方法論記事

68ガリウム標識D-ペプチドPETトレーサーの開発によるプログラム死リガンド1発現イメージング

DOI：

10.3791/65047

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2023年2月3日

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1Department of Nuclear Medicine, Nanjing First Hospital, Nanjing Medical University, 2State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 3Department of Advanced Nuclear Medicine Sciences, Institute for Quantum Medical Science, National Institutes for Quantum Science and Technology, 4Department of Pharmacy, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

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この記事について

サマリー

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本研究では、[68Ga] D-ドデカペプチド拮抗薬の陽電子放出断層撮影法に基づき、プログラムされたデスリガンド1の全身分布を評価するための非侵襲的かつリアルタイムな方法を開発しました。この技術は、従来の免疫組織化学よりも利点があり、免疫チェックポイント遮断療法の恩恵を受ける適切な患者を特定する効率を向上させます。

要約

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近年、プログラム細胞死タンパク質1(PD-1)/プログラム死リガンド1(PD-L1)に基づく免疫チェックポイント遮断療法の開発は、がん治療に革命をもたらしました。しかし、腫瘍細胞におけるPD-L1の発現が不均一であるため、PD-1/PD-L1阻害剤に反応する患者はごくわずかです。この不均一性は、一般的に使用される免疫組織化学(IHC)アプローチによる腫瘍細胞の正確な検出における課題を提示します。この状況では、治療効果を改善するために、免疫チェックポイント遮断療法の恩恵を受ける患者を層別化するためのより良い方法が必要です。陽電子放射断層撮影法(PET)は、全身のPD-L1発現を非侵襲的にリアルタイムに可視化することができます。そのため、PETイメージングにより腫瘍中のPD-L1分布を検出するための放射性標識トレーサーの開発が求められています。

デキストロロータリー(D)-ペプチドは、L型ペプチドと比較して、タンパク質分解耐性や代謝半減期の長期化などの特性を持っています。本研究では、担がんマウスにおけるD-ドデカペプチド拮抗薬(DPA)である 68個のGa標識PD-L1標的D-ペプチドのPETイメージングに基づいて、PD-L1発現を検出する新しい方法を設計しました。その結果、[68Ga]DPAは in vivoでPD-L1過剰発現腫瘍に特異的に結合し、良好な安定性と優れたイメージング能力を示し、[68Ga]DPA-PETが腫瘍におけるPD-L1状態の評価に有望なアプローチであることが示唆されました。

概要

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免疫チェックポイント蛋白質の発見は、腫瘍治療におけるブレークスルーであり、免疫チェックポイント遮断療法の開発に大きな進歩をもたらしました1。プログラム細胞死タンパク質1(PD-1)およびプログラム死リガンド1(PD-L1)は、食品医薬品局(FDA)によって承認されたいくつかの抗体を持つ潜在的な創薬標的です。PD-1は、CD4+、CD8+ T細胞、制御性T細胞などの腫瘍浸潤免疫細胞によって発現されます。PD-L1はPD-1リガンドの1つであり、さまざまな腫瘍細胞で過剰発現しています2,3。PD-1とPD-L1の相互作用によりPD-1が不活性化され、抗腫瘍免疫応答が抑制される4。これらの知見は、PD-L1を阻害することで免疫細胞の殺傷効果を高め、腫瘍細胞を排除できることを示唆している5。現在、発色性免疫組織化学(IHC)は、免疫チェックポイント療法に反応する可能性が最も高い患者を特定するために最も一般的に使用されているアプローチです6,7。しかし、腫瘍細胞におけるPD-L1の発現は不均一であるため、生検によるIHCの結果は、患者のPD-L1発現に関する正確な情報を提供することはできません8。以前の研究では、患者の20%〜40%のみが免疫チェックポイント遮断療法から長期的な利益を得ることが報告されています1,9,10。したがって、これらの免疫チェックポイントタンパク質の不均一な発現によって引き起こされる偽陰性の結果を回避するための新しい方法の開発が急務です。

陽電子放射断層撮影法(PET)などの分子イメージング技術は、非侵襲的に全身をリアルタイムに可視化できるため、従来のIHC法を凌駕することができます11,12,13。放射性標識抗体、ペプチド、および低分子は、がん患者におけるPD-L1発現をモニタリングするための有望なトレーサーです14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25.FDAは、アベルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブの3つのPD-L1治療用モノクローナル抗体を承認しています26。これらの抗体に基づく免疫PETトレーサーは、十分に文書化されています27、28、29、30、31、32。初期段階の臨床試験では、薬物動態が好ましくないため、臨床応用の価値が限られていることが明らかになっています30。抗体と比較して、ペプチドは健康な臓器からの血液や臓器のクリアランスが速く、化学的に容易に修飾することができる33。PD-1/PD-L1に高い親和性を持つ複数のペプチドが報告されています2;WL12は、PD-L134に特異的結合を示す報告済みのペプチドである。放射性標識トレーサーである[64Cu]WL12、[68Ga]WL12、および[18F]FPyWL12は、in vivo特異的な腫瘍標的化能力が高いことが報告されており、腫瘍26、35、36、37におけるPD-L1発現の高品質画像の収集が可能です。さらに、放射性標識WL12の最初のヒト内評価は、[68Ga]WL12(NOTAによってキレート化)が臨床腫瘍画像化のための安全で効率的な可能性を有することを実証した38。WL12は疎水性が高く、健康な肝臓への取り込みが多いため、臨床使用は限られています。PD-L1に特異的に結合するTPP1やSETSKSFなどの他の放射性標識ペプチドも、全身のPD-L1発現を可視化するための潜在的な安定性と特異性を示しています39,40。しかし、未修飾のペプチドはプロテアーゼによって容易に分解され、腎臓によって急速に代謝されます。デキストロロタリー(D)ペプチドは、左利き(L)ペプチドの安定性が低いため、効果的なメディエーターとして広く使用されています41,42,43。D-ペプチドはタンパク質分解に対して非常に耐性があり、代謝半減期が著しく長くなります。L-ペプチドと比較して、D-ペプチドは主に特異的結合能力を示します44,45,46。

本研究は、担がんマウスモデル47において、 68Ga標識PD-L1標的D-ペプチド、D-ドデカペプチド拮抗薬(DPA)のPETイメージングに基づいて、PD-L1発現を検出する新しい方法を設計した47。[68Ga]DPAの安定性は、最初にリン酸緩衝生理食塩水(PBS)とマウス血清で研究され、その後、PD-L1過剰発現腫瘍における[68Ga]DPAの結合親和性がテストされました。その後、膠芽腫異種移植モデルでPETイメージングを行い、[68Ga]DPAが腫瘍におけるPD-L1発現をモニターするのに理想的なPETトレーサーであるかどうかを確認しました。PETイメージングとDPAの組み合わせは、PD-L1の不均一な発現に関連する課題を克服するための新しいアプローチを提供するだけでなく、D-ペプチドベースの放射性トレーサーの開発の基礎を築きます。

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プロトコル

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動物実験手順は、南京医科大学の動物倫理委員会または国立量子科学技術研究所によって承認されました。マウス実験は、実験動物管理委員会の制度的ガイドラインに従って厳格に行われました。

1. ペプチド合成

  1. 100 mg の 4-メチルベンズヒドリルアミン (MBHA) 樹脂 (負荷量 0.37 mmol/g) を 1 mL の N-メチル-2-ピロリドン (NMP) 中で 30 分間、穏やかな N2 バブリング下で 30 分間膨潤させます。
  2. FMP1 mL中にFmoc保護アミノ酸(5.0当量)、HCTU(4.9当量)、DIPEA(10.0当量)からなるフレッシュストックバッファーを調製し、樹脂(100 mg)に添加します。カップリング反応を1.5〜2時間進行させます。
  3. NMP中に50%(vol/vol)モルホリンからなる脱保護緩衝液を調製します。レジン(100 mg)を1 mLの脱保護バッファーで2 x 30分間洗浄し、アミン基のFmoc基を除去します。レジンをジクロロメタン(DCM;1 mL)で1分間洗浄し、DCMを除去し、NMP(1 mL)でさらに1分間再洗浄します。次に、NMPを除去し、DCMで1分間レジンを再洗浄します。
    注意: すべての洗浄手順は、マイルドなN2 バブリング下で行われます。上記の手順を最後のアミノ酸まで繰り返します。
  4. 1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-四酢酸(DOTA)をペプチドに添加するには、 N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N-エチルカルボジイミド塩酸塩(EDC·HCl)および N-ヒドロキシコハク酸イミド(NHS)。Incubate the stock buffer of DOTA/EDC·モル比 1:1:1 のモル比でジメチルスルホキシド (DMSO) 中で 3 時間、最終 DOTA 濃度 1 M の HCl/NHS。次に、ストックバッファー(1 mL)を樹脂(100 mg)に加え、穏やかなN2 バブリングで2時間反応を進行させます。
    注:1,4,7-トリアザシクロノナン-1,4,7-トリアチン酸(NOTA)は、 68Ga錯体のキレート剤としても利用できます。NOTAカップリングにも同じ手順を使用できます。
  5. DCMで上から樹脂をすすぎ、真空をかけると残留反応液が同時に除去されます。DCM(1.5 mL)で樹脂を3回すすぎ、MeOH(1.5 mL)でリンスして樹脂を収縮させます。レジンが乾くまで、レジンを窒素下に一晩、または高真空下に4時間以上置きます。
  6. 乾燥したDPAペプチド含有樹脂をスクリューキャップ付きの2 mLポリプロピレン製容器に入れます。適切な切断カクテル(容量95/2.5/2.5 TFA/TIS/H2O、樹脂1 mL/100 mg)を加え、スクリューキャップを使用して容器をしっかりと密封します。ドラフト内のオービタルシェーカーで20〜25°Cで2時間静かに攪拌します。
    注意: トリフルオロ酢酸(TFA)は腐食性が高いため、防護服を着用してドラフト内で調製してください。
  7. ドラフト内の窒素下で蒸発させることにより、TFAの大部分を除去します。ジエチルエーテル(~1.5 mL/100 mgの樹脂)を添加してペプチドを沈殿させます。
  8. 混合物をボルテックスしてペプチドを粉砕し、室温(10,000 × g、5分)で遠心分離します。容器から溶剤を慎重に注ぎます。手順1.7〜1.8を繰り返します。
  9. 開いた容器で残留物を10分間風乾します。50%(vol/vol)のアセトニトリル水溶液を添加し、1〜2秒間ボルテックスして生成物(1 mL/100 mgの樹脂)を溶解します。
  10. 混合物を濾過してレジンを除去し、0.2 mLの50%(vol/vol)アセトニトリル水溶液を使用してレジンを2回洗浄します。高速液体クロマトグラフィー(HPLC)精製用の濾液を混合します。以下のHPLC条件をご使用ください。カラム:YMC-Triat-C18(内径4.6 mm、150 mm、5 mm);溶媒勾配:溶媒A-脱イオン水;溶媒B-アセトニトリル(0.1%TFA);流動時間:20分、アセトニトリルで10%から90%。流速:1mL/分
  11. 採取したHPLC溶離液を-80°Cで一晩凍結し、凍結乾燥(-50°C、<1 pa)します。放射性標識の場合は、固体ペプチドを酢酸ナトリウム緩衝液(100 mM、pH 5.0)に最終濃度1 mg/mLでストック緩衝液として溶解します。

2. 68Gaの放射性標識

注 68Gaは、南京第一病院(中国・南京市)の院内製で、 68Ge/68Ga発生装置を用いて生成した。

  1. 5 μLのストックバッファーをスクリューキャップ付きの1.5 mLポリプロピレン製容器にピペットで移します。容器に200 MBq [68Ga]GaCl3 (400 μL)を添加します。
  2. 混合物を5秒間ボルテックスします。pHテストストリップを使用してpHを測定します。NaOH(0.1 M)でpHを4〜4.5に調整します。
    注:適切なpHは、 68GaとDOTAの間の錯体形成にとって重要です。
  3. 溶液を室温で5〜10分間インキュベートします。反応混合物を放射性HPLCにかけ、以下の条件下で放射性標識収率分析を行います:カラム:YMC-Triat-C18(内径4.6 mm、150 mm、5 mm)。溶媒勾配:溶媒A-脱イオン水;溶媒B-アセトニトリル(0.1%TFA);流動時間:20分、アセトニトリルで10%から90%。流速:1mL/分
    注:放射性薄層クロマトグラフィー(TLC)は、放射性標識の収率を調べるための代替アプローチとして使用できます。推奨されるTLC溶出緩衝液は、0.1 M Na3C6H5O7、pH 4です。

3. トレーサー安定性試験

  1. PBSにおけるトレーサー安定性試験
    1. PBS(990 μL)に [68Ga]DPA(10 μL、3.7 MBq、NaOAc)を添加します。37°Cで1時間、2時間、4時間、わずかに撹拌しながらインキュベートします。
    2. 各時点で200μLの溶液を回収します。分析のためにラジオHPLCに注入します。
  2. マウス血清中のトレーサー安定性
    1. [68Ga]DPA(10 μL、~3.7 MBq、NaOAc中)をマウス血清(90 μL、新たに調製)に加えます。37°Cで1時間、2時間、4時間、わずかに撹拌しながらインキュベートします。
    2. 各時点で20 μLの溶液を回収します。MeCNと水(100 μL、1:1、v/v)を加えます。
    3. 混合物を10分間遠心分離します(5,000 × g、25°C)。上清をラジオHPLCで分析します。

4. フローサイトメトリーによるPD-L1発現の解析

  1. RPMI-1640培地に10%(vol/vol)のウシ胎児血清と1%ペニシリン-ストレプトマイシン(vol/vol)を添加して培地を調製します。U87MG細胞を培地に再懸濁し、105 細胞/ウェルの密度で12ウェルプレートに播種します。細胞をインキュベーター(5%CO2、37°C)に入れ、乱さずに少なくとも24時間培養します。
  2. 細胞を0.5 mLのPBSで洗浄し、250 μLのトリプシン-EDTA(0.25%)を添加します。細胞をインキュベーター(5% CO2、37°C)に2分間戻します。
  3. 1 mLの培地を加えて、細胞の解離を停止します。細胞に培地を添加し、ピペッティングで上下させて皿から分離し、1.5 mLチューブに集めます。細胞を5分間遠心分離します(100×g)。
  4. 上清を除去し、細胞を1 mLのPBSに再懸濁します。細胞を5分間遠心分離します(100× g)。この手順をもう一度繰り返します。
  5. フルオレセインイソチオシアネート(FITC)標識PD-L1抗体を3%ウシ血清アルブミン(BSA)で20 nmol/Lに希釈します。 細胞に添加し、4°Cで1時間インキュベートします。
  6. 細胞を5分間遠心分離(100× g)した後、冷たいPBSで2回洗浄します。PD-L1陽性細胞をフローサイトメーターと解析ソフトウェアを用いて解析します。

5. 免疫細胞化学

  1. U87MG細胞をガラス底の細胞培養皿(35 mm)に2.5 × 105個の細胞 の密度で播種します。60%のコンフルエントに達したら、培地を吸引し、PBSを1 mL添加します。静かに数回振って吸引します。洗浄ステップを3回実行します。
  2. 500μLの4%パラホルムアルデヒドを皿に加えます。セルを室温に置き、30分間固定します。
  3. 細胞をPBSで3回洗浄します。1 mL の 3% BSA(wt/vol、PBS 中)を加え、固定細胞を室温で 2 時間ブロッキングします。
  4. 3% BSAを除去し、一次抗PD-L1抗体(mAb、1:100、3% BSAで希釈)とともに細胞を直接インキュベートし、4°Cで一晩インキュベートします。
    注:BSAで細胞をブロックした後は、PBSで洗浄しないでください。
  5. 細胞を3%BSA緩衝液で3回洗浄します。FITC標識抗ヒトIgG Fc二次抗体(1:500、PBSで希釈)と細胞を1時間インキュベートします。
  6. 細胞をPBSで3回洗浄します。0.5 mLのDAPI(1 μg/mL)を細胞に加え、室温で1時間インキュベートします。染色した細胞をPBSで3回洗浄し、共焦点蛍光顕微鏡で観察します。

6. 細胞の取り込み・阻害実験

  1. 細胞取り込み実験
    1. U87MG細胞を12ウェルプレートで80%のコンフルエントに達するまで培養します。培地を取り除き、0.5 mLのPBSで細胞を洗浄します。
    2. [68Ga]DPAを新鮮な培地で74 KBq/mLの濃度に希釈します。希釈した[68Ga]DPAバッファー0.5 mLを各ウェルに加えます。
    3. 細胞を[68Ga]DPAで37°Cで異なる時間(10分、30分、40分、120分)インキュベートします。ピペットを使用して培地を吸引します。細胞をPBS(0.5 mL)で3回洗浄します。
    4. NaOH溶液(0.5 M、ウェルあたり300 μL)を添加して細胞を溶解します。30秒後、粘性細胞ライセートを1.5 mLチューブに回収します。
    5. プレートを0.4 mLのPBSで2回洗浄します。洗浄液を上記の1.5mLチューブに集めます。
    6. 自動ガンマカウンターの内蔵コンピューターを起動します。チューブを内蔵棚に入れます。すべてのサンプルをコンベアにセットしたら、STARTボタンを押します。結果は内部ソフトウェアで計算されます。読み出しには、各チューブの毎分(CPM)の減衰相関カウントが記録されます。
  2. 競合結合アッセイ
    1. U87MG細胞を12ウェルプレートで80%のコンフルエントに達するまで培養します。培地を取り除き、0.5 mLのPBSで細胞を洗浄します。
    2. [68Ga]DPAを新鮮な培地で74 KBq/mLの濃度に希釈します。適量のBMS202化合物を10%DMSOに溶解し、10 mMの濃度(400 μL)にします。
    3. 4 μL の 10 mM BMS202 を 396 μL の PBS で希釈し、濃度 100 μM にします。 このステップを繰り返して、さまざまな濃度の BMS202(1 μM、10 nM、100 pM、1 pM)を得ます。
    4. 希釈した[68Ga]DPAバッファー0.5 mLを各ウェル(ウェルあたり0.37 MBq)に添加します。5 μL の BMS202 溶液を各ウェル(各濃度に 3 つのウェル)に加えます。細胞インキュベーター内で37°Cで120分間インキュベートします。
    5. ピペットを使用して培地を吸引します。細胞を 3 x 0.5 mL の PBS で洗浄します。
    6. NaOH溶液(0.5 M、ウェルあたり300 μL)を加えて細胞を溶解します。30秒後、粘性細胞ライセートを1.5 mLチューブに回収します。プレートを 2 x 0.4 mL の PBS で洗浄します。
    7. 洗浄液を上記の1.5mLチューブに集めます。チューブを自動ガンマカウンターの内蔵棚に入れます。
    8. 手順 6.1.6 と同じ手順に従います。

7. PETイメージング

注:0.796 mm間隔(中心から中心)に159の横方向の軸断面を提供し、水平視野10 cm、軸方向視野12.7 cmのマイクロPETスキャナーを使用して、小動物PETイメージングを実行します。リストモードで収集されたすべてのデータは、3次元サイノグラムに編成されます。次に、フーリエは2次元サイノグラムに再構成されます(フレーム×分:4 × 1、8 × 2、8、× 5)。

  1. この研究では、5〜8週齢の雄のBALB / Cヌードマウスを使用します。ステップ4.1〜4.4に従ってU87MG細胞を回収し、細胞を0.5 mLシリンジに吸引します。細胞をマウスに皮下注射する(1腫瘍あたり1×106 細胞、マウス1匹あたり2つの腫瘍)。腫瘍の体積が100〜300 mmになるまで、注射後の腫瘍の成長を監視します3。
  2. 1%-2%(v / v)イソフルラン(1 mL / min)を使用してマウスを麻酔します。.加熱装置の電源を入れ、PETの動物床を37°Cに保ちます。
  3. 麻酔をかけたマウスをPET装置の動物用ベッドの正しい位置に置きます。乾燥を防ぐために両目に眼軟膏を塗ります。
    注意: スキャン中にマウスが死なないように、マウスをうつ伏せの位置に置いてください。イメージングプロセス全体を通して、事前に取り付けられたチューブを使用して鼻 から イソフルラン流量(1.0 mL/分)を投与します。
  4. コントロールパネル から 動物のベッドの位置を調整します。トレーサー(10-17 MBq/100-200 μL)を、あらかじめ取り付けられた尾静脈カテーテルから静脈内注射します。
  5. 参照ソフトウェアを使用して、ホストコンピュータでスキャンワークフローを作成します( 材料表を参照)。 スタディフォルダを作成し、メーカーのプロトコルに従って取得プロトコルを設定します。 3Dリストモードですべてのマウスに対して動的スキャン(マウスごとに60分)を実行します。
  6. ヒストグラムプロトコルと再構成プロトコルをメーカーのプロトコルに従って定義します。ナイキストカットオフが0.5サイクル/ピクセルのハニングフィルターを使用して、フィルターバックプロジェクションでPET動的画像(25〜30分および55〜60分)を再構成します。すべてのマウスの最大強度投影 (MIP) イメージを生成します。
  7. ワークフロー内のプロトコルを結合し、ワークフローを実行します。得られた3次元画像を、メーカーのプロトコルに従って、ソフトウェアを使用して解析します。
    注: シミュレーション ソフトウェアを使用して、目的のボリュームを選択します。放射能は注射時間に合わせて崩壊補正され、総注入線量/グラム組織あたりのパーセンテージ(%ID / g)として表示されます。.

8. 生体外で の生体内分布

  1. 尾静脈注射により、U87MG含有BALB/Cヌードマウスに[68Ga]DPA(1.85 MBq/100 μL)を投与する。1%-2%(v / v)イソフルラン(1 mL / min)を使用してマウスを麻酔し、注射後に子宮頸部脱臼を介して3匹のマウスを5、30、60、および120分間犠牲にします。.
    注:この手順を実演する個人は、意識喪失が急速に誘発されるように、子宮頸部脱臼の技術的スキルの訓練を受ける必要があります。これにより、この実験における安楽死の手続きがすべて人道的に行われることが保証されます。
  2. 死亡が確認されたら、マウスの胸壁を開きます。そして、心を開いてください。1 mLのシリンジを使用して採血します。シリンジからガンマカウンター用のラジオイムノアッセイ(RIA)チューブ(直径13 mm)に血液を絞ります。.
  3. 主要な臓器と腫瘍を切除し、ガンマカウンター用のRIAチューブ(直径13 mm)に入れます。主な臓器には、総血液、心臓、胸腺、肝臓、脾臓、骨、胃、腎臓、筋肉、腸リンパ節、小腸、膵臓、精巣、脳、肺などがあります。すべての臓器の重さを量ります。
  4. 採取した臓器内の放射能をオートガンマカウンターで測定し、その値を減衰補正します。ウェットティッシュのグラムあたりの注射用量のパーセンテージ(%ID / g)を計算します。.

9. 免疫組織化学

  1. 神経膠腫組織を採取し、PBSで3回洗浄します。新鮮な組織を4%パラホルムアルデヒドに入れ、4°Cで一晩固定します。
  2. 固定組織をパラフィンに包埋し、厚さ10μmに切片します。切片をインキュベーター(60°C)に入れ、2時間インキュベートします。キシレン(2回)、無水アルコール、95%アルコール、90%アルコール、80%アルコール、75%アルコールでそれぞれ10分間インキュベートすることにより、切片を脱ワックスして水和させます。
  3. 切片を0.01 Mクエン酸ナトリウムに入れ、92〜95°Cに加熱します。 40分間温度を維持して、抗原賦活化を実現します。
  4. 200μLのH2O2 溶液(3%)を切片に加え、室温で10分間エンドペルオキシダーゼを不活性化する。室温で2時間3%BSAで処理することにより、非特異的部位を遮断します。
  5. 一次抗PD-L1抗体(モノクローナル抗体、1:100、3% BSAで希釈)中の切片を4°Cで一晩インキュベートします。
    注:BSAでブロッキングした後は、PBSで洗浄しないでください。
  6. 切片をPBSで3回洗浄します。切片をHRP標識ヤギ抗ウサギ二次抗体(1:500、PBSで希釈)とともに室温で1時間インキュベートします。
  7. 細胞をPBSで3回洗浄します。200 μLの3,3-ジアミノベンジジン(DAB)ワーキング溶液(溶液A:溶液B:溶液C = 1:1:18)を切片に加え、暗所で5分間インキュベートします。
  8. 切片をPBSで3回洗浄します。500μLのヘマトキシリン溶液(100%)を加え、室温で5分間インキュベートします。切片を水で30秒間洗浄します。切片を分化溶液(75%アルコール:HCL = 99:1)に30秒間入れます。水で1分間切片を洗います。
  9. アルコール75%、アルコール80%、アルコール90%、アルコール95%、無水アルコール、キシレン(各10分)で順次インキュベートして、サンプルを脱水します。すべての切片を中性樹脂で取り付け、光学顕微鏡で観察します。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

[68Ga]DPA放射性標識と安定性
モデルペプチドであるDPAは、PD-L1アンタゴニストとして有効です。DOTA-DPAは、純度>95%、収率68%で得られました。DOTA-DPAの質量は1,073.3([M + 2H] 2 +)で実験的に観察されます。 68名ガリウムは、PETイメージング用のペプチドを標識するのに適した放射性核種であると考えられるため、この研究に選ばれました。DPA を 68Ga(半減期:68 分)で放射性標識するために、DOTA-PEG3-DPA を合成しました(図 1A)。DOTAは、 68Ga放射性標識のキレート剤として使用されました。DOTAとDPAの間隔を空けるために、PEG3をリンカーとして使用しました。[68Ga]-DOTA-PEG3-DPA(次のテキストでは[68Ga]DPA...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この方法で説明する重要なステップには、 68GaからDPAへの効率的な標識と、腫瘍内のDPAの薬力学的パターンと完全に一致するPETイメージングに適した時間枠の選択が含まれます。

IHCとは対照的に、PETイメージングは、全身のPD-L1発現を非侵襲的にリアルタイムに検出することを可能にし、不均一な腫瘍における各陽性領域の可視化を可能にします6,7。ペプチドは、抗体や低分子の欠点を回避するためにリガンドとして選択されました。分子量の大きい抗体は一般に循環半減期が長いため、健康な臓器に対する毒性が高くなります。通常、低分子のクリアランスは速すぎて必要な腫瘍保持を達成できません。ペプチドの分子量は、抗体と低分子の分子量の範囲です。これにより、ペプチドベースの放射性トレーサーは、最小限の毒性で長期的な腫瘍保持と良好な組織浸透の両方を達成することができます13,49,50,51,52,53。

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開示事項

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競合する利害関係は宣言されていません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究は、中国医学院非営利中央研究所基金(no. 2022-RC350-04)およびCAMS Innovation Fund for Medical Sciences(nos. 2021-I2M-1-026, 2022-I2M-1-026-1, 02120101, 02130101, and 2022-I2M-2-002)の支援を受けて行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトラ酢酸 (DOTA)メルク60239-18-168Ga  キレート化
3,3-ジアミノベンジジン (DAB) キットSigma-AldrichD7304-1SET免疫組織化学
抗PD-L1モノクローナル抗体武漢プロテインテック17952-1-ap免疫組織化学: 一次抗体
BMS202Selleck1675203-84-5競合的結合アッセイ: 阻害剤
BSAMerckV900933Immunofluorescent : ブロッキング 
DAPIメルクD9542免疫蛍光:ジ
クロロメタン核の染色 (DCM)メルク34856溶媒
DIPEAメルク3439ペプチドカップリング
EDC·HClMerckE6383Activation of DOTA
FBSGibco10099細胞培養:サプリメント
FITC-conjugated anti-human IgG Fc AntibodyBiolegend409310免疫蛍光:二次抗体
FITC-conjugated anti PD-L1 antibodyBiolegend393606Flow cytometry:直接抗体
HCTUEnergy ChemicalE070004-25gペプチドカップリング
HRP標識ヤギ抗ウサギ抗体ServicebioGB23303免疫組織化学:二次抗体
ヒドロキシスクシンイミド(NHS)メルク130672DOTA
MeCNメルクPHR1551溶媒
モルフォリンメルク8.06127Fmoc-脱保護
NMPメルク8.06072Solevent
Paraホルムアルデヒドメルク30525-89-4組織の固定
PBSGibco10010023細胞培養: 緩衝剤
ペニシリン-ストレプトマイシン Gibco10378016細胞培養:サプリメント
RIA チューブPolyLabP10301A組織サンプル容器として
RPMI-1640 培地Gibco11875093細胞培養:塩基性培地
酢酸ナトリウムメルク1.06264緩衝液用塩
トリプシン-EDTAGibco25200056細胞培養:解離剤
U87MG細胞株Procell Life Science &Technology CoCL-0238Cell model
Equipment
68Ge/68Ga generatorIsotope Technologies Munich, ITM該当なし[68Ga]Autogamma
counterPerkin Elmer Wizard2放射能の検出
共焦点蛍光顕微鏡キーエンス免疫蛍光結果の観察
フローサイトメーターBecton Dickinson, BDLSRIIPD-L1陽性細胞のモニタリング
高速液体クロマトグラフィー(HPLC)島津製作所 LC-20AT DPAペプチドの精製
PETスキャナーSiemens Medical SolutionsInveon MultiModality SystemPETイメージング
光学顕微鏡ニコン Eclipse E100免疫組織化学結果の観察
固相ペプチド合成装置Promega Vac-Man Laboratory 真空マニホールドLOT#11101DPA-DOTAペプチド
の合成Software>
ASIProSiemens Medical Solutions該当なしPET-CT結果の解析
FlowJoBecton Dickinson, BDFlowJo 7.6.1フローサイトメーターの結果の分析
Inveon Acquisition Workplace (IAW)Siemens Medical Solutions該当なしPETメカインの管理
プリズムグラフパッドプリズム8.0データの分析 
の活性化

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Doroshow, D. B., et al. PD-L1 as a biomarker of response to immune-checkpoint inhibitors. Natire Reviews Clinical Oncology. 18 (6), 345-362 (2021).
  2. Krutzek, F., Kopka, K., Stadlbauer, S. Development of radiotracers for imaging of the PD-1/PD-L1 axis. Pharmaceuticals. 15 (6), 747(2022).
  3. Topalian, S. L., Drake, C. G., Pardoll, D. M. Immune checkpoint blockade: a common denominator approach to cancer therapy. Cancer Cell. 27 (4), 450-461 (2015).
  4. Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 12 (4), 252-264 (2012).
  5. Xiao, Z., et al. PEIGel: A biocompatible and injectable scaffold with innate immune adjuvanticity for synergized local immunotherapy. Materials Today Bio. 15, 100297(2022).
  6. Teng, M. W. L., Ngiow, S. F., Ribas, A., Smyth, M. J. Classifying cancers based on T-cell infiltration and PD-L1. Cancer Research. 75 (11), 2139-2145 (2015).
  7. Dolled-Filhart, M., et al. Development of a companion diagnostic for pembrolizumab in non-small cell lung cancer using immunohistochemistry for programmed death ligand-1. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 140 (11), 1243-1249 (2016).
  8. Meng, X. J., Huang, Z. Q., Teng, F. F., Xing, L. G., Yu, J. M. Predictive biomarkers in PD-1/PD-L1 checkpoint blockade immunotherapy. Cancer Treatment Reviews. 41 (10), 868-876 (2015).
  9. Hakozaki, T., Hosomi, Y., Kitadai, R., Kitagawa, S., Okuma, Y. Efficacy of immune checkpoint inhibitor monotherapy for patients with massive non-small-cell lung cancer. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 146 (11), 2957-2966 (2020).
  10. Haslam, A., Prasad, V. Estimation of the percentage of US patients with cancer who are eligible for and respond to checkpoint inhibitor immunotherapy drugs. Jama Network Open. 2 (5), 192535(2019).
  11. Willmann, J. K., van Bruggen, N., Dinkelborg, L. M., Gambhir, S. S. Molecular imaging in drug development. Nature Reviews Drug Discovery. 7 (7), 591-607 (2008).
  12. Zhang, L., et al. Recent developments on PET radiotracers for TSPO and their applications in neuroimaging. Acta Pharmaceutica Sinica B. 11 (2), 373-393 (2021).
  13. Sun, J., et al. Imaging-guided targeted radionuclide tumor therapy: From concept to clinical translation. Advanced Drug Delivery Reviews. 190, 114538(2022).
  14. Xu, M., et al. Preclinical study of a fully human Anti-PD-L1 antibody as a theranostic agent for cancer immunotherapy. Molecular Pharmaceutics. 15 (10), 4426-4433 (2018).
  15. Niemeijer, A. N., et al. Whole body PD-1 and PD-L1 positron emission tomography in patients with non-small-cell lung cancer. Nature Communications. 9 (1), 4664(2018).
  16. Mayer, A. T., et al. Practical immuno-PET radiotracer design considerations for human immune checkpoint imaging. Journal of Nuclear Medicine. 58 (4), 538-546 (2017).
  17. Lv, G., et al. PET Imaging of tumor PD-L1 expression with a highly specific nonblocking single-domain antibody. Journal of Nuclear Medicine. 61 (1), 117-122 (2020).
  18. Li, D., et al. Immuno-PET imaging of 89Zr labeled anti-PD-L1 domain antibody. Molecular Pharmaceutics. 15 (4), 1674-1681 (2018).
  19. Lesniak, W. G., et al. PD-L1 detection in tumors using [(64)Cu]Atezolizumab with PET. Bioconjugate Chemistry. 27 (64), 2103-2110 (2016).
  20. Kristensen, L. K., et al. CD4(+) and CD8a(+) PET imaging predicts response to novel PD-1 checkpoint inhibitor: studies of Sym021 in syngeneic mouse cancer models. Theranostics. 9 (26), 8221-8238 (2019).
  21. Christensen, C., Kristensen, L. K., Alfsen, M. Z., Nielsen, C. H., Kjaer, A. Quantitative PET imaging of PD-L1 expression in xenograft and syngeneic tumour models using a site-specifically labelled PD-L1 antibody. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 47 (5), 1302-1313 (2020).
  22. Bensch, F., et al. 89Zr-atezolizumab imaging as a non-invasive approach to assess clinical response to PD-L1 blockade in cancer. Nature Medicine. 24 (12), 1852-1858 (2018).
  23. Gonzalez Trotter, D. E., et al. In vivo imaging of the programmed death ligand 1 by 18F PET. Journal of Nuclear Medicine. 58 (11), 1852-1857 (2017).
  24. Lv, G., et al. Promising potential of a 18F-labelled small-molecular radiotracer to evaluate PD-L1 expression in tumors by PET imaging. Bioorganic Chemistry. 115, 105294(2021).
  25. Miao, Y., et al. One-step radiosynthesis and initial evaluation of a small molecule PET tracer for PD-L1 imaging. Bioorganic & Medicinal Chemical Letters. 30 (24), 127572(2020).
  26. Kumar, D., et al. Peptide-based PET quantifies target engagement of PD-L1 therapeutics. The Journal of Clinical Investigation. 129 (2), 616-630 (2019).
  27. Powles, T., et al. MPDL3280A (anti-PD-L1) treatment leads to clinical activity in metastatic bladder cancer. Nature. 515 (7528), 558-562 (2014).
  28. Herbst, R. S., et al. Predictive correlates of response to the anti-PD-L1 antibody MPDL3280A in cancer patients. Nature. 515 (7528), 563-567 (2014).
  29. Marciscano, A. E., Gulley, J. L. Avelumab demonstrates promise in advanced NSCLC. Oncotarget. 8 (61), 102767-102768 (2017).
  30. Vaddepally, R. K., Kharel, P., Pandey, R., Garje, R., Chandra, A. B. Review of indications of FDA-approved immune checkpoint inhibitors per NCCN guidelines with the level of evidence. Cancers. 12 (3), 738(2020).
  31. Antonia, S. J., et al. Durvalumab after chemoradiotherapy in stage III non-small-cell lung cancer. The New England Journal of Medicine. 377 (20), 1919-1929 (2017).
  32. Wang, D. Y., et al. Fatal toxic effects associated with immune checkpoint inhibitors: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 4 (12), 1721-1728 (2018).
  33. Sgouros, G., Bodei, L., McDevitt, M. R., Nedrow, J. R. Radiopharmaceutical therapy in cancer: clinical advances and challenges. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (9), 589-608 (2020).
  34. (US) M. M. M, et al. Macrocyclic inhibitors of the pd-1/pd-l1 and cd80(b7-1)/pd-l1 protein/protein interactions. United States patent. , US-2017260237-A1 (2014).
  35. Chatterjee, S., et al. Rapid PD-L1 detection in tumors with PET using a highly specific peptide. Biochemical and Biophysical Research Communications. 483 (1), 258-263 (2017).
  36. De Silva, R. A., et al. Peptide-based 68Ga-PET radiotracer for imaging PD-L1 expression in cancer. Molecular Pharmaceutics. 15 (9), 3946-3952 (2018).
  37. Lesniak, W. G., et al. Development of [18F]FPy-WL12 as a PD-L1 specific PET imaging peptide. Molecular Imaging. 18, 1536012119852189(2019).
  38. Zhou, X., et al. First-in-humans evaluation of a PD-L1-binding peptide PET radiotracer in non-small cell lung cancer patients. Journal of Nuclear Medicine. 63 (4), 536-542 (2022).
  39. Hu, K., et al. Developing native peptide-based radiotracers for PD-L1 PET imaging and improving imaging contrast by pegylation. Chemical Communications. 55 (29), 4162-4165 (2019).
  40. Liu, H., et al. A novel small cyclic peptide-based 68Ga-Radiotracer for positron emission tomography imaging of PD-L1 expression in tumors. Molecular Pharmaceutics. 19 (1), 138-147 (2022).
  41. Rabideau, A. E., Pentelute, B. L. A D-amino acid at the N-terminus of a protein abrogates its degradation by the N-end rule pathway. ACS Central Science. 1 (8), 423-430 (2015).
  42. Uppalapati, M., et al. A potent D-protein antagonist of VEGF-A is nonimmunogenic, metabolically stable, and longer-circulating in vivo. ACS Chemical Biology. 11 (4), 1058-1065 (2016).
  43. Garton, M., et al. Method to generate highly stable D-amino acid analogs of bioactive helical peptides using a mirror image of the entire PDB. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (7), 1505-1510 (2018).
  44. Jia, F. J., et al. D-amino acid substitution enhances the stability of antimicrobial peptide polybia-CP. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 49 (10), 916-925 (2017).
  45. Carmona, G., Rodriguez, A., Juarez, D., Corzo, G., Villegas, E. Improved protease stability of the antimicrobial peptide Pin2 substituted with D-amino acids. Protein Journal. 32 (6), 456-466 (2013).
  46. Feng, Z., Xu, B. Inspiration from the mirror: D-amino acid containing peptides in biomedical approaches. Biomolecular Concepts. 7 (3), 179-187 (2016).
  47. Hu, K., et al. Whole-body PET tracking of a d-dodecapeptide and its radiotheranostic potential for PD-L1 overexpressing tumors. Acta Pharmaceutica Sinica. B. 12 (3), 1363-1376 (2022).
  48. Qiu, X. Y., et al. PD-L1 confers glioblastoma multiforme malignancy via Ras binding and Ras/Erk/EMT activation. Biochimica Et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864, 1754-1769 (2018).
  49. Hu, K., et al. Development of a stable peptide-based PET tracer for detecting CD133-expressing cancer cells. ACS Omega. 7 (1), 334-341 (2021).
  50. Jin, Z. -H., et al. Radiotheranostic agent 64Cu-cyclam-RAFT-c(-RGDfK-)4 for management of peritoneal metastasis in ovarian cancer. Clinical Cancer Research. 26 (23), 6230-6241 (2020).
  51. Hu, K., et al. Harnessing the PD-L1 interface peptide for positron emission tomography imaging of the PD-1 immune checkpoint. RSC Chemical Biology. 1 (4), 214-224 (2020).
  52. Hu, K., et al. PET imaging of VEGFR with a novel 64Cu-labeled peptide. ACS Omega. 5 (15), 8508-8514 (2020).
  53. Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
  54. Zhao, J., et al. Concurrent injection of unlabeled antibodies allows positron emission tomography imaging of programmed cell death ligand 1 expression in an orthotopic pancreatic tumor model. ACS Omega. 5 (15), 8474-8482 (2020).
  55. Moroz, A., et al. A preclinical assessment of 89Zr-atezolizumab identifies a requirement for carrier added formulations not observed with 89Zr-C4. Bioconjugate Chemistry. 29 (10), 3476-3482 (2018).
  56. Nedrow, J. R., et al. Imaging of programmed cell death ligand 1: impact of protein concentration on distribution of anti-PD-L1 SPECT agents in an immunocompetent murine model of melanoma. Journal of Nuclear Medicine. 58 (10), 1560-1566 (2017).

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68 PET D PD L1 PET

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