本プロトコルは、FeCl3媒介傷害を使用して動脈血栓症を誘発する方法、および電子顕微鏡分析のために血栓症の様々な段階で動脈損傷サンプルを収集して調製する方法を記載している。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
方法論記事
塩化第二鉄誘発動脈血栓症および3D電子顕微鏡分析のためのサンプル収集
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
心血管疾患は、世界中の死亡率と罹患率の主な原因です。異常な血栓症は、糖尿病や肥満などの全身状態、およびアテローム性動脈硬化症、癌、自己免疫疾患などの慢性炎症性疾患の一般的な特徴です。血管損傷時には、通常、凝固系、血小板、および内皮が調整された方法で作用し、損傷部位に血餅を形成することによって出血を防ぎます。このプロセスの異常は、過度の出血または制御不能な血栓症/不十分な抗血栓活性のいずれかを引き起こし、血管閉塞とその後遺症につながります。FeCl3誘発頸動脈損傷モデルは、血栓症が in vivoでどのように開始および進行するかを調べる上で貴重なツールです。このモデルには、内皮の損傷/露出とそれに続く損傷部位での血餅形成が含まれます。これは、さまざまな程度の血管損傷に応答して血管損傷と血餅形成を監視するための高感度で定量的なアッセイを提供します。最適化されると、この標準的な手法を使用して、血栓症の根底にある分子メカニズム、および成長する血栓における血小板の微細構造変化を研究することができます。このアッセイは、抗血栓薬および抗血小板薬の有効性を研究するのにも有用である。この記事では、FeCl3誘発動脈血栓症を開始および監視する方法、および電子顕微鏡による分析のためにサンプルを収集する方法について説明します。
概要
血栓症は、血管を部分的または完全に遮断し、血液の自然な流れを妨げる血栓の形成です。これは、虚血性心疾患や脳卒中などの重度で致命的な心血管イベントにつながります。心血管疾患は罹患率と死亡率の主な原因であり、世界中で4人に1人が死亡しています1,2,3。血栓症は血管系の機能不全として現れますが、根本的な微生物またはウイルス感染、免疫障害、悪性腫瘍、または代謝状態の結果である可能性があります。血流は、内皮細胞、赤血球/白血球、血小板、凝固因子など、血管系の多様な構成要素間の複雑な相互作用によって維持されています4。血管損傷を受けると、血小板は内皮下マトリックス上の接着タンパク質と相互作用し、それらの顆粒内容物を放出し、より多くの血小板を動員します5。同時に、凝固カスケードが活性化され、フィブリンの形成と沈着につながります。最終的に、血餅が形成され、フィブリンメッシュ6内に閉じ込められた血小板および赤血球を含む。血栓症を調節するために抗血小板薬と抗凝固薬が利用可能であるが、偽の出血は依然としてこれらの治療法の主要な懸念事項であり、これらの薬の投与量と組み合わせの微調整が必要である。したがって、新しい抗血栓薬を発見....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
ここで議論されているすべての実験は、ケンタッキー大学の施設内動物管理使用委員会(IACUC)によってレビューおよび承認されました。
注意: 手術器具は 、図1 と 材料表に記載されています。C57BL / 6Jマウス、8〜10週齢、雄/雌または関連する遺伝子操作(ノックアウトまたはノックイン)株を使用した。
1. FeCl3誘発頸動脈損傷
- マウス麻酔誘導
- マウスの重量を量ります。
- 0.2 g / kgのトリブロモエタノール溶液を腹腔内(i.p.)に注射してマウスを麻酔します。注射する前に、麻酔液が室温(RT)にあることを確認してください。この用量は、マウスを約1時間鎮静させるのに十分である。
- 注射の5分後につま先をつまんでつま先の反射をチェックし、マウスが鎮静していることを確認します。マウスが鎮静されていない場合、つま先を引き離します。その場合は、5分待ってからもう一度確認してください。
- マウスがまだ完全に鎮静していない場合は、初期用量の1/4を投与し、5分間待ちます。
- 手順全体を通して、つま先ピンチを介してマウスの麻酔面を定期的に監視します。さらに、呼....
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
データは一般に、閉塞までの時間、または完全に閉塞性の血栓を形成するのに必要な時間として提示されます。これらのデータは、Kaplan-Meier生存曲線(図4A)19、血流の停止時または実験終了時の終末血流を示すバー付きのドットプロット(図4B)、または折れ線グラフ(図4C)としてプロットできます。血栓安定性はこの技術を用いて研究することができる。ほとんどの場合、FeCl3損傷時に血栓が徐々に形成され、それが成長するにつれて血流は徐々に減少し、血管が完全に閉塞するとゼロに達する。場合によっては、数分間徐々に減少した後、血流が突然増加します。これは、成長する血栓の部分的な脱落として解釈され、塞栓術イベントと見なすことができます(図4D)。閉塞性血栓の形態(図7A)もこの方法を用.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
血栓症を誘発するための血管系へのFeCl3の局所適用は広く使用されている技術であり、さまざまな血小板受容体、リガンドシグナル伝達経路、およびそれらの阻害剤の役割を確立するのに役立ちました20、21、22、23。FeCl3が血栓症を引き起こすメカニズムは多面的です。以前は、内皮露出が血栓症の原因と考えられていましたが、近年、このプロセスにおける赤血球と血漿タンパク質の役割が複数の報告で示唆されています24,25,26,27。
このプロ.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者らは、この研究に関連する利益相反はありません。
ORCID プロファイル: SJ: 0000-0001-6925-2116;SWW:00000-0001-5577-0473。
謝辞
著者は、この原稿を注意深く熟読してくれたホワイトハート研究所のメンバーに感謝します。この作業は、NIH、NHLBI(HL56652、HL138179、およびHL150818)からの助成金、およびSWWへの退役軍人省功労賞、BSへのR01HL 155519、およびR.D.L.へのNIBIB学内プログラム助成金によってサポートされました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.9%生理食塩水 | フィッシャーサイエンティフィック | BP358-212 | NaClは0.9%生理食塩水の溶液を作るのに使用されました |
| 1 mLシリンジ | ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー | ||
| 190プルーフエタノール | コプテック | V1101 | マウスの手術準備に使用する70%エタノール溶液の作製に使用 |
| 2,2,2 トリブロモエタノール | Sigma Aldrich | 48402 | |
| 25 ヤード ブラック ブレイド シルク縫合糸 (5-0) | DEKNATEL | 136082-1204 | |
| 26G x 3/8 針 | ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー | 305110 | |
| 2-メチル-2-ブタノール | Sigma Aldrich | 240486 | |
| 7.5 mL トランスファー ピペット 3 mL Globe | Scientific Inc. | 135010 | |
| アルコール調製パッド(70%イソプロピルアルコール) | メドライン | MDS090735 | |
| アラルダイトGY 502 | 電子顕微鏡サービス | 10900 | |
| 細胞培養皿 35mm x 10mm | コーニングインコーポレイティッド | ||
| コンパクトスケール | ウォードの科学 | 470314-390 | |
| 解剖ハサミ、長さ12.5 cm | 、World Precision Instrument | 15922-G | |
| DMP-30アクチベーター | 電子顕微鏡サービス | 13600 | |
| 無水物コハク酸ドデニル/ DDSA | 電子顕微鏡サービス | 13700 | |
| 犬用うんち袋・動物死体処理袋 | クラウン製品 | PP-RB-200 | |
| ドップラーフロープローブ | Transonic Systems Inc. | MA0.5PSB | |
| EMBED 812樹脂 | 電子顕微鏡サービス | 14900 | |
| エチルアルコール、無水200プルーフ | 電子顕微鏡サービス | 15055 | |
| アイドレッシング鉗子、4インチ全湾曲、標準、0.8mm幅のヒント | インテグラミルテックス | 18-784 | |
| フィルターペーパー | VWR | 28310-106 | |
| ファインハサミ - シャープ-ブラント | ファインサイエンスツール | 14028-10 | |
| フィンガーループイヤーパンチ | ファインサイエンスツール | 24212-01 | |
| ガーゼスポンジ2 "x 2"– 12プライ | Dukal Corporation | 2128 | |
| グルタルアルデヒド(10%溶液) | 電子顕微鏡サービス | 16120 | |
| インテグラ ミルテックス 炭素鋼 サージカル ブレード #10 | インテグラ®ミルテックス® | 4110 | |
| 鉄(III) | SIGMA-ALDRICH | 157740-100G | |
| ナイフハンドル ミルテックス®極細ステンレス サイズ3 | インテグラライフサイエンス | 157510 | |
| L-アスパラギン酸 | シグマ フィッシャー | A93100 | |
| L-アスパラギン酸 | フィッシャーサイエンティフィック | BP374-100 | |
| 硝酸鉛 | フィッシャーサイエンティフィック | L-62 | |
| ライカ S8AP0 マイクロスコープ | ライカ | 販売終了 | |
| ライカ S8AP0 マイクロスコープスタンド | ライカ | ||
| 10447255 Light-Duty Tissue Wipers社からの販売を終了しました | VWR | 82003-822 | |
| マイクロ解剖鉗子;1x2歯、フルカーブ;0.8mm先端幅;4インチ長さ | Roboz Surgical Instrument Company | RS-5157 | |
| 酸化オスミウム4%水溶液 | 電子顕微鏡サービス | 19150 | |
| パラホルムアルデヒド(16%溶液) | 電子顕微鏡サービス | 15710 | |
| フェリシアン化カリウム | SIGMA-ALDRICH | P-8131 | |
| プロピレンオキシド、ACS試薬 | 電子顕微鏡サービス | 20401 | |
| レイニン クラシック ピペット PR-10 | レイニン | 17008649 | |
| 研究用流量計 | Transonic Systems株式会社 | T402B01481 | モデル:T402 |
| スコッチマジックインビジブルテープ、3/4 "x 1000"、クリア | スコッチ | ||
| 小動物用ヒーテッドパッド | K&株式会社Hマニュファクチャリング | モデル:HM10 | |
| コジル酸ナトリウムバッファー0.2M、pH7.4 | 電子顕微鏡サービス | 11623 | |
| 綿先端アプリケーター | ピューリタンメディカルプロダクツ | 25-806 1WC | |
| Steromaster イルミネーター | フィッシャーサイエンティフィック | 12-562-21 | |
| Surgical Dumont #7 Forceps | ファインサイエンスツール | 11271-30 | |
| チオカルボヒドラジド (TCH) | SIGMA-ALDRICH | 88535 | |
| ユニバーサル低保持ピペットチップリロード (0.1-10 µL) | VWR | 76323-394 | |
| 酢酸ウラニル | 電子顕微鏡サービス | 22400 | |
| ヴィート ジェル クリーム ヘア リムーバー | レキット ベンキーザー | 3116875 | |
| ホワイト 帯電防止 六角形 計量ボート ミディアム 64 x 15 x 19 mm | フィッシャー サイエンティフィック | S38975 | |
| DATAQ Instruments, Inc. | 用WinDAQ/100ソフトウェア | バージョン3.38 | 無料でダウンロード可能 |
| https://www.dataq.com/products/windaq/ ZEISS AxioCam Icc 1 | ZEISS | 57615 |
参考文献
- Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
- Raskob, G. E., et al.
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
タグ
