方法論記事

ハエの複眼の光学、生理学、生化学の研究方法

2023年3月24日

 , 
1Department of Medical Neurobiology, Faculty of Medicine and the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences (ELSC), Hebrew University

この記事について

要約

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議論された記事:

Muñoz Arias, M., Douglass, J. K., Wehling M. F., Stavenga, D. G. イエバエの複眼の視覚空間の自動チャート化.視覚化された実験のジャーナル。(181)、E63643(2022)。

Wagner, K., Smylla, T. K., Zeger, M., Huber, A. eGFPタグ付きタンパク質を用いたショウジョウバエ光受容体細胞の膜タンパク質輸送の研究.視覚化された実験のジャーナル。 (179)、E63375(2022)。

Gutorov, R., Katz, B., Minke, B. ショウジョウバエの光受容体における光色素レベルを測定するための電気生理学的方法.視覚化された実験のジャーナル。 (184)、E63514(2022年)。

Liu, J., Liu, Y., Chen, W., Ding, Y., Lan, X., Liu, W. 内因性ショウジョウバエ一過性受容体電位チャネルの精製.視覚化された実験のジャーナル。(178)、E63260(2021年)。

Panda, A., Thakur, R., Kumari, A., Raghu, P. 質量分析法を用いたショウジョウバエ光受容体の脂質シグナル伝達の分析.視覚化された実験のジャーナル。 (181)、E63516(2022年)。

編集記事

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ハエ複眼は、基本的な生体メカニズムを解明するための重要な生物学的モデルシステムです。このシステムを使用して研究されたメカニズムには、次のようなものがあります。ほぼパノラマの視野を持つ複眼視力1;光感受性Gタンパク質共役受容体の生物物理学、タンパク質集合、および生合成2,3,4;ホスホリパーゼCβを介したシグナル伝達システム5,6;天然組織におけるTRPチャネルの活性化と調節5,6;多タンパク質シグナル伝達複合体の集合と機能7,8;分子構造、生化学、およびイノシトール-リン脂質リサイクルの機能 9,10;シグナル伝達タンパク質のシグナル媒介細胞内転座11,12。ハエ複眼の独特の解剖学的構造と光学系は広く研究されており、基本的な発達メカニズムと視覚能力が明らかになっています。

この方法コレクションは、ハエ複眼における上記のメカニズムのいくつかを研究するための方法を開発および改良した一流の科学者の研究で構成されています。Muñozらは、複眼とその空間組織を正確に描写するフライアイの光学的配置を定量的に分析する方法を説明しています13。この方法は、視覚情報のニューロン処理を詳細に研究するために不可欠です。重要なことに、バイオインスパイアされた義眼を製造する多くの試みがあり、これらは既存の複眼の定量的研究に依存してきました。Wagnerらは、複眼の独特の光学現象である深い偽瞳孔と、角膜の光学的中和を伴う高増幅顕微鏡を利用して、 ショウジョウバエ の光受容体細胞内にeGFPタグ付きタンパク質を局在させます14。この方法により、光受容体の変性、重要なシグナル伝達タンパク質の細胞局在化および輸送による横紋肌の構造欠陥を検出できます。Gutorovらは、眼全体または単一の光受容体細胞からの電気生理学的測定を利用して、 in vivo での光色素状態のレベルと、シグナル伝達タンパク質の特定の変異によるそれらの調節を測定します15。この方法は、光子の吸収によって誘発される視覚的色素状態(R)内の電荷変位を利用し、暗闇でも安定した第2の色素状態(M)を形成します。追加の方法は、視覚色素の暗い双安定特性とハエのR状態とM状態の吸収スペクトルの違いを利用する、ライトオフ後の長時間の脱偏光(PDA)を使用します。PDAは大量の光色素の変換に依存しているため、光色素の生合成にわずかな欠陥があるだけでも、簡単に検出できる異常PDAにつながる可能性があります。実際、異常なPDAを示す ショウジョウバエ 変異体は、新しいシグナル伝達タンパク質の発見につながりました。この顕著な例は、足場タンパク質の不活性化からなるが、後電位Dはない(INAD)、眼特異的プロテインキナーゼC(eyePKC)、ホスホリパーゼCβ(PLCβ)、および一過性受容体電位(TRP)チャネル。初めて、Liuらはショ ウジョウバエ のTRPチャネル16を精製する技術を提示しました。この修正された親和性精製法は、INADシグナル伝達複合体の集合メカニズムに基づく競合戦略を使用します。この戦略により、内因性TRPチャネルの精製が可能になります。この方法によると、まずNiビーズに結合したPLCβフラグメントにヒスチジンをタグ付けし、 ショウジョウバエ の頭部ホモジネートから得られた内因性INADタンパク質複合体をプルダウンするために使用されます。次に、過度に精製されたグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)でタグ付けされたTRPフラグメントをNiビーズに添加して、INADに結合した内因性TRPチャネルと競合します。最後に、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、上清中のタグ付きTRPチャネルフラグメントを内因性TRPチャネルから分離します。Pandaらは、質量分析を使用してショ ウジョウバエ の光受容体細胞におけるいくつかのクラスの脂質を同定および定量する高感度技術を報告しています17。PLCβの活性化は、表面膜におけるホスファチジルイノシトール4,5二リン酸(PI(4,5)P2)の加水分解につながるため、光形質導入にとって重要です。この反応は最終的にTRPチャネルの活性化につながります。さらに、PLCβ活性は多くの脂質種の生成をもたらします。これらの脂質種のいくつかは、TRP活性化に関与し、感覚伝達を最適化するための光受容体の機能的構成において重要な役割を果たす可能性があることが提案されています。Panda et al.17 による研究では、これらの発見は、特定の脂質のレベルを制御する欠陥のある酵素を保有するショ ウジョウバエ 変異体を単離することによって評価されました。

ハエ複眼は、生物学の基本的なメカニズムを解明するための有用な実験システムです。ショウジョウバエ で開発された強力な遺伝学的方法論は、ハエの光伝達に関与するシグナル伝達タンパク質を分析および発見するために使用できます。この方法コレクションでは、複眼の解剖学的および光学的分析、光受容体細胞の分子成分および生化学反応など、ハエ視覚の基本的なメカニズムを調査するための主要な技術を詳細に概説しています。ビデオ記事には、これらの方法論に内在する困難に関する重要なアドバイスも含まれています。この方法の収集は、これらの技術を他の生物学的製剤に適応させる可能性があるため、この研究分野以外の科学者にとっても有益であるはずです。

開示事項

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著者は開示するものは何もありません。

謝辞

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著者は確認されていません。

参考文献

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  1. Douglass, J. K., Wehling, M. F. Rapid mapping of compound eye visual sampling parameters with FACETS, a highly automated wide-field goniometer. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 202 (12), 839-851 (2016).
  2. Xiong, L., et al. ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice. Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).
  3. Rosenbaum, E. E., et al. XPORT-dependent transport of TRP and rhodopsin. Neuron. 72 (4), 602-615 (2011).
  4. Vought, B. W., et al. Characterization of the primary photointermediates of Drosophila rhodopsin. Biochemistry. 39 (46), 14128-14137 (2000).
  5. Randall, A. S., et al. Speed and sensitivity of phototransduction in Drosophila depend on degree of saturation of membrane phospholipids. The Journal of Neuroscience. 35 (6), 2731-2746 (2015).
  6. Minke, B., Pak, W. L. The light-activated TRP channel: The founding member of the TRP channel superfamily. Journal of Neurogenetics. 36 (2-3), 55-64 (2022).
  7. Huber, A., et al. The transient receptor potential protein (Trp), a putative store-operated Ca 2+ channel essential for phosphoinositide-mediated photoreception, forms a signaling complex with NorpA, InaC and InaD. The EMBO Journal. 15 (24), 7036-7045 (1996).
  8. Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
  9. Raghu, P., Basak, B., Krishnan, H. Emerging perspectives on multidomain phosphatidylinositol transfer proteins. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (9), 158984(2021).
  10. Raghu, P., Yadav, S., Mallampati, N. B. Lipid signaling in Drosophila photoreceptors. Biochimica et Biophysica Acta. 1821 (8), 1154-1165 (2012).
  11. Bahner, M., et al. Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current. Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).
  12. Schopf, K., Huber, A. Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells. European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).
  13. Muñoz Arias, M., Douglass, J. K., Wehling, M. F., Stavenga, D. G. Automated charting of the visual space of housefly compound eyes. Journal of Visualized Experiments. (181), e63643(2022).
  14. Wagner, K., Smylla, T. K., Zeger, M., Huber, A. Studying membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells using eGFP-tagged proteins. Journal of Visualized Experiments. (179), e63375(2022).
  15. Gutorov, R., Katz, B., Minke, B. Electrophysiological methods for measuring photopigment levels in Drosophila photoreceptors. Journal of Visualized Experiments. (184), e63514(2022).
  16. Liu, J., Liu, Y., Chen, W., Ding, Y., Lan, X., Liu, W. Purification of endogenous Drosophila Transient Receptor Potential channels. Journal of Visualized Experiments. (178), e63260(2021).
  17. Panda, A., Thakur, R., Kumari, A., Raghu, P. Analysis of lipid signaling in Drosophila photoreceptors using mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (181), e63516(2022).

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