廃水および大気サンプル中のSARS-CoV-2 RNAの定量と全ゲノム特性評価

サマリー

このプロトコルは、廃水および空気サンプル中の SARS-CoV-2 RNA を定量化して、廃水ベースの疫学研究に使用し、屋内および屋外のエアロゾル中の SARS-CoV-2 への曝露リスクを評価することを目的としています。このプロトコルでは、SARS-CoV-2の全ゲノム特性評価のためのタイルアンプリコンロングテンプレートシーケンシングアプローチについても説明します。

要約

廃水ベースの疫学は、多くの国でSARS-CoV-2やその他の感染症の有望で効果的なサーベイランスシステムとして浮上しています。このプロセスは、典型的には、廃水濃縮、核酸抽出、選択されたゲノムセグメントの増幅、ならびに増幅されたゲノムセグメントの検出および定量を含む。この手法は、空気サンプル中のSARS-CoV-2などの感染性病原体を検出して定量するためにも同様に活用できます。当初、SARS-CoV-2は、主に感染者が話すとき、くしゃみをするとき、咳をするとき、歌うとき、呼吸するときに発生する飛沫との密接な接触によって広がると推定されていました。しかし、医療施設の空気中にSARS-CoV-2 RNAが存在することを報告する研究が増えており、空気感染がウイルスの実行可能な経路として確立されています。この研究は、廃水と空気サンプルの両方からのウイルスの環境検出、定量化、および配列決定を容易にするために確立されたプロトコルの複合体を示しています。

概要

2019年12月、これまで知られていなかったコロナウイルスであるSARS-CoV-2によって引き起こされるCOVID-19と呼ばれる新しい病気が出現^{しました1。}その結果、世界的なパンデミックは、世界中の臨床および公衆衛生研究所に大きな課題をもたらしており、多くの個人がコミュニティでのウイルス感染と有病率を正確に評価するための検査を必要としています。しかし、多くの地域では、必要なレベルのテストをタイムリーかつ空間的に包括的な方法で達成することは、経済的に実現不可能です^2,3。個々の臨床診断に基づく現在のサーベイランスシステムは、症状の重症度と個々の報告、およびこれらの症状が集団で循環している既存の疾患とどの程度重複しているかに大きく依存しています4,5,6,7,8,9,10。その結果、無症候性の症例数が多いことは、疾病負荷の著しい過小評価に寄与している^7,11。

これらの課題により、COVID-19サーベイランスのための廃水ベースの疫学(WBE)が補完的なサーベイランス戦略として提案されました。WBEは2001年に初めて記述され¹²、当初はコカインやその他の違法薬物を追跡するために使用されていた¹³。このアプローチは、廃水中で安定し^{、人間によって}排泄される物質の初期濃度を計算できるという仮定に依存しています^8,12。WBEは、SARS-CoV-2 3,8,14,15,16の補完的かつ効率的なサーベイランスシステムとして、多くの国で導入に成功しています。水生環境でヒトウイルスを検出する方法の大部分は、濃縮、核酸抽出、選択したゲノムセグメントの増幅、および増幅された^{ゲノムセグメントの}検出/定量3のステップに従います。

SARS-CoV-2の検出と定量のためのもう一つの重要な環境は、空気サンプル中です。当初、SARS-CoV-2は、主に感染者が発話、くしゃみ、咳、歌、呼吸中に発生するエアロゾルからの呼吸器飛沫との密接な個人的接触によって感染すると考えられていました¹⁷。しかし、いくつかの研究により、空気中、特に医療施設やその他の閉鎖された空間でのSARS-CoV-2 RNAの存在が報告され始めました18,19,20,21。SARS-CoV-2の生存率の証拠は、ウイルス濃度が十分に高かったときに、病院やその他の閉鎖空間の屋内で採取された空気サンプルで発見されました^{22,23,2 4}。屋外での研究では、混雑した屋外スペースを除いて、一般的にSARS-CoV-2の証拠は見つかりませんでした²¹、25^、26、27、^28、29。現在のところ、SARS-CoV-2の空気感染は感染経路として認識されています^30,31。最近のレビュー研究では、混雑した場所以外では空気感染のリスクが最小限に抑えられる屋外と、強い感染源(感染者数)が存在する可能性のある換気の悪い環境でより大きなリスクが存在する可能性のある屋内との違いが示されています。最近の包括的なレビュー研究では、屋外環境と屋内環境、特に換気の悪い混雑した場所での空気感染のリスクの大きな違いが強調されています。この研究は、ウイルス粒子の希釈と分散に利用できる空気の量が多い屋外環境では、空気感染のリスクが最小限に抑えられることを示している³²。これらの知見は、COVID-19に関連する公衆衛生政策やガイドラインにとって重要な意味を持つ。屋内と屋外の感染リスクの大きな違いを認識することで、政策立案者はウイルスの蔓延を緩和し、公衆衛生を保護するためのより効果的な戦略を策定することができます。

さまざまな環境サンプルからのSARS-CoV-2の検出、定量、およびシーケンシングには、さまざまな方法とプロトコルがあります。この分析法の記事は、さまざまな能力レベルのラボが廃水および空気サンプルからのウイルスの環境検出、定量、およびシーケンシングを実行できるようにする、確立されたプロトコルの組み合わせを提示することを目的としています。

プロトコル

ここで説明するすべてのメソッドは他の場所で公開されており、元のメソッドから少し変更されています。

1.廃水の収集とサンプルの前処理

注:環境サンプル中のSARS-CoV-2 RNAの濃度が低いため、検出を成功させるには濃縮ステップの実施が重要です^33,34,35。ここで説明するのは、廃水中のSARS-CoV-2を検出するための最初の報告された方法です³⁶。

1. 廃水サンプルの収集と濃縮
   1. 24時間複合廃水サンプルを1L採取します。サンプルを4°Cで保存し、24時間以内にプロトコルを進めます。
   2. ボトルを静かに振ってサンプルを均質化します。70 mLを100 mLの遠心チューブに集めるか、サンプルを50 mLの2本の遠心チューブに分けます。
   3. 濃縮プロセスの内部コントロールとして、20 μL のメンゴウイルス (3.2 x 10³ コピー/μL) を各サンプルの 70 mL にスパイクします。あるいは、メンゴウイルス10 μL(3.2 x 10³ コピー/μL)を各50 mL遠心チューブにスパイクします。
   4. サンプルを均質化し、700 x gで10分間遠心分離して、大きな粒子や生物(ペレット)を除去します。
   5. 得られた上清を、4°Cで40分間4,000 x g で遠心分離することにより、カットオフが10 KDaの遠心限外ろ過装置での濃縮に使用します。 700 x g で 40 分間遠心分離し、限外ろ過装置の位置を反転させて濃縮液を溶出します。
   6. 得られた濃縮物の体積を測定します。体積は、遠心フィルターを詰まらせるサンプル中の固形物の量に応じて変化します。この研究では、得られた濃縮液の量は200〜1,200μLでした。
   7. 得られた濃縮液は、市販のキットまたは社内の方法を使用してRNA抽出に使用します。この研究で使用したサンプルには、溶出量が 50 μL のウイルス RNA 抽出用の特定の市販キットを使用します。
   8. 抽出したRNAの濃度を蛍光RNA定量キットで測定します。抽出したRNAをアリコートに分割し、さらに分析するまで-80°Cで凍結します。
      注:各 RNA 単離手順セットには、抽出中のコンタミネーションの可能性を検出するためのバッファーのみを含むネガティブコントロール(NCI)を含める必要があります。
2. コリオリコンパクトエアサンプラーを用いた空気サンプルの採取
   1. サンプリング頻度とサンプリング場所を定義することにより、研究目的に応じてサンプリング戦略を選択します。
   2. エアサンプラーの流量を設定します(ここでは、50 L / minで30分間)。流速が200L/minを超えるとウイルスRNAが分解される可能性があるため、流速は200L/min未満の使用を推奨します。
   3. エアサンプラーに滅菌コーンを入れてから、スタートをパルスして収集を開始します。サンプリングが終了したら、5〜15 mLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)をコーンに加えます。サンプルを手で15秒間静かにボルテックスまたは振とうします。サンプルはクライオチューブで4°Cまたは-80°Cで最大24時間保管できます。
   4. オプションの濃縮ステップを実行できます。漂白剤を使用して、各実験後にコーンを洗浄および除染します。
   5. 市販のキットまたは社内の方法を使用してRNAを抽出します。この研究のサンプルには、溶出量が 50 μL のウイルス RNA 抽出用の特定の市販キットを使用します。
   6. 抽出したRNAの濃度を蛍光RNA定量キットで測定します。抽出したRNAをアリコートに分割し、さらに分析するまで-80°Cで凍結します。
      注:各 RNA 単離手順セットには、抽出中のコンタミネーションの可能性を検出するためのバッファーのみを含むネガティブコントロール(NCI)を含める必要があります。

2. リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応(RT-qPCR)によるSARS-CoV-2 RNAの定量

注:以下のプロトコルは、CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) RT-PCR 診断パネル³⁷ に準拠しています。プライマー/プローブミックスをいくつかのアリコートに分けて、凍結と融解のサイクルを回避します。

1. 各ターゲット(メンゴウイルス;SARS-CoV-2 [N1 および N2 遺伝子])を 、試薬セットアップルーム内の清潔なフードに入れます。プライマー/プローブミックスと酵素を5回反転させて混合します。あるいは、プライマー/プローブミックスと酵素を光パルスボルテックス5回します。
   注:調製および使用中は、すべての試薬を冷たく保ってください。凍結融解サイクルを最小限に抑えるために、アリコートで凍結することを強くお勧めします。
2. チューブを回転させて(1,000 x g で15〜30秒間)、底に内容物を集め、チューブをコールドラックまたは氷の上に置きます。
3. 各ターゲットに1.5 mLの微量遠心チューブを標識します。各微量遠心チューブに、必要な各試薬の量(反応あたりの容量に、必要なコントロールを含む反応回数を掛けたもの)を加えます。ピペッティングで上下に混合し、5秒間遠心分離して内容物を底に集めます。
4. 微量遠心チューブをコールドラックに保管し、15 μLをストリップPCRチューブまたは冷却ラックの96ウェルプレートに分注します。プレートに蓋をして、核酸処理エリアに移動します(冷却ラックに保管してください)。
5. 抽出したRNAのアリコートを解凍し、5秒間静かにボルテックスします。5 μL の RNA(5 μL の非テンプレートコントロール [NTC]、ネガティブコントロール オブアイジョン [NCI]、およびポジティブコントロール [PC]に加えて) を、事前に調製したマスターミックスを含む各反応ウェルまたはチューブにピペットで移します。二次汚染を避けるために、必要に応じて手袋を頻繁に交換してください。
6. 反応プレートまたはチューブ全体を覆い、静かにボルテックスします。プレートまたはPCRチューブを遠心分離(1,000 x g で15〜30秒)します。
7. 25 μL の RT-qPCR を以下のサイクリング条件で開始します:逆転写酵素を 45 °C で 10 分間。95°Cで10分間のポリメラーゼ活性化;95°Cで15秒間の45サイクルの変性。60°Cで45秒間焼きなまし/伸長します。
8. Conte et ^al.38 によって報告されたメンゴウイルス対照の回収効率を計算します。
   × 100

3. 廃水におけるシーケンシングバリアントとデータ解析

注:記載されているプロトコルは、Quickらによって作成された修正プロトコルです^39,40。PCRタイリング法によるSARS-CoV-2ゲノム増幅には、ARTICプライマーとVarSkipプライマーの2セットのプライマーを使用します。プライマーの組み合わせは、最良のゲノムカバレッジを保証し、1つのタイプのプライマーが失敗する原因となる新しい突然変異の可能性を最小限に抑えるために使用されます。一般に、プロトコルは逆転写(RT)とアンプリコン生成、配列ライブラリ調製、配列決定とデータ解析の3つの部分に分かれています。

1. 逆転写とアンプリコンの生成
   1. インプットサンプルをPCRグレードの水で正しく希釈するために、既知のqPCRサイクリング閾値(Ct)があることを確認してください。Ct値は、qPCRによる定量中に得られます。希釈は次の通りです:Ct値が12-15の場合、サンプルを1:100に希釈します。Ct値が15〜18の場合、サンプルを1:10に希釈します。Ct値が18〜35の場合は、サンプルを希釈しないでください。Ct 値が 35 を超えるサンプルは、機能しない可能性が高くなります。
   2. PCRプレートで、各サンプル16 μLをプレート上の所定の位置にピペットで移動します。逆転写(RT)マスターミックス(5x)4 μLを加えます。プレートを覆い、25°Cで2分間、55°Cで20分間、95°Cで1分間の条件でPCR反応を開始します。
   3. 各プライマーセット(ARTICプールAとプールB、VarSkipプールAとプールB)の希釈液を10 μM調製します。 表2のように、プライマーの各セット(ARTICセットAおよびB、およびVarSkipセットAおよびB)のマスターミックスを調製します。これにより、4つのマスターミックスが生まれます。
   4. 新しいPCRプレート上で、20 μLのマスターミックスを対応する各ウェルにピペットで移します。各ミックスに 5 μL の RT サンプルを添加します。
      注:各サンプルには、ARTICプールAとB、VarSkipプールAとBの4つの反応混合物があります。
   5. プレートを覆い、次のようにPCR反応を開始します:98°Cで30秒間ポリメラーゼ活性化。98°Cで15秒間、35サイクルの変性。65°Cで4分間アニーリング/伸長。プレートをスピンダウン(1,000 x g 、15〜30秒)します。ARTI反応プールを結合し、VarSkip反応プールを個別に結合します。各サンプルには、50 μL のアンプリコン反応が 2 回あります。
   6. PCR精製用のビーズベースの試薬50μLを各ウェルに加え、ピペッティングでよく混合します。室温で5分間インキュベートします。
      注:毎回使用する前に、PCR精製試薬を激しく混合してビーズを再懸濁してください。
   7. プレートを磁気分離スタンドに置き、ビーズがペレットを形成し、液体が透明になるのを待ちます(~5分)。上清をピペットで移し、廃棄します。PCRプレートをマグネットスタンドに置いておきます。
   8. PCRプレートをマグネットスタンドに取り付けたまま、ビーズペレットに触れずに各サンプルに200μLの80%エタノールを加えます。エタノールを取り除きます。
   9. 前の手順を繰り返します。磁気スタンドのプレートを30秒間覆わずに放置して、エタノールを蒸発させます。
   10. プレートをマグネットスタンドから取り外し、各サンプルに15 μLのPCRグレードの水を加えます。ピペッティングによりペレットを再懸濁します。室温で2分間インキュベートします。
   11. プレートをマグネットスタンドに戻し、ビーズをペレット化します(2分間)。各サンプルの上清15μLを新しいPCRプレートに慎重にピペットで移します。
   12. 蛍光 RNA 定量キットで各サンプルの濃度を測定します。各サンプルを約 50 ng の 12.5 μL で次のステップに取り込みます。必要に応じて、サンプルをPCRグレードの水で希釈します。
2. ライブラリの準備
   1. Illumina DNAライブラリ調製キットの反応バッファー1.75 μLと酵素ミックス0.75 μLを各サンプルに加えます。プレートを覆い、短時間ボルテックスし、スピンダウンします(1,000 x g で15〜30秒)。21°Cで5分間、65°Cで5分間インキュベートします。
   2. 新しいプレートで、各サンプルに3 μLのPCRグレードの水を新しいPCRプレートにピペットで移します。調製したサンプル 0.75 μL、シーケンシングライブラリ調製用のバーコード 1.25 μL、および T4 DNA リガーゼマスターミックス 5 μL を加えます。ピペッティングでよく混合し、遠心分離機で短時間スピンダウン(1,000 x g で15〜30秒)し、21°Cで20分間、65°Cで10分間インキュベートします。
      注:使用するサンプルが 25 個未満の場合は、このステップのすべての容量を 2 倍にします。
   3. 各サンプル10 μLを同じ低結合チューブに添加して、すべてのサンプルをまとめてプールします。480 μLを次のステップに進めます。
   4. PCR精製用のビーズベースの試薬192 μLをプールに加え、ピペッティングでよく混合します。室温で10分間インキュベートします。
   5. チューブを磁気スタンドに置き、上澄みがきれいになり、ビーズペレットが形成されるのを待ちます。上澄みを取り除きます。マグネットスタンドからチューブを取り外します。
   6. 700 μL のショートフラグメントバッファー(SFB)を加え、ピペッティングで混合します。マグネットスタンドに戻し、ペレットが形成され、液体が透明になるのを待ちます(~5分)。上清をピペットで取り出し、廃棄します。
   7. 前の手順を繰り返します。チューブを磁気スタンドに置いたままにします。ビーズに触れずに80%エタノール100μLを加えます。エタノールをピペットで取り出し、ビーズを30秒間乾燥させます。
      注意: ビードを過度に乾燥させないでください。
   8. マグネットスタンドからチューブを取り外し、35 μLのPCRグレードの水を加えます。ピペッティングで混合し、室温で2分間インキュベートします。チューブをマグネットスタンドに置き、ビーズがペレットになり、液体が透明になるまで待ちます。上清35μLを新しいチューブにピペットで移します。
   9. プールされたライブラリのRNA濃度を測定します。30〜50 ngのRNAの量に達するのに必要な容量をピペットで固定し、PCRグレードの水で満たして、最終容量の30 μLに到達します。
   10. アダプターライゲーション反応ミックスを調製します:プールライブラリー30 μL、アダプターミックスII5 μL、ライゲーション反応バッファー(5x)10 μL、T4 DNAリガーゼ5 μL。ピペッティングとスピンダウン(1,000 x g で15〜30秒)で混合します。室温で10分間インキュベートします。
   11. PCR精製用のビーズベースの試薬を20 μL添加し、ピペッティングで混合します。室温で10分間インキュベートします。
   12. チューブを磁気スタンドに置き、ビーズペレットが形成され、上清が無色になるのを待ちます。上清を慎重にピペットで取り出し、廃棄します。
   13. マグネットスタンドから取り外し、SFBを125μL添加します。ピペッティングで混合し、磁気スタンドに戻し、ビーズを分離します。液体が透明になったら、ピペットで移し、上清を捨てます。
   14. 前の手順を繰り返します。残った液体の一部が蒸発するまで、磁気スタンドでチューブを30秒間開いたままにします。
   15. 磁気スタンドからチューブを取り外し、15 μLの溶出バッファーを添加します。ピペッティングでよく混合し、短時間スピンダウンします(1,000 x g で15〜30秒)。室温で5分間インキュベートします。マグネットスタンドに2分間置きます。
   16. 上清15μLを新しい低結合チューブにピペットで移します。これが最終的なライブラリです。蛍光DNA定量キットで濃度を測定します。
       注:次のステップでは、12 μLが必要です。濃度が非常に高く、必要なライブラリが 12 μL 未満の場合は、最大 12 μL を溶出バッファー試薬で満たしてください。
3. フローセルのローディングとシーケンシング
   1. フローセル(R9.4.1)をリアルタイムDNA/RNAシーケンシングデバイスに挿入します。
   2. フラッシュバッファー(FB)試薬のチューブに30 μLのフラッシュテザー(FLT)試薬を添加して、プライミングミックスを調製します。混合してスピンダウンするボルテックス(1,000〜15秒間30 x g )。
   3. プライミングポートカバーを開きます。1,000 μLのピペットを使用して、200 μLに設定し、チップをプライミングポートに挿入します。音量設定ホイールを回し、先端の液体が見えるまで音量を上げます。チップを捨てます。
      注意: チップに数μLの液体が見えるまで、ホイールを回してください。大量に引き抜くと、フローセルが損傷する可能性があります。
   4. 800μLのプライミングミックスをプライミングポートにゆっくりと加え、気泡が発生しないように注意します。5分待ちます。
   5. それまでの間、ライブラリをロードする準備をします。シーケンシングバッファー 37.5 μL、ローディングバッファー 25.5 μL、ライブラリー 12 μL を混合します。
      注:ピペッティングする前に、ローディングバッファーを混合してください。この試薬中のビーズは非常に迅速に沈降します。
   6. ポートカバーを開けます。200 μLのプライミングミックスをプライミングポートにピペットで移します。
      注:カバーポートを開いた状態でプライミングポートにピペッティングすると、サンプルポートから小さな液滴が滴り落ちることがあります。ピペットは、サンプルポートが液滴をこぼさずに引き込めるように、十分にゆっくりと行います。
   7. 調製したライブラリーをロードする前に、ピペッティングでよく混合します。75 μLに設定した100 μLのピペットを使用して、ライブラリとピペットをサンプルポートに一滴ずつ取り込みます。液体のオーバーフローを防ぐために、ポートに触れず、各滴がポートに吸収されるのを待ってから次の滴をロードしてください。
   8. カバーポートとプライミングポートを閉じます。ソフトウェアを開き、シーケンシング実験を開始します。[ベースコール オン] を選択します。96のマルチプレックスサンプルを含むライブラリの場合、通常、10〜12時間のシーケンシングで十分なデータが得られます。
      注:ソフトウェアを使用して、サンプルシートを.csv形式で挿入できます。サンプルシートには、flow_cell_id、position_id、sample_id、experiment_id、flow_cell_product_code、キットのデータが必要です。フローセルID(フローセルの側面に記載)は、使用するキットとともに必要です。推奨されるプロトコルについては、LSK109キットを選択する必要があります。
4. シーケンシングデータ解析
   1. 圧縮されたfastq読み取りをwf-atic^{ワークフロー41}に挿入する。2 つの異なるプライマースキーム(ARTIC/V4.1 と NEB-VarSkip/v1a)を使用してワークフローを個別に実行します。2つの"。primertrimmed.rg.sorted.bam」ファイルがサンプルごとに作成されます。
   2. 「samtools merge」コマンド⁴²を使用して、BAMファイルを1つのファイルにマージします。マージされたBAMファイルをFreyjaツールに挿入し、デフォルト設定のままにして、相対的な系統の豊富さを回復します⁴³。
   3. FASTAファイルを作成するには、マージされたBAMファイルをデフォルト設定^44,45で「samtools mpileup」および「ivar」ツールに挿入します。変異呼び出しの場合は、FASTAファイルをNextcladeツール^46,47にロードします。

結果

表 3 にまとめた結果は、本稿で説明した方法を用いた廃水および空気サンプル中の SARS-CoV-2 RNA の検出および定量の例を示しています。廃水サンプルはスペインとスロベニアの廃水処理施設から収集され、3 回の反復のうち少なくとも 2 回で Ct が 40 未満の場合は陽性と見なされ、Ct の変動が 5% 未満の場合は定量が有効と見なされました。スペインとポルトガルでは、屋内と屋外の空気サンプルが収集され、同じルールが適用されました。この研究の目的はSARS-CoV-2 RNAの検出であり、定量化ではなかったため、廃水サンプルのトリプリケートではなく、空気サンプルに重複が使用されました。さらに、RT-qPCRの実行は、(このプロトコルで説明されているように)使用したすべてのコントロールが期待どおりに動作し、メンゴウイルスRNAコントロールで有意な逸脱が観察されなかった場合にのみ有効と見なされました。これらのサンプルでは、メンゴウイルスの回収効率は13.7%から19.7%の間で変化しました。抽出した RNA を 10 倍および 100 倍に希釈し、得られた RT-qPCR の結果を比較し、市販のキッ...

ディスカッション

(RT-)qPCR法を用いた微生物およびウイルスの検出および定量は、その優れた感度により広く受け入れられています。しかし、これらの手法は、環境サンプルを分析する際に多くの課題に直面します。廃水サンプルには、測定値を歪めたり、誤解を招く結果を生成したりする可能性のある阻害物質が豊富に含まれています。これらの制限に取り組み、精度を高めるために、複雑なプロトコルが考案、設計、実装されました。このプロトコルは、科学文献のプロトコルを組み合わせて調整され、プロセスの各段階で一連の厳格な管理を組み込むことにより、qPCR法に固有の制限に特化して対処します。これらの厳格な品質管理手段を統合することにより、このプロトコルは、複雑な環境サンプル中のqPCRベースの検出および定量法が直面する課題に対する堅牢なソリューションを提供します^51,52。ネガティブコントロール(NCI)およびノンテンプレートコントロール(NTC)は、RNA抽出およびRT-qPCR反応中のコンタミネーションの可能性を評価するために不可欠なツールです。さらに、メンゴウイ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アダプター+A25+A2:D19+A2:D20+A2+A2:D19	オックスフォードナノポア	EXP-AMII001	シーケンシング
AllPrep PowerViral DNA/RNAキット	Qiagen	28000-50	RNA抽出キット
AMPure XP	ベックマン・コールター	A63880	PCR精製、NGSクリーンアップ、PCRクリーンアップ
ARTIC SARS-CoV-2 アンプリコンパネル	IDT	10011442	SARS-CoV-2ゲノム増幅
Blunt/TA Ligase Master Mix	NEB	M0367S	ライブラリー調製
CENTRICON PLUS­70 10KDA。	フィッシャーサイエンティフィック	10296062	濃度フィルター
コリオリコンパクトエアサンプ	ラーBertin Technologies	083-DU001	エアサンプラー
デュラン ラボ用ボトル	メルク	Z305200-10EA	サンプリングボトル
フローセル (R9.4.1)	オックスフォード ナノポア	FLO-MIN106D	シーケンシング
一般ラボラバロティ消耗品 (チューブ、qPCR プレートなど)
ライゲーション シーケンシング キット	オックスフォード ナノポア	SQK-LSK109	シーケンシング
LunaScript RT SuperMix キット	NEB	E3010	cDNA合成
メンゴウイルス抽出制御キット	Biomérieux	KMG	濃度制御
Nalgene 一般長期保存 極低温チューブ	サーモフィッシャー	5011-0012	サンプル保存
ネイティブバーコード拡張 1-12 (PCRフリー	オックスフォード ナノポア	EXP-NBD104	バーコード
NEBNext Ultra II エンドリペア/dAテールモジュール	NEB	E7595	DNAリペア
NEBNext VarSkip ショート SARS-CoV-2 プライマーミックス	NEB	E7658	SARS-CoV-2 ゲノム増幅
NEB次へ Quick Ligation Reaction Buffer	NEB	B6058S	シーケンシング
リン酸緩衝生理食塩水	メルク	P4474	収集緩衝液
リン酸緩衝生理食塩水(PBS、1X)、滅菌ろ過済み	サーモフィ	ッシャーJ61196。空気	サンプルのAP溶出
Q5 ホットスタートハイフィデリティ 2X マスターミックス	NEB	M0494S	ホットスタート DNA ポリメラーゼ
Qubit RNA HS アッセイキット	サーモフィッシャー	Q32852	RNA 定量
SARS-CoV-2 RUO qPCR プライマー &プローブキット	IDT	10006713	プライマー-プローブミックスおよびqPCRポジティブコントロール
TaqPath 1-Step RT-qPCR マスターミックス	Thermofisher	A15299	RT-qPCRキット