方法論記事

虚血/再灌流研究における現在および新しい実験方法:最先端モデルから革新的な治療法まで

DOI：

10.3791/64995

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2023年2月10日

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1Department of Anesthesiology, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Anesthesiology, TVHS VA Medical Center, 3Department of Pharmacology, Vanderbilt University

この記事について

要約

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議論された記事:

Liepinsh, E., Kuka, J., Zvejniece, L., Vilskersts, R., Dambrova, M. 虚血再灌流後のデジタルマクロ写真のためのげっ歯類の心臓および脳組織の準備。視覚化された実験のジャーナル。(180)、E62942(2022)。

Paro, M. R., Mcgonnigle, M., Bulsara, K., Verma, R.マウスの中大脳動脈閉塞誘発性脳卒中後の脳脊髄筋神経血管症治療のモデル。視覚化された実験のジャーナル。(184)、E63951(2022年)。

Compton, T. et al. 虚血/再灌流障害の非熱赤外光治療とその後のマクロファージ分化の解析。視覚化された実験のジャーナル。(178)、E62908(2021)。

Lv, B. et al. マウスにおける心筋梗塞および心筋虚血再灌流障害の誘発.視覚化された実験のジャーナル。(179)、E63257(2022)。

Barajas, M. B., Levy, R. J. ランゲンドルフ製剤における新生児マウス心臓の使用のための修正技術。視覚化された実験のジャーナル。(181)、E63349(2022年)。

Li, Z., Hampton, M. J., Barajas, M. B., Riess, M. L. in vitroで心虚血/再灌流を模倣する細胞共培養モデルの開発.視覚化された実験のジャーナル。(176)、E62913(2021)。

Godoy, J. R., Watson, G., Raspante, C., Illanes, O.片側性腎虚血再灌流障害の効果的なマウスモデル。視覚化された実験のジャーナル。(173)、E62749(2021)。

編集記事

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組織虚血は臨床医学で頻繁に遭遇し、現在の研究の重要な焦点であり続けています。早くも 1880 年に、壊滅的な冠動脈閉塞が虚血の影響を実証するために使用されましたが、再灌流に関連する明確で個別の損傷が認められたのは最近になってからでした1.虚血/再灌流障害 (IRI) の研究は急速に成長しています。このコレクションでは、最先端のモデルからさまざまな前臨床モデルでの新しい治療法まで、この分野への重要な新しい追加に焦点を当てます。この編集は、基礎科学研究者にとって有用なツールをまとめたものです。たとえば、ここで提案されている脳または心臓の虚血モデルは、Liepinsh2 で記述された 2,3,5-トリフェニル-2H-塩化テトラゾリウム (TTC) 染色法を使用して画像化できます。同様に、Paro et al.3 と Compton et al.4 は、レーザー ドップラーを利用して、別々の組織における虚血状態と再灌流状態を確認します。

冠動脈閉塞は心臓突然死の主な原因です5.多くの in vivo モデルは、この損傷を非生理学的な方法で再現しようとします (例: 凍結アブレーションまたは焼灼による)。6 マイクロマニピュレーションを通じて、Lv ら 6 は、冠状動脈 IRI の低コストの再現性マウス モデルで、左前下行動脈 (LAD) が確実に結紮および再灌流できることを実証しました6。左心室は開胸術 によって 露出され、解剖顕微鏡により LAD の識別と動脈周囲の縫合糸の通過が可能になります。スリップノットは、可逆的な咬合に使用されます。トロポニン、心エコー検査、および TTC 染色を使用して IRI を定量化できます。このモデルは、この遺伝的に改変可能な種の治療から機構研究まで、幅広い用途があります。

脳卒中は 2 番目に多い死因であり、中大脳動脈 (MCA) 閉塞は脳卒中の最も一般的な形態です 7,8。現在、脳卒中の急性期後の回復に効果的な治療法が不足しています。血管の成長を促進し、必要な血液供給を戻すための以前のアプローチは、期待外れの結果をもたらしました。Paro et al.3 は、虚血性脳卒中の新しい治療法に現在の脳神経外科手術を適応させています3.この技術的アプローチでは、頸動脈から MCA に通される縫合糸モノフィラメントを使用して、血管内閉塞と再灌流が達成されます。血流の変化はレーザードップラーで確認します。次に、側頭筋を開頭術で回転させ、露出したMCA領域の脳表面に横たわる。この手順は、血管新生成長因子を調節し、虚血性病変内の新しい血管成長の密度の増加につながります。

in vivoからex vivoに移行し、Barajasら9は、定評のあるモデルであるランゲンドルフ心臓製剤を、新生児の発育中のマウス心臓9に使用するために拡張します。これにより、主要な発達時点における遺伝子改変可能な被験者の研究が可能になります。以前の発生研究は、大型動物に限定されていました。新生児の心臓は、代謝と生理学的および薬理学的 IRI 反応に違いを示します。この方法は、小児 IRI モデルの開発をサポートするだけでなく、長年の発達に関する問題に対処するのにも役立つ可能性があります。生まれたばかりのマウスの心臓は、バルーンで心臓の働きを測定するには小さすぎて、1895年にLangendorffによって記述された古典的なアプローチを表す心室頂点に取り付けられた力変換器を利用する必要があります10。

IRI 後の生存可能な組織領域、リスクのある組織領域、および壊死組織領域の質の高い評価は、介入を評価するために最も重要です。このような定量化は、上記の3つの記事に適用できます。このプロセスには多くのツールが存在します。しかし、エレガントでシンプルで安価な段階的な方法は、心臓と脳のためにLiepinshらによって 詳細に説明されています2。これは、 ex vivo および in vivo 研究者のツールボックスで有用な方法論です。組織の適切な取り扱いには、標準化された染色圧力と時間、および標準化された凍結と保管時間を確保することが含まれます。マクロ撮影の設定は手動で調整する必要があります。露出やホワイトバランスの誤り、ぼやけや反射などは、細かい設定で丁寧に防ぐことができます。

IRIに応答する細胞間シグナルは、物理的接触および互いにより長い距離の両方で、細胞タイプ間および細胞間で発生します11。Liら12 は、内皮-心筋細胞クロストークを可能にするが物理的に単離された細胞共培養を利用することにより、この現象を強調しています12。この方法により、単一細胞株の忠実度の高い in vitro 分析が可能になります。彼らの研究では、心筋細胞IRIの内皮細胞減衰の実証は、細胞間の距離に依存していました。これは、非混合共培養の明確な利点を示し、将来の研究者に物理的環境を制御することの重要性を強調しています。このモデルは、心臓内皮と心筋細胞の相互作用の調査にすぐに役立ちますが、他の組織と臓器の相互作用への拡張も可能です。

心臓および脳組織から移り、Compton et al.4 は、四肢 IRI に対する光線療法の効果を調査します4。決定的な最適な止血帯の膨張圧力や時間はなく、外科用止血帯による筋肉および神経細胞の損傷は十分に文書化されており、患者の罹患率につながる可能性があります13。著者らは、マウスのレーザードップラーで確認された片側性四肢虚血に対して止血帯を使用した臨床環境を模倣しています。彼らの研究では、虚血時間の1時間あたり5分間の近赤外線治療により、マクロファージの増殖、炎症マーカー、および組織壊死のレベルが変化しました。この臨床的に適用可能なモデルと非侵襲的治療は、「無血」の外科現場診療の現在の境界を拡張します。

心臓と脳に次いで、腎臓は最も研究されているIRI器官の1つです。腎臓は灌流不良に対して非常に敏感であり、Godoy et al.14 は、同じ手順がわずかに変更されたとしても、さまざまな病理学的状態につながる可能性があることを強調しています14。後腹膜アプローチを利用して腎椎弓根をわずか 30 分間露出させてクランプすると、重大な損傷につながります。再灌流時間の変化により、尿細管閉塞、尿細管拡張、好中球浸潤、さらには限局性線維症など、さまざまな回復状態と疾患を研究できます。このモデルは、比較のために対側腎臓を保存しており、特に腎臓と腎臓のクロストークに関連する損傷マーカーの特性評価に役立つ可能性があります。

要約すると、このIRIメソッドの編集は、 in vitro から ex vivo および in vivo モデルまで、さまざまな組織や製剤を利用する研究者に広く適用可能なツールボックスを提供します。手術技術の斬新な再考から実績のある方法の拡大まで、IRI 研究の確立された専門家は、斬新で最先端の調査ツールを提供します。ただし、これらの研究の共通点は、関連技術の開発を通じて臨床モデルへの翻訳性が向上したことです。止血帯による手術環境の模倣から MCA および LAD 閉塞まで、前臨床モデルの改善は間違いなく私たちの研究の将来の臨床応用に役立ちます。

開示事項

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著者らは開示するものは何もない。

謝辞

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私たちは、資金源に感謝したいと思います。米国退役軍人省生物医学研究所R&Dサービスからのメリットレビュー賞I01 BX003482、アメリカ心臓協会からのトランスフォーマティブプロジェクト賞962204、国立衛生研究所からの周術科学訓練賞5T32 GM108554、心臓血管麻酔科医協会からのスターターグラント、ヴァンダービルト大学医学部からの機関資金センター。

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jennings, R. B. Historical perspective on the pathology of myocardial ischemia/reperfusion injury. Circulation Research. 113 (4), 428-438 (2013).
  2. Liepinsh, E., Kuka, J., Zvejniece, L., Vilskersts, R., Dambrova, M. Rodent heart and brain tissue preparation for digital macro photography after ischemia-reperfusion. Journal of Visualized Experiments. (180), e62942(2022).
  3. Paro, M. R., Mcgonnigle, M., Bulsara, K., Verma, R. A model for encephalomyosynangiosis treatment after middle cerebral artery occlusion-induced stroke in mice. Journal of Visualized Experiments. (184), e63951(2022).
  4. Compton, T., et al. Non-thermal infrared light treatment of ischemia/reperfusion injury and subsequent analysis of macrophage differentiation. Journal of Visualized Experiments. (178), e62908(2021).
  5. Brown, J. C., Gerhardt, T. E., Kwon, E. Risk Factors For Coronary Artery Disease. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2022).
  6. Lv, B., et al. Induction of myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury in mice. Journal of Visualized Experiments. (179), e63257(2022).
  7. Ng, Y. S., Stein, J., Ning, M., Black-Schaffer, R. M. Comparison of clinical characteristics and functional outcomes of ischemic stroke in different vascular territories. Stroke. 38 (8), 2309-2314 (2007).
  8. Donkor, E. S. Stroke in the century: A snapshot of the burden, epidemiology, and quality of life. Stroke Research and Treatment. 2018, 3238165(2018).
  9. Barajas, M. B., Levy, R. J. Modified technique for the use of neonatal murine hearts in the Langendorff preparation. Journal of Visualized Experiments. (181), e63349(2022).
  10. Langendorff, O. Untersuchungen am überlebenden Säugethierherzen [Investigation of the living mammalian heart. Pflügers Arch. 61 (6), 291-332 (1895).
  11. Tirziu, D., Giordano, F. J., Simons, M. Cell communications in the heart. Circulation. 122 (9), 928-937 (2010).
  12. Li, Z., Hampton, M. J., Barajas, M. B., Riess, M. L. Development of a cell co-culture model to mimic cardiac ischemia/reperfusion in vitro. Journal of Visualized Experiments. (176), e62913(2021).
  13. Fitzgibbons, P. G., DiGiovanni, C., Hares, S., Akelman, E. Safe tourniquet use: A review of the evidence. Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 20 (5), 310-319 (2012).
  14. Godoy, J. R., Watson, G., Raspante, C., Illanes, O. An effective mouse model of unilateral renal ischemia-reperfusion injury. Journal of Visualized Experiments. (173), e62749(2021).

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