇生を可能にし、移植後のドナー機能を改善するために必要な薬理学的介入を適用します。正常体温 のその場保存 技術を改善し、保存関連の合併症を排除するために、多数の動物モデルが確立されています。大型動物モデルは小動物モデルに比べて取り扱いが容易ですが、コストがかかり、困難です。正常体温のラットモデルを提示します その場 外ドナー心臓温存とそれに続く異所性腹部移植。このモデルは比較的安価で、1人の実験者で実現できます。

概要

心臓移植は、難治性心不全の唯一の実行可能な治療法であり続けています1,2,3,4。心臓移植を必要とする患者の数が着実に増加しているにもかかわらず、ドナー臓器の利用可能性の比例的な増加は観察されていません5。この問題に対処するために、課題を改善し、ドナーの利用可能性を高めることを目的として、ドナーの心臓を保存するための新しいアプローチが開発されました6,7,8,9。

臓器ケアシステム(OCS)マシンを使用したノルマザーミック外皮心臓灌流(NESHP)は、臨床介入として浮上しています1,3。この技術は、従来の静的冷蔵(SCS)法の適切な代替手段と見なされています2,9。NESHPは、寒冷虚血の持続時間を効果的に短縮し、代謝需要を減少させ、ドナー臓器の輸送中の最適な栄養供給および酸素化を促進する10,11。ドナー臓器保存を改善するこの方法の明らかな可能性にもかかわらず、その臨床応用とさらなる調査は高コストによって制約されてきました。したがって、NESHPの前臨床動物モデルは、この技術に関連する主要な技術的課題を特定するために重要です12、13。ブタおよびラットは、それらの虚血耐性のために前臨床試験のための好ましい動物モデルである9。ブタモデルは基礎研究やトランスレーショナル研究には理想的ですが、コストが高く、ケアとメンテナンスに必要な集中的な労力によって制限されています。対照的に、ラットモデルは安価で取り扱いが容易です14。

本研究では、NESHPの簡易ラットモデルを導入し、その後異所性心臓移植を行い、保存技術が移植後の移植片状態に与える影響を評価します。このモデルは簡単で費用対効果が高く、1人の実験者で実行できます。図 1 に、この手順の概略 図 を示します。

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プロトコル

全南大学校病院実験動物研究センター倫理委員会(承認番号。CNU IACUC - H - 2022-36)は、すべての動物実験を承認しました。この研究で使用された雄のSprague-Dawleyラット(350-450 g)は、実験動物の世話と使用に関するガイドラインに従って世話を受けました。ラットは、標準的な餌と水が利用可能で、12時間の明暗サイクルで温度管理された部屋に収容されました。

1. 事前準備

注:1人の実験者がすべての実験手順を実行できます。

  1. 手術前に、酸素発生器、ポンプ、灌流ラインを含むランゲンドルフ装置を組み立てます(図2)。灌流回路に20 mLの生理食塩水を満たし、自家血でプライミングされるまで循環させます。
    注意: このステップの目的は、体外回路を温めることです。
  2. 大動脈カニューレに取り付けられた活栓 を介して 心臓麻痺ラインを回路に取り付け、最終的な心臓麻痺注入のためにシリンジポンプを準備します。
    注意: 灌流回路と心麻痺ラインから気泡を確実に除去してください。
  3. ドナーの心臓が保管されるリザーバー内に温度センサーを配置し、回路の温度を37°Cに維持します。
  4. 外科的準備
    1. ドナーおよびレシピエントラットごとに、滅菌マイクロインスツルメントおよび材料の個別のセットを準備します。
      1. ドナー用の手術セットを準備します:外科用はさみのペア、マイクロ鉗子のペア、鋭い蚊の鉗子、5-0シルク縫合糸、綿棒、50 mLシリンジ、心臓麻痺溶液(CPS)用の灌流ライン、シリンジポンプ、18 G血管カテーテル、5 Fr.大腿骨カテーテル1セット、および滅菌ガーゼ。
      2. 受取人用の手術セットを準備します:顕微手術用はさみ、創傷開創器、一対のマイクロ鉗子、蚊の鉗子、血管用マイクロクランプ、1 mLシリンジ、1つの5-0および9-0ポリプロピレン縫合糸、5-0絹縫合糸、綿棒、および滅菌ガーゼ。

2.ドナーの心臓温存と採血

  1. 麻酔室でイソフルラン(5%)を使用してドナーラットに麻酔を誘発し、手術台に置く前にラットの体重を記録します。.
  2. ラットを手術台の仰臥位に置き、ノーズコーンを通して2%〜2.5%のイソフルランと90%の酸素を送達することによって連続麻酔を投与する。
  3. つま先のつまみに対する反応の欠如と呼吸頻度(毎分50〜60の間)をチェックして、麻酔の深さを確認します。
    注:ドナーラットへの不必要なストレスや痛みを避けるためには、適切なレベルの麻酔が重要です。
  4. 目の潤滑剤を塗布し、手術が行われる鎖骨に恥骨領域を剃ります。ヨウ素ベースのスクラブと70%アルコールで領域をきれいにします。
  5. カテーテル 検査
    1. 剣状突起から鎖骨中央まで7cmの正中線腹部切開と3cmの両側切開を行います。胸部から毛皮を取り除きます。
    2. 綿棒を使用して、腹部の臓器を腹部の左側に動員します。腹部大動脈を後腹膜筋膜および脂肪組織から隔離する。
    3. 0.3 mLの等張生理食塩水に溶解した1,000 IUのヘパリンを、1 mLのシリンジを使用して下大静脈(IVC)から注射します。綿棒でそっと圧縮して、針穴からの出血を止めます。
      注:心停止につながる可能性があるため、注射中の空気塞栓症に注意してください。
    4. 5 Fr.大腿カテーテルを腹部大動脈に挿入します(アブドA)。カテーテルの先端が大動脈弓に到達していることを確認してください。カテーテルの挿入部分のおおよその長さを評価して、カテーテルの位置を確認します。
  6. 採血
    1. Abd.Aに挿入されたカテーテル を介して 約10mLの血液を収集します。
    2. その後、プライミング血液を等張食塩水で総容量が12 mLに達するまで希釈します。0.3 mLの生理食塩水とインスリン(20 IU)に溶解した5 mgのセファゾリンを追加します。
  7. 心停止
    1. 事前に準備したCPS灌流ラインを腹部カテーテルに接続し、シリンジポンプで800 mL/hの速度でCPS投与を開始します。
    2. 横隔膜から胸腔を開き、横隔膜の近くでIVCを切断して心室の膨張を防ぎます。胸椎に沿って胸部の入口まで肋骨を両側に切断します。動員された腹側胸壁を蚊の鉗子で見越して反映します。
    3. 大動脈弓を視覚化するためにマイクロ鉗子を使用して胸腺を完全に除去します。胸腺動脈が出血した場合は、軽い圧迫を適用します。
  8. 抽出
    1. すべてのCPSを投与した後、大動脈弓を周囲の組織から分離します。左鎖骨下動脈のすぐ下を注意深く解剖します。
    2. 腕頭動脈と左総頸動脈を離れた位置で横断し、大動脈弓の長い切り株を残して、大動脈カニュレーション中の取り扱いを容易にします。主肺動脈(MPA)を分岐部にできるだけ近づけて横断します。左心房付属器を傷つけないように注意してください。
    3. 上大静脈(SVC)とIVCを5-0の絹縫合糸で慎重に結紮し、右心房(RA)と冠状動脈洞の閉塞を防ぎます。胸郭の左縁を湿ったガーゼで覆い、心臓をその上に置き、SVC結紮糸とIVC結紮糸をそっと引っ込めて門を露出させます。
    4. 肺静脈とアジゴス静脈を5-0シルク縫合糸で縫合します。結紮糸の背側の組織を切断し、心臓を抽出します。怪我がないか心臓を調べます。最後に、大動脈カニュレーションの前に心臓の重さを量ります。

3. その場 灌流

  1. 大動脈カニュレーションと灌流
    1. 大動脈カニュレーションの前に、生理食塩水プライミング回路を血液プライミングに交換します。
    2. 大動脈カニューレを大動脈弓に挿入し、一時的なマイクロクランプで固定します。カニューレの先端が腕頭接合部に配置されていることを確認します。
    3. マイクロ鉗子で大動脈をそっとつかみ、カニューレの正しい位置を確認します。
    4. 2〜3 mL / minの流速で灌流を開始し、カニュレーション部位から灌流液を漏らして気泡を取り除きます。
    5. 監視システムに接続されたセンサーを介して灌流圧力と温度を監視します。
    6. 主肺動脈(MPA)から静脈血が漏れるまで、人差し指と人差し指で心臓を優しくマッサージします。
    7. 1-0シルク結紮糸で大動脈を固定し、すべての設定(灌流回路、灌流圧力、温度)を確認した後、クランプを取り外します。
    8. 永久結紮糸が配置されたら、心臓が数秒以内に収縮し始め、60秒で通常のリズムに達することを確認します。37°Cで3〜4mLの冠状動脈流量で55〜65mmHgの平均灌流圧力は、適切な灌流を示します。
    9. リザーバーから0.15 mLの血液を採取し、灌流開始時とその後20分ごとに血液ガス分析(BGA)を確認します。灌流中のpH、pCO2、pO2、グルコース、ヘマトクリット、カリウム、および乳酸をモニターおよび記録します。120分の灌流後、3 mLのクストジオールをシリンジポンプに250 mL / hの速度で投与して心臓を逮捕します。.

4.移植

  1. 受給者の準備
    1. ex situ灌流の停止の30分前にレシピエントの準備を開始します。
    2. 手順2.2で説明したのと同じ方法を使用してレシピエント動物に麻酔をかけます。
    3. ラットを加熱パッドの仰臥位に置き、温度プローブを直腸に挿入して体温を37°Cに維持します。
    4. 目の潤滑剤を塗布し、恥骨を上腹部まで剃り、ヨウ素ベースのスクラブと70%アルコールでその領域を洗浄します。
  2. 薬
    1. 手術中に失われた水分を補うために、2 mLの温かい生理食塩水を皮下注射します。200IUのヘパリンを皮下注射する。
    2. 0.3 mLの生理食塩水に溶解した10 mg / kgのセファゾリンを皮下または筋肉内に注射することにより、抗生物質予防を投与します。.
    3. 20 mg / kgのジクロフェナクを皮下注射して疼痛コントロールを行います。.
  3. 正中線開腹術を行い、開創器を挿入して腹腔を広げます。綿棒を使用して腹部臓器をレシピエントの左側に動員し、手順のためのスペースを確保します。
  4. 腹部の臓器を温かく湿ったガーゼで包むことで脱水症を防ぎます。手術中、温かい生理食塩水を50 mLの注射器で断続的に広げます。
  5. 倍率10倍の手術用顕微鏡を使用して、綿棒による鈍的解剖によって十二指腸と近位空腸を動員し、Abd.A.とIVCを露出させます。アブドを準備します。ドナー心臓を吻合および体系的に移植するためのIVCを、 図3 または以前に文書化された方法15に従った。
    注意: アブドA.とIVCを分離しないでください。
    1. 血管吻合が赤外線に配置されることを想定し、クランプのために大動脈およびIVCの十分な部分を準備する。
    2. 綿棒または鋭い鋸歯状の鉗子を使用して鈍い準備を行い、血管の周りの脂肪と筋膜を取り除きます。
    3. 腸間膜の枝と主要な血管の頭蓋側と尾側の両方に5-0の絹の結紮糸を配置します。腹部血管を持ち上げ、5〜0本の絹縫合糸で腰椎枝を凝固または結紮します。精巣動脈と静脈を惜しまないことを忘れないでください、そしてそれらを固定しないでください。
    4. 結紮糸を使用して血管を持ち上げ、マイクロクランプを主要血管の腸間膜枝、尾側、頭蓋側に配置して、吻合部位の血流を停止します。クランプを配置する前に、過度の加熱は四肢虚血を悪化させる可能性があるため、加熱パッドのスイッチを切ってください。低体温症を避けるために、容器のクランプを解除した後は、必ず加熱パッドのスイッチを入れてください。
    5. 27 Gの針を使用して大動脈を穿刺し、マイクロハサミで切開部をドナーの上行大動脈の開口部と同じかそれよりわずかに大きい長さまで伸ばします(Asc。A)、これは約5mmである。
    6. 大動脈切開と同じ方法でIVCを縦切開しますが、大動脈切開と比較して尾側に3 mm近づけます。
    7. 吻合を開始し、ドナーの心臓をレシピエントの腹部の右側に配置し、ドナーAscを取り付けます。Aを受信者のアブドに。縦切開の頭蓋角に1つの単純な断続ステッチ(9-0ポリプロピレン)を有するA。
    8. 心臓をレシピエント腹部の左側に移動し、ドナーのAscの吻合を行います。Aと受信者のAbd。Aはランニング9-0ポリプロピレン縫合糸を用いた。
    9. 縦切開の尾側と頭蓋の角に2つの中断された縫合糸(9-0ポリプロピレン)を使用して、ドナー肺動脈をIVCに固定します。
    10. 血管の管腔内側から静脈吻合の前半を行い、血管の管腔外側から後半を完了する。結び目を締める前に、空気塞栓症を防ぐためにフィールドを生理食塩水で洗い流してください。
  6. デエアリングとデクランプ
    1. 吻合が完了したら、最初に腸間膜静脈クランプを取り外して、心臓の右側を静脈血で満たすようにします。
    2. 冠状動脈回路とAscの空気を取り除きます。A.逆行性冠状動脈灌流を数秒間適用することによって。
    3. 血管の両側にガーゼを置き、尾側クランプと頭蓋クランプを取り外します。
    4. 綿棒で1〜2分間穏やかに圧縮します。十分な止血を確保した後、綿棒を取り除き、温かい生理食塩水で吻合部を洗います。
      注意: 心臓は再灌流の最初の分以内に鼓動を開始する必要があります。レシピエントラットの体温が35°C未満の場合、体温が36°Cに達した後に心臓のリズムが正常化します。
  7. 蛇行したように腹部臓器を交換し、連続した5-0ポリプロピレン縫合糸を使用して腹部切開の層を閉じます。
  8. 手術後、体温が37°Cに達するまで、麻酔をかけた動物を加熱パッドの上の清潔な場所に置きます。
    注意: 体温が37°Cに達するまで術後検査を開始しないでください。 実験が終了するまで麻酔を2〜2.5%イソフルランに維持する。
  9. 移植されたドナー心臓のECGを3時間監視します。次に、組織学的研究のために深麻酔下で心臓を切除します。
    注意: 心臓を切除する前に、ペダル反射の欠如を介して麻酔の深さを確認してください。外科的処置とECGモニタリングは6時間未満かかります。周術期に投与されるジクロフェナク(ステップ4.2.3)は、この手順の全期間にわたって疼痛管理を可能にします。鎮痛レジメンは、施設の動物使用ガイドラインに従って調整できます。

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結果

図1 は、小動物モデルで使用された実験計画を示す。 図2 は、小動物用酸素供給装置を含む改良型ランゲンドルフ灌流装置を示す。異所性腹部移植の吻合順序を 図3に示す。

図4は、乳酸、カリウム、平均大動脈圧など、ex situ灌流中の心臓の生存率を評価するために使用されるパラメーターを示しています。本研究では,正常温熱時外保存術により,6例の虚血時間の合計が46.2 ± 4.7分に減少し,体外離脱時間の合計は166.2 ± 4.7分であった(図5)。図5に示すように、ドナーからの心臓の摘出、およびex situ灌流および異所性移植の準備には、5.8±1.3分かかりました。手術の成...

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ディスカッション

このモデルを確立する際の私たちの焦点は、正常体温のヒト心臓移植を再現することでした。非駆出モデルは、ドナー心臓を ex situ 環境に保存するための一般的に好ましい技術である16。駆出モデルは、 ex situ 灌流中の心機能を評価する上で多くの利点を提供しますが17、異所性移植モデルには適していません。異所性移植では、移植されたドナーの心臓は、レシピエントの循環器系で宿主の心臓によって生成される収縮期後負荷圧を克服する必要があり、ドナーの心臓のパフォーマンスが制限され、評価で過小評価されます18。したがって、非駆出モデルは異所性移植においてより有利である。非駆出モデルでは、ドナーの心臓は灌流されますが、レシピエントの循環をサポートしないため、心臓の性能評価が大幅に制限されます。組織学的染色やブロッティング解析などの形態学的および分子的評価は、機能評価が限られている場合にドナーの心臓の状態を調べるのに役立ちます。さらに、代謝マーカーは、陽電子放出断層撮影(P...

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開示事項

著者には利益相反はありません。

謝辞

この研究は、全南大学校病院生物医学研究所からの助成金B2021-0991と韓国国立研究財団からのNRF-2020R1F1A1073921によって支援されました

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
AESアクティブ避難システムスミス医療PC-6769-51ACO2と過剰なイソフルラン
麻酔器スミス医療PC-8801-01Aイソフルランとオキシエグンを混合し、動物B20患者モニターに配信
GE医療システムB20、平均大動脈圧と温度を観察するために
ホメオサーミックモニタリングシステムハーバード装置55-7020動物の体温をモニターし、維持するには
Micro-1 ラットの酸素供給器東莞Keweiの医療機器Micro-MOランゲンドルフ回路のガス交換のため
マイクロパンクイントロデューサーセットCOOK医療G48007腹部大動脈を通じてアーチに心筋麻痺の解決策を送達するための
顕微鏡AmscopeMU1403ズーム手術用フィールド (レシピエント)
外科用ルーペSurgiTelL2S09手術野のズーム用 (ドナー)
シリンジポンプAMP allSP-8800心筋麻痺のソリューションを提供するために
Transonic フローセンサーTransonicME3PXL-M5灌流回路フローセンサー
Transonic チューブフローモジュールTransonicTS410フローアクワイアリングシステム
Watson - マーローポンプド装置010.6131.DAO蠕動ポンプ再循環灌流に使用されます
WBC-1510AJEIO TECH加熱バス
Sprague-DawleyラットSamtakoBio Korea Co.、Ltd.、烏山市
韓国Medications
BioHAnceジェル点眼薬SENTRIXアニマルケア目のための湿った軟膏
セファゾリンJW製薬プロフィラキシー用
CustodiolDR、フランツ・コーラー CHEMIE GMBH心臓収穫用
ジクロフェナクMyungmoon Pharm. Co. Ltd疼痛管理のために
ヘパリンJW医薬品抗凝固剤
インスリンJW製薬ホルモン療法
生理食塩水JW医薬品水分補給療法用
を利用する します はハーバー E03056D

参考文献

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再版と許可

訂正


Formal Correction: Erratum: Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation
Posted by JoVE Editors on 8/28/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation. The Protocol section was updated.

Section 4 of the Protocol was updated from:

4. Implantation

  1. Preparation of recipient
    1. Begin the recipient preparation 30 min before the cessation of ex situ perfusion.
    2. Anesthetize the recipient animal using the same method as mentioned in step 2.2.
    3. Place the rat in a supine position on the heating pad and insert the temperature probe into the rectum to maintain the body temperature at 37 °C.
    4. Apply eye lubricant, shave the pubic to the epigastric area, and cleanse the area with an iodine-based scrub and 70% alcohol.
  2. Medications
    1. Inject 2 mL of warm saline subcutaneously to compensate for the fluid lost during the surgery. Inject 200 IU of heparin subcutaneously.
    2. Administer antibiotic prophylaxis by injecting 10 mg/kg cefazolin dissolved in 0.3 mL of saline subcutaneously or intramuscularly.
    3. Administer pain control by injecting 20 mg/kg of diclofenac subcutaneously.
  3. Perform the mid-line laparotomy and insert a retractor to widen the abdominal cavity. Mobilize the abdominal organs to the left side of the recipient using cotton swabs to make space for the procedure.
  4. Prevent dehydration by wrapping the abdominal organs with warm and wet gauze. Intermittingly spread warm saline with a 50 mL syringe during the surgery.
  5. Utilizing a surgical microscope with a 10x magnification, mobilize the duodenum and proximal jejunum by blunt dissection with cotton swabs to expose the Abd. A. and IVC. Prepare the Abd. A and IVC for anastomosis and systematically implant the donor heart, in accordance with Figure 3 or previously documented methods15.
    NOTE: Do not separate the Abd. A. and IVC.
    1. Assuming vascular anastomosis to be placed infrarenal, prepare a sufficient portion of the aorta and IVC for clamping.
    2. Perform blunt preparation using cotton swabs or sharp-serrated forceps to remove the fats and fascia around the vessels.
    3. Place 5-0 silk ligatures to the mesenteric branches and both the cranial and caudal sides of the major vessels. Elevate the abdominal vessels and coagulate or ligate the lumbar branches with 5-0 silk sutures. Remember to spare the testicular arteries and veins and do not clamp them.
    4. Use ligatures to lift the vessels and position the micro-clamps to the mesenteric branches, caudal, and cranial sides of the major vessels to stop the blood flow at the anastomosis site. Be sure to switch off the heating pad before placing the clamps, as excess heating can exacerbate limb ischemia.
    5. Puncture the aorta using a 27 G needle and elongate the incision with micro scissors to a length equal to or slightly larger than the opening of the donor ascending aorta (Asc. A), which is approximately 5 mm.
    6. Make a longitudinal incision on the IVC in the same way as the aortotomy, but make it 3 mm closer to the caudal side compared to the aorta incision.
    7. Starting the anastomoses, placed the donor heart on the right side of the recipient's abdomen and attach the donor Asc. A to the recipient's Abd. A with one simple interrupted stitch (9-0 polypropylene) at the cranial corner of the longitudinal incision.
    8. Move the heart to the left side of the recipient abdomen and perform anastomosis of the donor's Asc. A with the recipient's Abd. A using a running 9-0 polypropylene suture.
    9. Fixate the donor pulmonary artery to the IVC with two interrupted sutures (9-0 polypropylene) at the caudal and cranial corners of the longitudinal incision.
    10. Perform the first half of the venous anastomosis from the intraluminal side of the vessel and complete the second half from the extraluminal side of the vessel. Before tightening the knots, flush the field with saline to prevent air embolism.
  6. De-airing and de-clamping
    1. Remove the mesenteric vein clamp first after completing the anastomosis to allow the right side of the heart to fill with venous blood.
    2. Remove the air in the coronary circuit and Asc. A. by applying retrograde coronary perfusion for several seconds.
    3. Place a piece of gauze on both sides of the vessels and remove the caudal clamp and the cranial clamp.
    4. Apply gentle compression with cotton swabs for 1-2 min. After ensuring adequate hemostasis, remove the swabs and wash the anastomoses with warm saline.
      NOTE: The heart should begin beating within the first minute of reperfusion. If the recipient rat's body temperature is below 35 °C, the heart rhythm will normalize after the temperature reaches 36 °C.
  7. Replace the abdominal organs in a meander-like manner and close the layers of the abdominal incision using continuous 5-0 polypropylene sutures.

to:

4. Implantation

  1. Preparation of recipient
    1. Begin the recipient preparation 30 min before the cessation of ex situ perfusion.
    2. Anesthetize the recipient animal using the same method as mentioned in step 2.2.
    3. Place the rat in a supine position on the heating pad and insert the temperature probe into the rectum to maintain the body temperature at 37 °C.
    4. Apply eye lubricant, shave the pubic to the epigastric area, and cleanse the area with an iodine-based scrub and 70% alcohol.
  2. Medications
    1. Inject 2 mL of warm saline subcutaneously to compensate for the fluid lost during the surgery. Inject 200 IU of heparin subcutaneously.
    2. Administer antibiotic prophylaxis by injecting 10 mg/kg cefazolin dissolved in 0.3 mL of saline subcutaneously or intramuscularly.
    3. Administer pain control by injecting 20 mg/kg of diclofenac subcutaneously.
  3. Perform the mid-line laparotomy and insert a retractor to widen the abdominal cavity. Mobilize the abdominal organs to the left side of the recipient using cotton swabs to make space for the procedure.
  4. Prevent dehydration by wrapping the abdominal organs with warm and wet gauze. Intermittingly spread warm saline with a 50 mL syringe during the surgery.
  5. Utilizing a surgical microscope with a 10x magnification, mobilize the duodenum and proximal jejunum by blunt dissection with cotton swabs to expose the Abd. A. and IVC. Prepare the Abd. A and IVC for anastomosis and systematically implant the donor heart, in accordance with Figure 3 or previously documented methods15.
    NOTE: Do not separate the Abd. A. and IVC.
    1. Assuming vascular anastomosis to be placed infrarenal, prepare a sufficient portion of the aorta and IVC for clamping.
    2. Perform blunt preparation using cotton swabs or sharp-serrated forceps to remove the fats and fascia around the vessels.
    3. Place 5-0 silk ligatures to the mesenteric branches and both the cranial and caudal sides of the major vessels. Elevate the abdominal vessels and coagulate or ligate the lumbar branches with 5-0 silk sutures. Remember to spare the testicular arteries and veins and do not clamp them.
    4. Use ligatures to lift the vessels and position the micro-clamps to the mesenteric branches, caudal, and cranial sides of the major vessels to stop the blood flow at the anastomosis site. Switch off the heating pad before placing the clamps, as excess heating can exacerbate limb ischemia. Ensure to switch on the heating pad after de-clamping the vessels to avoid hypothermia.
    5. Puncture the aorta using a 27 G needle and elongate the incision with micro scissors to a length equal to or slightly larger than the opening of the donor ascending aorta (Asc. A), which is approximately 5 mm.
    6. Make a longitudinal incision on the IVC in the same way as the aortotomy, but make it 3 mm closer to the caudal side compared to the aorta incision.
    7. Starting the anastomoses, placed the donor heart on the right side of the recipient's abdomen and attach the donor Asc. A to the recipient's Abd. A with one simple interrupted stitch (9-0 polypropylene) at the cranial corner of the longitudinal incision.
    8. Move the heart to the left side of the recipient abdomen and perform anastomosis of the donor's Asc. A with the recipient's Abd. A using a running 9-0 polypropylene suture.
    9. Fixate the donor pulmonary artery to the IVC with two interrupted sutures (9-0 polypropylene) at the caudal and cranial corners of the longitudinal incision.
    10. Perform the first half of the venous anastomosis from the intraluminal side of the vessel and complete the second half from the extraluminal side of the vessel. Before tightening the knots, flush the field with saline to prevent air embolism.
  6. De-airing and de-clamping
    1. Remove the mesenteric vein clamp first after completing the anastomosis to allow the right side of the heart to fill with venous blood.
    2. Remove the air in the coronary circuit and Asc. A. by applying retrograde coronary perfusion for several seconds.
    3. Place a piece of gauze on both sides of the vessels and remove the caudal clamp and the cranial clamp.
    4. Apply gentle compression with cotton swabs for 1-2 min. After ensuring adequate hemostasis, remove the swabs and wash the anastomoses with warm saline.
      NOTE: The heart should begin beating within the first minute of reperfusion. If the recipient rat's body temperature is below 35 °C, the heart rhythm will normalize after the temperature reaches 36 °C.
  7. Replace the abdominal organs in a meander-like manner and close the layers of the abdominal incision using continuous 5-0 polypropylene sutures.
  8. After the surgery, place the anesthetized animal on a clean area over a heating pad until the body temperature reaches 37°C. 
    NOTE: Do not initiate the postoperative examinations till the body temperature reaches 37°C. Maintain anesthesia at 2-2.5% isoflurane until the end of the experiments.
  9. Monitor ECG of the transplanted donor heart for 3 h. Then, excise the heart under deep anesthesia for histological studies.
    NOTE: Confirm anesthesia depth via lack of pedal reflex before excising the heart. The surgical procedure and the ECG monitoring take less than 6 h. Diclofenac, administered perioperatively (step 4.2.3.), enables pain management for the entire duration of this procedure. The analgesia regimen can be adjusted per the institutional animal use guidelines.

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