ノルマザーミックEx-situ灌流異所性心臓移植のラットモデル

心臓移植は、難治性心不全の唯一の実行可能な治療法であり続けています^1,2,3,4。心臓移植を必要とする患者の数が着実に増加しているにもかかわらず、ドナー臓器の利用可能性の比例的な増加は観察されていません⁵。この問題に対処するために、課題を改善し、ドナーの利用可能性を高めることを目的として、ドナーの心臓を保存するための新しいアプローチが開発されました^6,7,8,9。

臓器ケアシステム(OCS)マシンを使用したノルマザーミック外皮心臓灌流(NESHP)は、臨床介入として浮上しています^1,3。この技術は、従来の静的冷蔵(SCS)法の適切な代替手段と見なされています^2,9。NESHPは、寒冷虚血の持続時間を効果的に短縮し、代謝需要を減少させ、ドナー臓器の輸送中の最適な栄養供給および酸素化を促進する^10,11。ドナー臓器保存を改善するこの方法の明らかな可能性にもかかわらず、その臨床応用とさらなる調査は高コストによって制約されてきました。したがって、NESHPの前臨床動物モデルは、この技術に関連する主要な技術的課題を特定するために重要です^12、13。ブタおよびラットは、それらの虚血耐性のために前臨床試験のための好ましい動物モデルである⁹。ブタモデルは基礎研究やトランスレーショナル研究には理想的ですが、コストが高く、ケアとメンテナンスに必要な集中的な労力によって制限されています。対照的に、ラットモデルは安価で取り扱いが容易です¹⁴。

本研究では、NESHPの簡易ラットモデルを導入し、その後異所性心臓移植を行い、保存技術が移植後の移植片状態に与える影響を評価します。このモデルは簡単で費用対効果が高く、1人の実験者で実行できます。図 1 に、この手順の概略 図 を示します。

全南大学校病院実験動物研究センター倫理委員会(承認番号。CNU IACUC - H - 2022-36)は、すべての動物実験を承認しました。この研究で使用された雄のSprague-Dawleyラット(350-450 g)は、実験動物の世話と使用に関するガイドラインに従って世話を受けました。ラットは、標準的な餌と水が利用可能で、12時間の明暗サイクルで温度管理された部屋に収容されました。

1. 事前準備

注:1人の実験者がすべての実験手順を実行できます。

1. 手術前に、酸素発生器、ポンプ、灌流ラインを含むランゲンドルフ装置を組み立てます(図2)。灌流回路に20 mLの生理食塩水を満たし、自家血でプライミングされるまで循環させます。
   注意: このステップの目的は、体外回路を温めることです。
2. 大動脈カニューレに取り付けられた活栓 を介して 心臓麻痺ラインを回路に取り付け、最終的な心臓麻痺注入のためにシリンジポンプを準備します。
   注意: 灌流回路と心麻痺ラインから気泡を確実に除去してください。
3. ドナーの心臓が保管されるリザーバー内に温度センサーを配置し、回路の温度を37°Cに維持します。
4. 外科的準備
   1. ドナーおよびレシピエントラットごとに、滅菌マイクロインスツルメントおよび材料の個別のセットを準備します。
      1. ドナー用の手術セットを準備します:外科用はさみのペア、マイクロ鉗子のペア、鋭い蚊の鉗子、5-0シルク縫合糸、綿棒、50 mLシリンジ、心臓麻痺溶液(CPS)用の灌流ライン、シリンジポンプ、18 G血管カテーテル、5 Fr.大腿骨カテーテル1セット、および滅菌ガーゼ。
      2. 受取人用の手術セットを準備します:顕微手術用はさみ、創傷開創器、一対のマイクロ鉗子、蚊の鉗子、血管用マイクロクランプ、1 mLシリンジ、1つの5-0および9-0ポリプロピレン縫合糸、5-0絹縫合糸、綿棒、および滅菌ガーゼ。

2.ドナーの心臓温存と採血

1. 麻酔室でイソフルラン(5%)を使用してドナーラットに麻酔を誘発し、手術台に置く前にラットの体重を記録します。.
2. ラットを手術台の仰臥位に置き、ノーズコーンを通して2%〜2.5%のイソフルランと90%の酸素を送達することによって連続麻酔を投与する。
3. つま先のつまみに対する反応の欠如と呼吸頻度(毎分50〜60の間)をチェックして、麻酔の深さを確認します。
   注:ドナーラットへの不必要なストレスや痛みを避けるためには、適切なレベルの麻酔が重要です。
4. 目の潤滑剤を塗布し、手術が行われる鎖骨に恥骨領域を剃ります。ヨウ素ベースのスクラブと70%アルコールで領域をきれいにします。
5. カテーテル 検査
   1. 剣状突起から鎖骨中央まで7cmの正中線腹部切開と3cmの両側切開を行います。胸部から毛皮を取り除きます。
   2. 綿棒を使用して、腹部の臓器を腹部の左側に動員します。腹部大動脈を後腹膜筋膜および脂肪組織から隔離する。
   3. 0.3 mLの等張生理食塩水に溶解した1,000 IUのヘパリンを、1 mLのシリンジを使用して下大静脈(IVC)から注射します。綿棒でそっと圧縮して、針穴からの出血を止めます。
      注:心停止につながる可能性があるため、注射中の空気塞栓症に注意してください。
   4. 5 Fr.大腿カテーテルを腹部大動脈に挿入します(アブドA)。カテーテルの先端が大動脈弓に到達していることを確認してください。カテーテルの挿入部分のおおよその長さを評価して、カテーテルの位置を確認します。
6. 採血
   1. Abd.Aに挿入されたカテーテル を介して 約10mLの血液を収集します。
   2. その後、プライミング血液を等張食塩水で総容量が12 mLに達するまで希釈します。0.3 mLの生理食塩水とインスリン(20 IU)に溶解した5 mgのセファゾリンを追加します。
7. 心停止
   1. 事前に準備したCPS灌流ラインを腹部カテーテルに接続し、シリンジポンプで800 mL/hの速度でCPS投与を開始します。
   2. 横隔膜から胸腔を開き、横隔膜の近くでIVCを切断して心室の膨張を防ぎます。胸椎に沿って胸部の入口まで肋骨を両側に切断します。動員された腹側胸壁を蚊の鉗子で見越して反映します。
   3. 大動脈弓を視覚化するためにマイクロ鉗子を使用して胸腺を完全に除去します。胸腺動脈が出血した場合は、軽い圧迫を適用します。
8. 抽出
   1. すべてのCPSを投与した後、大動脈弓を周囲の組織から分離します。左鎖骨下動脈のすぐ下を注意深く解剖します。
   2. 腕頭動脈と左総頸動脈を離れた位置で横断し、大動脈弓の長い切り株を残して、大動脈カニュレーション中の取り扱いを容易にします。主肺動脈(MPA)を分岐部にできるだけ近づけて横断します。左心房付属器を傷つけないように注意してください。
   3. 上大静脈(SVC)とIVCを5-0の絹縫合糸で慎重に結紮し、右心房(RA)と冠状動脈洞の閉塞を防ぎます。胸郭の左縁を湿ったガーゼで覆い、心臓をその上に置き、SVC結紮糸とIVC結紮糸をそっと引っ込めて門を露出させます。
   4. 肺静脈とアジゴス静脈を5-0シルク縫合糸で縫合します。結紮糸の背側の組織を切断し、心臓を抽出します。怪我がないか心臓を調べます。最後に、大動脈カニュレーションの前に心臓の重さを量ります。

3. その場 灌流

1. 大動脈カニュレーションと灌流
   1. 大動脈カニュレーションの前に、生理食塩水プライミング回路を血液プライミングに交換します。
   2. 大動脈カニューレを大動脈弓に挿入し、一時的なマイクロクランプで固定します。カニューレの先端が腕頭接合部に配置されていることを確認します。
   3. マイクロ鉗子で大動脈をそっとつかみ、カニューレの正しい位置を確認します。
   4. 2〜3 mL / minの流速で灌流を開始し、カニュレーション部位から灌流液を漏らして気泡を取り除きます。
   5. 監視システムに接続されたセンサーを介して灌流圧力と温度を監視します。
   6. 主肺動脈(MPA)から静脈血が漏れるまで、人差し指と人差し指で心臓を優しくマッサージします。
   7. 1-0シルク結紮糸で大動脈を固定し、すべての設定(灌流回路、灌流圧力、温度)を確認した後、クランプを取り外します。
   8. 永久結紮糸が配置されたら、心臓が数秒以内に収縮し始め、60秒で通常のリズムに達することを確認します。37°Cで3〜4mLの冠状動脈流量で55〜65mmHgの平均灌流圧力は、適切な灌流を示します。
   9. リザーバーから0.15 mLの血液を採取し、灌流開始時とその後20分ごとに血液ガス分析(BGA)を確認します。灌流中のpH、pCO2、_pO2、グルコース、ヘマトクリット、カリウム、および乳酸をモニターおよび記録します。120分の灌流後、3 mLのクストジオールをシリンジポンプに250 mL / hの速度で投与して心臓を逮捕します。.

4.移植

1. 受給者の準備
   1. ex situ灌流の停止の30分前にレシピエントの準備を開始します。
   2. 手順2.2で説明したのと同じ方法を使用してレシピエント動物に麻酔をかけます。
   3. ラットを加熱パッドの仰臥位に置き、温度プローブを直腸に挿入して体温を37°Cに維持します。
   4. 目の潤滑剤を塗布し、恥骨を上腹部まで剃り、ヨウ素ベースのスクラブと70%アルコールでその領域を洗浄します。
2. 薬
   1. 手術中に失われた水分を補うために、2 mLの温かい生理食塩水を皮下注射します。200IUのヘパリンを皮下注射する。
   2. 0.3 mLの生理食塩水に溶解した10 mg / kgのセファゾリンを皮下または筋肉内に注射することにより、抗生物質予防を投与します。.
   3. 20 mg / kgのジクロフェナクを皮下注射して疼痛コントロールを行います。.
3. 正中線開腹術を行い、開創器を挿入して腹腔を広げます。綿棒を使用して腹部臓器をレシピエントの左側に動員し、手順のためのスペースを確保します。
4. 腹部の臓器を温かく湿ったガーゼで包むことで脱水症を防ぎます。手術中、温かい生理食塩水を50 mLの注射器で断続的に広げます。
5. 倍率10倍の手術用顕微鏡を使用して、綿棒による鈍的解剖によって十二指腸と近位空腸を動員し、Abd.A.とIVCを露出させます。アブドを準備します。ドナー心臓を吻合および体系的に移植するためのIVCを、 図3 または以前に文書化された方法¹⁵に従った。
   注意: アブドA.とIVCを分離しないでください。
   1. 血管吻合が赤外線に配置されることを想定し、クランプのために大動脈およびIVCの十分な部分を準備する。
   2. 綿棒または鋭い鋸歯状の鉗子を使用して鈍い準備を行い、血管の周りの脂肪と筋膜を取り除きます。
   3. 腸間膜の枝と主要な血管の頭蓋側と尾側の両方に5-0の絹の結紮糸を配置します。腹部血管を持ち上げ、5〜0本の絹縫合糸で腰椎枝を凝固または結紮します。精巣動脈と静脈を惜しまないことを忘れないでください、そしてそれらを固定しないでください。
   4. 結紮糸を使用して血管を持ち上げ、マイクロクランプを主要血管の腸間膜枝、尾側、頭蓋側に配置して、吻合部位の血流を停止します。クランプを配置する前に、過度の加熱は四肢虚血を悪化させる可能性があるため、加熱パッドのスイッチを切ってください。低体温症を避けるために、容器のクランプを解除した後は、必ず加熱パッドのスイッチを入れてください。
   5. 27 Gの針を使用して大動脈を穿刺し、マイクロハサミで切開部をドナーの上行大動脈の開口部と同じかそれよりわずかに大きい長さまで伸ばします(Asc。A)、これは約5mmである。
   6. 大動脈切開と同じ方法でIVCを縦切開しますが、大動脈切開と比較して尾側に3 mm近づけます。
   7. 吻合を開始し、ドナーの心臓をレシピエントの腹部の右側に配置し、ドナーAscを取り付けます。Aを受信者のアブドに。縦切開の頭蓋角に1つの単純な断続ステッチ(9-0ポリプロピレン)を有するA。
   8. 心臓をレシピエント腹部の左側に移動し、ドナーのAscの吻合を行います。Aと受信者のAbd。Aはランニング9-0ポリプロピレン縫合糸を用いた。
   9. 縦切開の尾側と頭蓋の角に2つの中断された縫合糸(9-0ポリプロピレン)を使用して、ドナー肺動脈をIVCに固定します。
   10. 血管の管腔内側から静脈吻合の前半を行い、血管の管腔外側から後半を完了する。結び目を締める前に、空気塞栓症を防ぐためにフィールドを生理食塩水で洗い流してください。
6. デエアリングとデクランプ
   1. 吻合が完了したら、最初に腸間膜静脈クランプを取り外して、心臓の右側を静脈血で満たすようにします。
   2. 冠状動脈回路とAscの空気を取り除きます。A.逆行性冠状動脈灌流を数秒間適用することによって。
   3. 血管の両側にガーゼを置き、尾側クランプと頭蓋クランプを取り外します。
   4. 綿棒で1〜2分間穏やかに圧縮します。十分な止血を確保した後、綿棒を取り除き、温かい生理食塩水で吻合部を洗います。
      注意: 心臓は再灌流の最初の分以内に鼓動を開始する必要があります。レシピエントラットの体温が35°C未満の場合、体温が36°Cに達した後に心臓のリズムが正常化します。
7. 蛇行したように腹部臓器を交換し、連続した5-0ポリプロピレン縫合糸を使用して腹部切開の層を閉じます。
8. 手術後、体温が37°Cに達するまで、麻酔をかけた動物を加熱パッドの上の清潔な場所に置きます。
   注意: 体温が37°Cに達するまで術後検査を開始しないでください。 実験が終了するまで麻酔を2〜2.5%イソフルランに維持する。
9. 移植されたドナー心臓のECGを3時間監視します。次に、組織学的研究のために深麻酔下で心臓を切除します。
   注意: 心臓を切除する前に、ペダル反射の欠如を介して麻酔の深さを確認してください。外科的処置とECGモニタリングは6時間未満かかります。周術期に投与されるジクロフェナク(ステップ4.2.3)は、この手順の全期間にわたって疼痛管理を可能にします。鎮痛レジメンは、施設の動物使用ガイドラインに従って調整できます。

図1 は、小動物モデルで使用された実験計画を示す。 図2 は、小動物用酸素供給装置を含む改良型ランゲンドルフ灌流装置を示す。異所性腹部移植の吻合順序を 図3に示す。

図4は、乳酸、カリウム、平均大動脈圧など、ex situ灌流中の心臓の生存率を評価するために使用されるパラメーターを示しています。本研究では,正常温熱時外保存術により,6例の虚血時間の合計が46.2 ± 4.7分に減少し,体外離脱時間の合計は166.2 ± 4.7分であった(図5)。図5に示すように、ドナーからの心臓の摘出、およびex situ灌流および異所性移植の準備には、5.8±1.3分かかりました。手術の成功率は70%であり,成功した6例の平均吻合時間は38.4±3.4分であった。すべての実験で、心拍数は移植直後に有意に減少しましたが、図6に示すように、最終的には時間の経過とともに回復しました。ドナー心臓の肉眼的構造は、その場外保存および異所性移植後も良好に保存され、目に見える損傷は検出されなかった。しかし、ヘマトキシリン-エオジン染色では、異所性移植の3時間後に炎症細胞、主に好中球の数が増加したことが明らかになりました(図7)。

図1:異所性心臓移植による正常体温 上皮 内心臓温存の実験計画。 略語:BGA =血液ガス分析、CPS =心麻痺溶液。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:改変小動物の原位置心臓保存の概略図。 略語:BPセンサー=血圧センサー、CPS =心臓麻痺溶液。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:異所性心臓移植における 吻合の順序。 (A)レシピエント腹部におけるドナーの心臓位置と吻合の順序の概略図。(B)ドナーの上行大動脈およびレシピエント腹部大動脈吻合。(C)ドナー肺動脈およびレシピエントIVC吻合。略語:LV =左心室、RV =右心室、LA =左心房、MPA =主肺動脈、IVC =下大静脈。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4: ex situ 灌流中の生存率評価のためのパラメータ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:正常に保存された6つの心臓の保存タイムライン。 心臓摘出と その場 灌流の促進:5.8±1.3分。 その場 外灌流:120分。レシピエントラットの腹部への移植:38.4±3.4分。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:調達前および移植後のドナー心臓の電気生理学的性能 。 (A)心拍数の変化。収穫前、30分、60分、90分、120分、150分、180分:移植後の回数。(B)ドナーの心臓採取前および移植3時間後の心電図画像。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:ドナー心臓の巨視的(A-C)および顕微鏡的(D-F)外観。 (A,D)正常体温 の上位置 保存前。(B,E)正常発熱 性その場保存 後。(C,F)異所性移植の2時間後。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

著者には利益相反はありません。