マウス蛍光血管造影画像からの網膜血管径の測定

おそらく、体内で最も研究されている血管床は網膜血管系です。ますます進歩する技術の洗練により、網膜血管系は生きている患者で簡単に撮影され、多くの研究分野で使用されています¹。さらに、発生中のマウス網膜血管系は、血管成長の基礎生物学の研究に非常に効果的なモデルシステムであることが証明されています。網膜血管系の主な目的は、神経組織²を透過する層状毛細血管網を通して、網膜の内側部分に代謝サポートを提供することである。それにもかかわらず、網膜の状態、ひいては機能障害や萎縮は、網膜血管系の分岐部と動脈の直径の両方に重大な影響を与える可能性があり、網膜細胞と血管系^3,4との間の相互作用を示しています。未熟児網膜症(ROP)、糖尿病性網膜症(DR)、加齢黄斑変性症(AMD)、緑内障、角膜血管新生など、多くの眼疾患が異常な眼血管新生を引き起こすことが知られています⁵。網膜血管系の場合、網膜変性のマウスモデルは、ヒトの血管疾患に見られるものに匹敵する変化を示すことがよくあります^6,7。基本的なヘリックス-ループ-ヘリックス-ジッパー転写因子のMycスーパージーンファミリーには、網膜色素上皮(RPE^)8,9,10で発現する小眼球症関連転写因子(Mitf)遺伝子が含まれる。

目、耳、免疫系、中枢神経系、腎臓、骨、皮膚など、数多くの臓器がMitf 9,11,12,13によって調節されていることが実証されています。 私たちは、Mitf遺伝子にさまざまな変異を持つマウスでは、RPEの構造と機能が影響を受け、網膜変性症のいくつかのケースを引き起こし、最終的には視力喪失をもたらすことを発見しました¹⁰。最近、Mitf変異体マウスと野生型マウスとでは、血管数と血管径が有意に異なることが示されている¹⁴。研究者や医師は、網膜イメージングの進展により、in vivoで網膜血管系を正確に定量できるようになりました。1800年代以降、研究者や医師は網膜血管系を視覚化する利点を利用しており、フルオレセイン血管造影法(FA)は網膜血流と血液網膜関門の劣化の両方を示している¹⁵。

この記事では、MATLAB ソフトウェアでカスタム記述されたコードを使用して、マウスの FA 画像から網膜血管の直径を解析する方法を示します。

すべての実験は、アイスランド食品獣医局(MASTライセンス番号2108002)によって承認されました。すべての動物実験は、Association for Research in Vision and Ophthalmology(ARVO)の「眼科および視覚研究における動物の使用に関する声明」に従って実施されました。本研究では、雌雄のC57BL/6Jマウスと Mitf^mi-vga9/+ マウスを用いた。C57BL/6Jマウス(n=7)を対照として使用した。野生型は商業的に入手されましたが( 資料表を参照)、すべての突然変異マウス(n = 7)はアイスランド大学の生物医学センターの動物施設で飼育および飼育されました。本研究では、生後3か月の動物を使用しました。ただし、このプロトコルは1か月以上の動物にも適用されます。

1. 実験の準備

1. 麻酔混合物を準備します。2 mLのケタミン原液(25 mg / mL)と250 μLのキシラジン原液(2%)のアンプル1つを取り、ケタミン/キシラジン混合物(25 mg / mLケタミンと20 mg / mLキシラジン)の作業溶液を調製します( 材料の表を参照)。
2. マウスの体重の 4 倍の量の液体を使用して、ケタミン/キシラジン混合物の腹腔内注射でマウスに麻酔をかけます。たとえば、体重20 gのマウスでは、キシラジン(4 mg / kg体重)とケタミン(40 mg / kg体重)の混合物の作業用量を得るためには、35 μLのキシラジン/ケタミン作業溶液が必要です。
3. 麻酔直後に10%フェニレフリン塩酸塩と1%トロピカミドの点眼薬で瞳孔を拡張します。
4. 動物が完全に麻酔され、その瞳孔が広く拡張するまで待ちます。
5. フルオレセイン塩溶液を調製します。9 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS;1x)を1 mLのフルオレセイン溶液(100 mg/mLストック濃度)に加えます( 材料の表を参照)。最終濃度ワーキング溶液は10 mg/mLです。

2. げっ歯類の網膜イメージングシステムを用いた網膜血管系の in vivo イメージング

1. 麻酔した動物にフルオレセイン作動溶液を腹腔内(5μL / g体重)投与します。.
2. 角膜表面に2%メチルセルロースゲルを滴下し、次に動物をイメージングシステムの位置決めステージに置きます( 材料の表を参照)。
3. 網膜イメージング眼底カメラレンズをマウスの角膜に直接優しく触れるように配置します。視神経乳頭を視野の中央に配置するには、位置合わせを少し調整します。
4. 眼底カメラの緑色蛍光チャンネルに切り替えます。
5. 網膜血管に焦点を合わせて画像を撮ります。
6. 理想的な時点を見つけるには、フルオレセイン注射後1分、3分、5分、10分後(ただし10分以内)に多数の写真を撮ります。
   注:FA治療は10分以内に完了する必要があります、それ以降はフルオレセインが拡散しすぎて血管が検出されなくなる可能性があるためです。
7. イメージングが完了したら、マウスがまだ麻酔をかけられている間に、子宮頸部脱臼によってマウスを安楽死させます。

3. 網膜血管の直径の解析

1. MATLAB プログラムを開きます ( 資料の表を参照)。
2. 「fundusDiameter.m」コードをダウンロードして保存します( 補足コーディングファイル1、補足コーディングファイル2、 補足コーディングファイル3を参照)。
3. コードを保存したフォルダを開きます。コードをドラッグして、MATLAB の Current Folder にドロップします。
4. FFA画像(眼底、蛍光、血管造影画像)または解析したい画像をMATLABのCurrent Folderにドラッグアンドドロップします。
5. MATLAB ツールバーから [実行 ] ツールを押します。
6. ポップアップウィンドウが表示されます。目的の画像のファイル名を [ファイル名の入力 ]ボックスに入力し、[ OK]を押します。
   注: 残りのパラメータは変更または修正しないでください。
7. 光ディスクの中心を選択し、次に光ディスクの端を選択します。これで、マウス眼底画像のピクセルの強度を、視円板の中心から時計回りに視円板の半径の2倍で計算します(図1)。
8. 次に、ソフトウェアが眼底内の各血管の平均血管直径(ピクセル単位)を血管番号の関数としてプロットしていることを確認します(図2)。
9. その後、ソフトウェアが各容器の測定データをExcelドキュメントに転送し、これらの値の平均、中央値、および標準偏差が計算されていることを確認します(表1 および 表2)。
10. 結果テーブルからスプレッドシート プログラムに値を移動するには、テーブル内のすべての値を選択します。値をスプレッドシートに貼り付けます。
11. グラフをプロットし、選択したスプレッドシートプログラムに貼り付けたデータを使用して統計分析を実行します( 材料の表を参照)。

図1は、網膜血管系の解析に用いたプロセスを示しており、これを試験したすべてのマウスのマウスFFA画像に適用しています。光ディスクの 2 倍の半径を使用して、光ディスクの中心から時計回りに円を描くピクセルの強度を測定します。ピクセルは、ユーザー指定のしきい値より上と下のポイントをそれぞれ横切ると、開始点または終了点でマークされます。これを30回繰り返し、そのたびに視神経乳頭の中心から少し離れていきます。FFA画像は、フルオレセイン注射の5分後に撮影されます(図1A および 図1B)。次に、解析ソフトウェアは、関連する30のエンドポイントのそれぞれと各スタートポイントの間の最短ルートを計算します。この処理の結果は、ポイントとそれらの間に白い線で表される測定値を持つ図です。対照マウスおよび Mitf 変異マウスからのそのような画像の例は、それぞれ 図1A および 図1Bに示されている。ただし、 図 1B に示されている黒い矢印は、発生する可能性のある軽微なエラーですが、ソフトウェアはこれらのエラーを網膜血管として読み取らない。さらに、プログラムは、視神経乳頭の上の上位中央血管(血管1として)から始まり、次にディスクの周りを時計回りに番号順に、血管上で決定された30のエンドポイントに基づいて、各網膜血管の平均血管直径をピクセル単位で計算します。次に、ソフトウェアは平均血管直径を血管数の関数としてグラフに表示します。野生型マウスと変異型マウスのこれらのグラフの例を、それぞれ 図2A と 図2Bに示します。各容器の測定値に加えて、容器の直径の平均、中央値、および標準偏差の計算をピクセル単位で含むExcelドキュメントも提供します。これらの表は、この研究で調査したすべてのマウス(表1 および 表2)について、ソフトウェアから取得されます。したがって、値は別のプログラムにコピーされません。 表1 および 表2 の値「N」は、各船舶から取得され、プログラムによって計算されたポイント数に対応します。この値が 5 以下の場合、ソフトウェアはそれを該当しない (N/A) と読み取るため、網膜血管には対応しません。

図1:フルオレセイン血管造影画像。 本研究で用いたコントロールマウス(A)と Mitfmi-vga9/+ 変異体マウス(B)の画像。赤い点は、光ディスクの中心と端に対応しています。容器の白い線は、ポイント間の最短距離の測定が行われている場所を示しています。黒い矢印は、コードで発生する可能性のあるエラーを示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:血管番号の関数としての平均血管直径。 野生型 (A) および Mitfmi-vga9/+ 変異体 (B) マウスの眼底画像における主網膜血管の平均血管径 (ピクセル±標準偏差 [SD])両方のパネルの横軸は、各血管の血管番号を示しており、視円盤の上の中央の血管から血管番号1として数えられ、次にその血管から時計回りに数えられます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:野生型マウスの眼底の平均網膜血管径(ピクセル単位)。 テーブルの値は、解析ソフトウェアから取得されます。各線は1つの血管からのデータを表し、最初の線は視神経乳頭の上の眼底の上中央部分にある血管です。次に、船舶には、その船舶から時計回りに番号が付けられます。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表2:Mitfmi-vga9 / +変異マウスの眼底の平均網膜血管径(ピクセル単位)。表 1 と同じ手順が使用されます。テーブルの値は、解析ソフトウェアから取得されます。各線は1つの血管からのデータを表し、最初の線は視神経乳頭の上の眼底の上中央部分にある血管です。次に、船舶には、その船舶から時計回りに番号が付けられます。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル:網膜血管の直径を決定するための「fundusDiameter.m」コード。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

著者らは、競合する利益は存在しないと宣言します。