ここでは、ラットモデルにおける正常体温 exsitu 保存後の異所性移植心臓の評価プロトコルを提示します。
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方法論記事
ノルマザーミックEx-situ灌流異所性心臓移植のラットモデル
* These authors contributed equally
この記事について
訂正のお知らせ
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サマリー
要約
心臓移植は末期心不全の最も効果的な治療法です。治療アプローチと介入の改善にもかかわらず、移植を待っている心不全患者の数は依然として増加しています。通常の外 場 保存技術は、従来の静的冷蔵技術に匹敵する方法として確立されています。この技術の主な利点は、ドナーの心臓を生理学的状態で最大12時間保存できることです。さらに、この技術は、循環死後のドナー心臓の蘇生を可能にし、移植後のドナー機能を改善するために必要な薬理学的介入を適用します。正常体温 のその場保存 技術を改善し、保存関連の合併症を排除するために、多数の動物モデルが確立されています。大型動物モデルは小動物モデルに比べて取り扱いが容易ですが、コストがかかり、困難です。正常体温のラットモデルを提示します その場 外ドナー心臓温存とそれに続く異所性腹部移植。このモデルは比較的安価で、1人の実験者で実現できます。
概要
心臓移植は、難治性心不全の唯一の実行可能な治療法であり続けています1,2,3,4。心臓移植を必要とする患者の数が着実に増加しているにもかかわらず、ドナー臓器の利用可能性の比例的な増加は観察されていません5。この問題に対処するために、課題を改善し、ドナーの利用可能性を高めることを目的として、ドナーの心臓を保存するための新しいアプローチが開発されました6,7,8,9。
臓器ケアシステム(OCS)マシンを使用したノルマザーミック外皮心臓灌流(NESHP)は、臨床介入として浮上しています1,3。この技術は、従来の静的冷蔵(SCS)法の適切な代替手段と見なされています
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プロトコル
全南大学校病院実験動物研究センター倫理委員会(承認番号。CNU IACUC - H - 2022-36)は、すべての動物実験を承認しました。この研究で使用された雄のSprague-Dawleyラット(350-450 g)は、実験動物の世話と使用に関するガイドラインに従って世話を受けました。ラットは、標準的な餌と水が利用可能で、12時間の明暗サイクルで温度管理された部屋に収容されました。
1. 事前準備
注:1人の実験者がすべての実験手順を実行できます。
- 手術前に、酸素発生器、ポンプ、灌流ラインを含むランゲンドルフ装置を組み立てます(図2)。灌流回路に20 mLの生理食塩水を満たし、自家血でプライミングされるまで循環させます。
注意: このステップの目的は、体外回路を温めることです。 - 大動脈カニューレに取り付けられた活栓 を介して 心臓麻痺ラインを回路に取り付け、最終的な心臓麻痺注入のためにシリンジポンプを準備します。
注意: 灌流回路と心麻痺ラインから気泡を確実に除去してください。 - ドナーの心臓が保管されるリザーバー内に温度センサーを配置し、回路の温度を37°Cに維持します。
- 外科的準備
- ドナーおよびレシピ....
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結果
図1 は、小動物モデルで使用された実験計画を示す。 図2 は、小動物用酸素供給装置を含む改良型ランゲンドルフ灌流装置を示す。異所性腹部移植の吻合順序を 図3に示す。
図4は、乳酸、カリウム、平均大動脈圧など、ex situ灌流中の心臓の生存率を評価するために使用されるパラメーターを示しています。本研究では,正常温熱時外保存術により,6例の虚血時間の合計が46.2 ± 4.7分に減少し,体外離脱時間の合計は166.2 ± 4.7分であった(図5)。図5に示すように、ドナーからの心臓の摘出、およびex situ灌流および異所性移植の準備には、5.8±1.3分かかりました。手術の成.......
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ディスカッション
このモデルを確立する際の私たちの焦点は、正常体温のヒト心臓移植を再現することでした。非駆出モデルは、ドナー心臓を ex situ 環境に保存するための一般的に好ましい技術である16。駆出モデルは、 ex situ 灌流中の心機能を評価する上で多くの利点を提供しますが17、異所性移植モデルには適していません。異所性移植では、移植されたドナーの心臓は、レシピエントの循環器系で宿主の心臓によって生成される収縮期後負荷圧を克服する必要があり、ドナーの心臓のパフォーマンスが制限され、評価で過小評価されます18。したがって、非駆出モデルは異所性移植においてより有利である。非駆出モデルでは、ドナーの心臓は灌流されますが、レシピエントの循環をサポートしないため、心臓の性能評価が大幅に制限されます。組織学的染色やブロッティング解析などの形態学的および分子的評価は、機能評価が限られている場合にドナーの心臓の状態を調べるのに役立ちます。さらに、代謝マーカーは、陽電子放出断層撮影(P.......
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開示事項
著者には利益相反はありません。
謝辞
この研究は、全南大学校病院生物医学研究所からの助成金B2021-0991と韓国国立研究財団からのNRF-2020R1F1A1073921によって支援されました
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| AESアクティブ避難システム | スミス医療 | PC-6769-51A | CO2と過剰なイソフルラン |
| 麻酔器 | スミス医療 | PC-8801-01A | イソフルランとオキシエグンを混合し、動物B20患者モニターに配信 |
| GE医療システム | B20 | 、平均大動脈圧と温度を観察するために | |
| ホメオサーミックモニタリングシステム | ハーバード装置 | 55-7020 | 動物の体温をモニターし、維持するには |
| Micro-1 ラットの酸素供給器 | 東莞Keweiの医療機器 | Micro-MO | ランゲンドルフ回路のガス交換のため |
| マイクロパンクイントロデューサーセット | COOK医療 | G48007 | 腹部大動脈を通じてアーチに心筋麻痺の解決策を送達するための |
| 顕微鏡 | Amscope | MU1403 | ズーム手術用フィールド (レシピエント) |
| 外科用ルーペ | SurgiTel | L2S09 | 手術野のズーム用 (ドナー) |
| シリンジポンプ | AMP all | SP-8800 | 心筋麻痺のソリューションを提供するために |
| Transonic フローセンサー | Transonic | ME3PXL-M5 | 灌流回路フローセンサー |
| Transonic チューブフローモジュール | Transonic | TS410 | フローアクワイアリングシステム |
| Watson - マーローポンプ | ド装置 | 010.6131.DAO | 蠕動ポンプ再循環灌流に使用されます |
| WBC-1510A | JEIO TECH | 加熱バス | |
| Sprague-DawleyラットSamtako | Bio Korea Co.、Ltd.、烏山市 | ||
| 韓国Medications | |||
| BioHAnceジェル点眼薬 | SENTRIXアニマルケア | 目のための湿った軟膏 | |
| セファゾリン | JW製薬 | プロフィラキシー用 | |
| Custodiol | DR、フランツ・コーラー CHEMIE GMBH | 心臓収穫用 | |
| ジクロフェナク | Myungmoon Pharm. Co. Ltd | 疼痛管理のために | |
| ヘパリン | JW医薬品 | 抗凝固剤 | |
| インスリン | JW製薬 | ホルモン療法 | |
| 生理食塩水 | JW医薬品 | 水分補給療法用 |
参考文献
- Langmuur, S. J. J., et al. Normothermic ex-situ heart perfusion with the organ care system for cardiac transplantation: A meta-analysis. Transplantation. 106 (9), 1745-1753 (2022).
- Ardehali, A., et al.
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再版と許可
訂正
Formal Correction: Erratum: Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation
Posted by JoVE Editors on 8/28/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation. The Protocol section was updated.
Section 4 of the Protocol was updated from:
4. Implantation
- Preparation of recipient
- Begin the recipient preparation 30 min before the cessation of ex situ perfusion.
- Anesthetize the recipient animal using the same method as mentioned in step 2.2.
- Place the rat in a supine position on the heating pad and insert the temperature probe into the rectum to maintain the body temperature at 37 °C.
- Apply eye lubricant, shave the pubic to the epigastric area, and cleanse the area with an iodine-based scrub and 70% alcohol.
- Medications
- Inject 2 mL of warm saline subcutaneously to compensate for the fluid lost during the surgery. Inject 200 IU of heparin subcutaneously.
- Administer antibiotic prophylaxis by injecting 10 mg/kg cefazolin dissolved in 0.3 mL of saline subcutaneously or intramuscularly.
- Administer pain control by injecting 20 mg/kg of diclofenac subcutaneously.
- Perform the mid-line laparotomy and insert a retractor to widen the abdominal cavity. Mobilize the abdominal organs to the left side of the recipient using cotton swabs to make space for the procedure.
- Prevent dehydration by wrapping the abdominal organs with warm and wet gauze. Intermittingly spread warm saline with a 50 mL syringe during the surgery.
- Utilizing a surgical microscope with a 10x magnification, mobilize the duodenum and proximal jejunum by blunt dissection with cotton swabs to expose the Abd. A. and IVC. Prepare the Abd. A and IVC for anastomosis and systematically implant the donor heart, in accordance with Figure 3 or previously documented methods15.
NOTE: Do not separate the Abd. A. and IVC.- Assuming vascular anastomosis to be placed infrarenal, prepare a sufficient portion of the aorta and IVC for clamping.
- Perform blunt preparation using cotton swabs or sharp-serrated forceps to remove the fats and fascia around the vessels.
- Place 5-0 silk ligatures to the mesenteric branches and both the cranial and caudal sides of the major vessels. Elevate the abdominal vessels and coagulate or ligate the lumbar branches with 5-0 silk sutures. Remember to spare the testicular arteries and veins and do not clamp them.
- Use ligatures to lift the vessels and position the micro-clamps to the mesenteric branches, caudal, and cranial sides of the major vessels to stop the blood flow at the anastomosis site. Be sure to switch off the heating pad before placing the clamps, as excess heating can exacerbate limb ischemia.
- Puncture the aorta using a 27 G needle and elongate the incision with micro scissors to a length equal to or slightly larger than the opening of the donor ascending aorta (Asc. A), which is approximately 5 mm.
- Make a longitudinal incision on the IVC in the same way as the aortotomy, but make it 3 mm closer to the caudal side compared to the aorta incision.
- Starting the anastomoses, placed the donor heart on the right side of the recipient's abdomen and attach the donor Asc. A to the recipient's Abd. A with one simple interrupted stitch (9-0 polypropylene) at the cranial corner of the longitudinal incision.
- Move the heart to the left side of the recipient abdomen and perform anastomosis of the donor's Asc. A with the recipient's Abd. A using a running 9-0 polypropylene suture.
- Fixate the donor pulmonary artery to the IVC with two interrupted sutures (9-0 polypropylene) at the caudal and cranial corners of the longitudinal incision.
- Perform the first half of the venous anastomosis from the intraluminal side of the vessel and complete the second half from the extraluminal side of the vessel. Before tightening the knots, flush the field with saline to prevent air embolism.
- De-airing and de-clamping
- Remove the mesenteric vein clamp first after completing the anastomosis to allow the right side of the heart to fill with venous blood.
- Remove the air in the coronary circuit and Asc. A. by applying retrograde coronary perfusion for several seconds.
- Place a piece of gauze on both sides of the vessels and remove the caudal clamp and the cranial clamp.
- Apply gentle compression with cotton swabs for 1-2 min. After ensuring adequate hemostasis, remove the swabs and wash the anastomoses with warm saline.
NOTE: The heart should begin beating within the first minute of reperfusion. If the recipient rat's body temperature is below 35 °C, the heart rhythm will normalize after the temperature reaches 36 °C.
- Replace the abdominal organs in a meander-like manner and close the layers of the abdominal incision using continuous 5-0 polypropylene sutures.
to:
4. Implantation
- Preparation of recipient
- Begin the recipient preparation 30 min before the cessation of ex situ perfusion.
- Anesthetize the recipient animal using the same method as mentioned in step 2.2.
- Place the rat in a supine position on the heating pad and insert the temperature probe into the rectum to maintain the body temperature at 37 °C.
- Apply eye lubricant, shave the pubic to the epigastric area, and cleanse the area with an iodine-based scrub and 70% alcohol.
- Medications
- Inject 2 mL of warm saline subcutaneously to compensate for the fluid lost during the surgery. Inject 200 IU of heparin subcutaneously.
- Administer antibiotic prophylaxis by injecting 10 mg/kg cefazolin dissolved in 0.3 mL of saline subcutaneously or intramuscularly.
- Administer pain control by injecting 20 mg/kg of diclofenac subcutaneously.
- Perform the mid-line laparotomy and insert a retractor to widen the abdominal cavity. Mobilize the abdominal organs to the left side of the recipient using cotton swabs to make space for the procedure.
- Prevent dehydration by wrapping the abdominal organs with warm and wet gauze. Intermittingly spread warm saline with a 50 mL syringe during the surgery.
- Utilizing a surgical microscope with a 10x magnification, mobilize the duodenum and proximal jejunum by blunt dissection with cotton swabs to expose the Abd. A. and IVC. Prepare the Abd. A and IVC for anastomosis and systematically implant the donor heart, in accordance with Figure 3 or previously documented methods15.
NOTE: Do not separate the Abd. A. and IVC.- Assuming vascular anastomosis to be placed infrarenal, prepare a sufficient portion of the aorta and IVC for clamping.
- Perform blunt preparation using cotton swabs or sharp-serrated forceps to remove the fats and fascia around the vessels.
- Place 5-0 silk ligatures to the mesenteric branches and both the cranial and caudal sides of the major vessels. Elevate the abdominal vessels and coagulate or ligate the lumbar branches with 5-0 silk sutures. Remember to spare the testicular arteries and veins and do not clamp them.
- Use ligatures to lift the vessels and position the micro-clamps to the mesenteric branches, caudal, and cranial sides of the major vessels to stop the blood flow at the anastomosis site. Switch off the heating pad before placing the clamps, as excess heating can exacerbate limb ischemia. Ensure to switch on the heating pad after de-clamping the vessels to avoid hypothermia.
- Puncture the aorta using a 27 G needle and elongate the incision with micro scissors to a length equal to or slightly larger than the opening of the donor ascending aorta (Asc. A), which is approximately 5 mm.
- Make a longitudinal incision on the IVC in the same way as the aortotomy, but make it 3 mm closer to the caudal side compared to the aorta incision.
- Starting the anastomoses, placed the donor heart on the right side of the recipient's abdomen and attach the donor Asc. A to the recipient's Abd. A with one simple interrupted stitch (9-0 polypropylene) at the cranial corner of the longitudinal incision.
- Move the heart to the left side of the recipient abdomen and perform anastomosis of the donor's Asc. A with the recipient's Abd. A using a running 9-0 polypropylene suture.
- Fixate the donor pulmonary artery to the IVC with two interrupted sutures (9-0 polypropylene) at the caudal and cranial corners of the longitudinal incision.
- Perform the first half of the venous anastomosis from the intraluminal side of the vessel and complete the second half from the extraluminal side of the vessel. Before tightening the knots, flush the field with saline to prevent air embolism.
- De-airing and de-clamping
- Remove the mesenteric vein clamp first after completing the anastomosis to allow the right side of the heart to fill with venous blood.
- Remove the air in the coronary circuit and Asc. A. by applying retrograde coronary perfusion for several seconds.
- Place a piece of gauze on both sides of the vessels and remove the caudal clamp and the cranial clamp.
- Apply gentle compression with cotton swabs for 1-2 min. After ensuring adequate hemostasis, remove the swabs and wash the anastomoses with warm saline.
NOTE: The heart should begin beating within the first minute of reperfusion. If the recipient rat's body temperature is below 35 °C, the heart rhythm will normalize after the temperature reaches 36 °C.
- Replace the abdominal organs in a meander-like manner and close the layers of the abdominal incision using continuous 5-0 polypropylene sutures.
- After the surgery, place the anesthetized animal on a clean area over a heating pad until the body temperature reaches 37°C.
NOTE: Do not initiate the postoperative examinations till the body temperature reaches 37°C. Maintain anesthesia at 2-2.5% isoflurane until the end of the experiments. - Monitor ECG of the transplanted donor heart for 3 h. Then, excise the heart under deep anesthesia for histological studies.
NOTE: Confirm anesthesia depth via lack of pedal reflex before excising the heart. The surgical procedure and the ECG monitoring take less than 6 h. Diclofenac, administered perioperatively (step 4.2.3.), enables pain management for the entire duration of this procedure. The analgesia regimen can be adjusted per the institutional animal use guidelines.
