方法論記事

遺伝子組換え マラリア原虫ベルヘイ ・スポロゾイトの生成

DOI：

10.3791/64992

⸱

2023年5月5日

 , 
1Center for Tropical and Emerging Global Diseases, University of Georgia, 2Department of Cellular Biology, University of Georgia

この記事について

サマリー

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マラリアは、感染した蚊による マラリア原虫 のスポロゾイト段階の接種によって伝染します。トランスジェニックマラリア原虫は、マラリアの生物学をよりよく理解することを可能にし、 マラリア ワクチン開発の取り組みに直接貢献しています。ここでは、トランスジェニック マラリア原虫 のスポロゾイトを生成するための合理化された方法論について説明します。

要約

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マラリアは寄生虫マラリア原虫によって引き起こされる致命的な病気で、メスのハマダラカに刺されることで感染します。脊椎動物の宿主の皮膚に蚊によって沈着したマラリア原虫のスポロゾイト段階は、臨床的マラリアを開始する前に肝臓で強制的な発達段階を経ます。肝臓でのマラリア原虫の発生の生物学についてはほとんどわかっていません。スポロゾイト段階へのアクセスと、そのようなスポロゾイトを遺伝子組み換えする能力は、マラリア原虫感染の性質とその結果生じる肝臓の免疫応答を研究するための重要なツールです。ここでは、トランスジェニックPlasmodium berghei sporozoitesを生成するための包括的なプロトコルを紹介します。私たちは、血液期のP. bergheiを遺伝子改変し、この形態を利用して、ハマダラカが血食を摂取すると感染します。トランスジェニック寄生虫が蚊の中で発生した後、蚊の唾液腺から寄生虫のスポロゾイト段階を単離し、in vivoおよびin vitro実験を行います。我々は、緑色蛍光タンパク質(GFP)サブユニット11(GFP11)を発現するP. bergheiの新規株のスポロゾイトを生成することにより、プロトコルの妥当性を実証し、肝臓期マラリアの生物学を調査するためにどのように使用できるかを示します。

概要

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マラリアの予防と治療に関する医薬品開発と研究が進歩しているにもかかわらず、マラリアの世界的な疾病負担は依然として高いままです。毎年50万人以上がマラリアで死亡しており、サハラ以南のアフリカなどのマラリア蔓延地域に住む子どもたちの死亡率が最も高い1。マラリアは、寄生虫マラリア原虫によって引き起こされ、唾液腺に寄生虫を宿している雌のハマダラカに刺されることで人間に感染します。マラリア原虫の感染段階であるスポロゾイトは、血食中に脊椎動物の宿主の皮膚に沈着し、血流に乗って肝細胞に感染し、赤血球に感染する前に必須の発達(赤血球性マラリア前症を構成する)を受けます。赤血球の感染はマラリアの血期を開始し、この疾患に関連する罹患率と死亡率のすべてに関与しています2,3。

マラリア原虫の前赤血球発生の義務的な性質は、予防的ワクチンおよび医薬品開発の取り組みの魅力的な標的となっています4。前赤血球性マラリアの生物学を研究し、肝臓段階を標的とするワクチンや薬を開発するための前提条件は、マラリア原虫スポロゾイトへのアクセスです。さらに、遺伝子組み換え....

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プロトコル

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私たちの研究室における脊椎動物に関するすべての研究は、ジョージア大学の動物使用ガイドラインとプロトコルに準拠して実施されました。

1. P. berghei に感染したマウスの作製

  1. 野生型 P. berghei 寄生虫を使用して、雄または雌の 6-8 週齢の C57BL/6 (B6) マウスで血液段階の感染を開始します。これを行うには、凍結保存された P.berghei感染血液(2 x 105 感染RBC)を、400 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で再構成し、1匹または2匹のドナーマウスに腹腔内(i.p.)に移植します。
  2. 感染後5日目のドナーマウス(d.p.i.)から眼窩後出血によって採取した新鮮な血液を、2匹のナイーブB6マウスに移植する。これを行うには、200 μLの血液を採取し、300 μLのPBSで再構成し、200 μLのi.p.をレシピエントマウスに注入します。この時点でのドナーの寄生虫血症が2%〜5%であることを確認してください19,20。
  3. 以前に説明したように寄生虫血症を監視します19,20、レシピエント....

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結果

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シゾントの頻度と発生を決定することは、十分な生存可能な寄生虫がトランスフェクションに最適な段階にあることを保証するために重要です。未熟なシゾントは、赤血球の細胞内空間全体を埋めないメロゾイトが少ないことで、完全に成熟したシゾントと区別できます(図1B)。培養血液から血液塗抹標本を作成する場合、感染した赤血球が破裂し、血液塗抹標本中に遊離細胞外メロゾイトが観察される可能性があることに注意することが重要です(図1)。このようなメロゾイトは、ステップ2.5のシゾントの頻度の評価にはカウントされません。

蚊から唾液腺を除去することは、ユーザーが蚊の生理学や小規模な解剖に慣れていない場合、困難な場合があります。唾液腺を蚊から分離する際には、唾液腺の半透明を利用して、不透明な蚊の残骸と区別できることに注意してください(図2)。腺を破壊した後のスポロゾイトの計数は、400倍の倍率で最も効率的であり、位相差の使用により、.......

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ディスカッション

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私たちの研究室では、上記のプロトコルを使用して、トランスジェニック P.berghei 寄生虫の数系統を作成しました。 P. bergheiに最適化されていますが、このプロトコルを使用してトランスジェニックな P. yoelii sporozoitesを生成することにも成功しています。トランスフェクションしたシゾントをマウスに注入した後、寄生虫は通常、プラスミドなし対照を含むすべてのグループで遅くとも3d.p.i.以内に検出可能です。選択は、エレクトロポレーション後の寄生虫の生存率を確保するために、寄生虫血症が検出された場合にのみ開始されます。さらに、薬物選択の準備をする際には、ピリメタミンを完全に溶解させるために、塩酸で水を酸性化し、pHを4に下げる必要がある場合があります。プラスミドなし対照群からの寄生虫の完全な除去を期待していますが、トランスフェクタントを接種したマウスは感染したままです。対照マウスにおけるクリアランスは、典型的には、ピリメタミン処理の開始後5〜8日で起こる。注目すべきは、 P. berghei に感染したB6マウスは、実験的脳マラリアの徴候を.......

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開示事項

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著者らは、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

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この研究は、SPKにAI168307された国立衛生研究所の助成金によって支援されました。 UGA CTEGD Flow Cytometry Core と UGA CTEGD Microscopy Core に感謝します。また、プロトコルの最適化におけるAsh Pathak氏、Anne Elliot氏、UGA Sporocoreのスタッフの貢献にも感謝します。貴重な洞察、議論、そしてGFP11およびGFP1-10を含む親プラスミドについて、神山大地博士に感謝します。また、Kurupラボの方々のご支援、忍耐、励ましに心より感謝申し上げます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
30 G x 1/2 インチ シリンジ針エクセル インターナショナル26437
アルセバーのソリューションシグマ-アルドリッチA3551-500ML
アマクサ ベーシック パラサイト ヌクレオフェクター キット 2ロンザVMI-1021
アバーチン (2,2,2-トリブロモエタノール)TCI アメリカT1420
採血チューブBD バイオサイエンス365967血清採取用
Cチップディスポーザブル血球計算装置INCYTODHC-N01-5
CellVeiw 細胞培養ディッシュGreiner Bio-One627860
遠心分離機 5425エッペンドルフ5405000107
遠心分離機 5910Rッペンドルフ5910Rグラジエント遠心分離用
デルタビジョンII - 倒立顕微鏡システムオリンパスIX-71
ジメチルスルホキシドΣD5879-500ml
ウシ胎児血清GenClone25-525
GFP11 プラスミドKurup LabpSKspGFP11PL0017 プラスミド
Giemsa StainSigma-Aldritch48900-1L-F
Hepa GFP1-10 細胞Kurup LabHepa GFP1-10Hepa 1-6 細胞 (ATCC Cat#CRL-1830)
マウス血清蚊の解剖媒体に使用
NaClMillipore-SigmaSX0420-51.5 M および 0.15 M パーコール溶液用
Nucleofector IIAmaxa Biosystems (Lonza)
ペニシリン/ストレプトマイシンSigma-Aldritch に使用されるプログラム U-033P0781-100ML
Percoll (Density gradient stock medium)Cytivia17-0891-02プロトコルの詳細
PL0017 PlasmidBEI ResourcesMRA-786
ピリメタミン (経口投与用)Sigma46706準備の詳細: 17.5 mg のピリメタミンを 2.5 mL の DMSO に加えます。ボルテックス、必要に応じて完全に溶解します。HCLを使用して、225 mLのdH2OのpHを4に調整します。DMSO中のピリメタミンを水に加え、250mLにします。砂糖を10g加えて、薬物を飲んだ水の定期的な消費を促します。ピリメタミンは光に敏感です。マウスを治療するときは、暗いボトルまたはアルミホイルで覆われたボトルを使用してください。
RPMI 1640Corning15-040-CV
SoftWoRx顕微鏡ソフトウェアApplied Precisionv6.1.3
エRBC エレクトロポレーション パスツールピペット VWR 14673-043

参考文献

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  1. WHO. Geneva. World Health Organization. , 1(2020).
  2. Cowman, A. F., Healer, J., Marapana, D., Marsh, K. Malaria: biology and disease. Cell. 167 (3), 610-624 (2016).
  3. Crompton, P. D., et al.

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