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方法論記事

ネットワーク薬理予測とメタボロミクス 高脂血症に対するフルクタス・フィランティのメカニズムの検証

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DOI：

10.3791/65071

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2023年4月7日

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1School of Health Preservation and Rehabilitation, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2State Administration of Traditional Chinese Medicine Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine, Regimen and Health, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Regimen and Health of Sichuan Province

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本プロトコルは、ネットワーク薬理学予測およびメタボロミクス検証に基づいて、高脂血症に対するFructus Phyllanthiの主要な標的およびメカニズムを探索するための統合戦略を記載する。

要約

高脂血症は、世界中の心血管疾患や肝障害の主要な危険因子になっています。Fructus Phyllanthi(FP)は、伝統的な中国医学(TCM)およびインド医学の理論における高脂血症に対する効果的な薬ですが、潜在的なメカニズムはさらなる調査が必要です。本研究では、ネットワーク薬理予測とメタボロミクス検証を組み合わせた統合戦略に基づき、高脂血症に対するFPのメカニズムを明らかにすることを目的とする。総コレステロール(TC)、トリグリセリド(TG)、低密度リポタンパク質コレステロール(LDL-C)、高密度リポタンパク質コレステロール(HDL-C)などの血漿脂質レベルを評価することにより、高脂肪食(HFD)誘発マウスモデルを確立しました。ネットワーク薬理学を応用し、FPの有効成分と高脂血症に対する潜在的な標的を見いだしました。血漿および肝臓のメタボロミクスは、正常群、モデル群、および介入群の間で異なる代謝物およびそれらに対応する経路を特定するために実施された。ネットワーク薬理学とメタボロミクスの関係をさらに構築し、高脂血症に対するFPのプロセスを包括的に把握しました。得られた主要な標的タンパク質を分子ドッキングによって検証した。これらの結果は、FPがHFDによって誘発される高脂血症の血漿脂質レベルと肝障害を改善したことを反映しています。FP中の没食子酸、ケルセチン、およびベータシトステロールは、主要な活性化合物として実証されました。血漿および肝臓における合計16および6の潜在的な分化代謝産物が、メタボロミクスによる高脂血症に対するFPの治療効果に関与することが見出された。さらに、統合解析の結果、介入効果はCYP1A1、AChE、MGAM、および主にトリプトファン代謝経路を含むL-キヌレニン、コルチコステロン、アセチルコリン、およびラフィノースの調整に関連していることが示されました。分子ドッキングにより、高脂血症関連タンパク質標的に作用する上記の成分が脂質低下に重要な役割を果たすことが確認されました。要約すると、この研究は高脂血症の予防と治療のための新しい可能性を提供しました。

概要

高脂血症は、人間の健康に深刻な影響を与える一般的な代謝性疾患であり、心血管疾患の主要な危険因子でもあります1。最近、この病気は加齢に伴う減少傾向にあり、長期的な不規則なライフスタイルや不健康な食生活のために若年層が影響を受けやすくなっています2。診療所では、高脂血症の治療にさまざまな薬が使用されています。例えば、高脂血症および関連するアテローム性動脈硬化症を有する患者に最も一般的に使用される薬物の1つはスタチンである。しかし、スタチンの長期使用には無視できない副作用があり、不耐性、治療抵抗性、有害事象などの予後不良につながります3,4。これらの欠点は、高脂血症患者にとって追加の苦痛となっています。したがって、安定した脂質低下効果とより少ない副作用のための新しい治療法を提案する必要があります。

伝統的な漢方薬(TCM)は、その優れた有効性と副作用の少なさから、病気の治療に広く使用されています5。フルクタスフィランティ(FP)、フィランサスエンブリカリンのドライフルーツ。(一般にアムラベリーまたはインドのグーズベリーとして知られている)は、伝統的な中国とインドの薬の有名な薬と食品の相同材料です6,7。この薬は、TCM理論8に従って、熱を取り除き、血液を冷却し、消化を促進するために使用されてきました。現代の薬理学的研究は、FPが抗酸化剤、抗炎症剤、肝臓保護剤、抗脂質低下薬などとして作用することにより、さまざまな多面的な生物学的特性に関与する没食子酸、エラグ酸、ケルセチン9などの生理活性化合物が豊富であることが示されています10。最近の研究では、FPが高脂血症患者の血中脂質を効果的に調節できることも示されています。例えば、Variyaら11は、FPフルーツジュースとその主要な化学成分である没食子酸が血漿コレステロールを減少させ、肝臓と大動脈への油の浸潤を減らすことができることを実証しました。治療効果は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アルファの発現を増加させ、肝脂肪生成活性を低下させるFPの調節に関連していた。しかし、高脂血症の改善におけるFPの根底にあるメカニズムは、その生理活性成分が非常に広範囲であるため、さらに調査する必要があります。FPの治療効果の潜在的なメカニズムを探り、この薬のさらなる開発と利用に有益である可能性を探ろうとしました。

現在、ネットワーク薬理学は、TCMの治療メカニズムを研究するための全体的かつ効率的な技術と見なされています。単一の疾患原因遺伝子や個々の標的のみを治療する薬物を探すのではなく、完全な薬物-成分-遺伝子-疾患ネットワークを構築して、それらの包括的な治療に関する多成分薬のマルチターゲットメカニズムを見つけます12。この技術は、化学組成が膨大であるため、TCMに特に適しています。残念ながら、ネットワーク薬理学は、理論的には化学成分の影響を受けるターゲットを予測するためにのみ使用できます。疾患モデルの内因性代謝物は、ネットワーク薬理学の有効性を検証するために観察する必要があります。システム生物学の発展とともに出現したメタボロミクス法は、内因性代謝物の変化を監視するための重要なツールです13。代謝産物の変化は宿主の定常状態の変化を反映しており、これも内部メカニズムを研究するための重要な指標です。一部の研究者は、ネットワーク薬理学とメタボロミクスを統合して、薬物と疾患の相互作用メカニズムを探求することに成功しました14,15。

本稿では、ネットワーク薬理学とメタボロミクス技術を統合することにより、高脂血症に対するFPの機構的基盤を探ります。ネットワーク薬理学を適用して、FPの主な有効成分と高脂血症の分子標的との関係を分析しました。続いて、メタボロミクスを行い、動物モデルにおける内因性代謝物の変化を観察し、代謝レベルでの薬物作用を説明できる。ネットワーク薬理学やメタボノミクス単独の応用と比較して、この統合解析はより具体的で包括的な研究メカニズムを提供しました。さらに、分子ドッキング戦略を使用して、有効成分と主要タンパク質の間の相互作用を分析しました。一般に、この統合アプローチは、ネットワーク薬理学の実験的証拠の欠如とメタボロミクス法の内因性メカニズムの欠如を補うことができ、自然医学の治療メカニズム分析に使用できます。プロトコルの主な概略フローチャートを 図1に示します。

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プロトコル

動物の取り扱いを含むすべての手順は、実験動物の世話と使用のための成都中医薬大学ガイドに従って実施され、成都中医薬大学の制度倫理委員会(プロトコル番号2020-36)によって承認されました。雄のC57BL / 6マウス(20 ± 2 g)を本研究に使用しました。マウスは市販の供給源から入手した( 材料表参照)。

1. ネットワーク薬理学に基づく予測

注:ネットワーク薬理学は、高脂血症に対するFPの有効成分とその主要な標的を予測するために使用されます。

  1. 有効成分と主要ターゲットの選択
    1. 漢方薬システムの薬理学データベース(TCMSP;http://tcmspw.com/tcmsp.php)でキーワード「Phyllanthi Fructus」を検索して、FPの有効成分候補とターゲットのリストを取得します。
      注:通常、データベース内の経口バイオアベイラビリティ(OB)≥30%および薬物様(DL)値≥0.18の成分のみが有効成分として含まれています。
    2. GeneCardsデータベース(https://www.genecards.org/)、オンラインメンデル遺伝データベース(OMIM;https://omim.org/)、治療標的データベース(TTD;http://db.idrblab.net/ttd/)でキーワード「高脂血症」を検索し、それぞれの高脂血症の候補ターゲットを取得します。疾患ターゲットのスプレッドシートをダウンロードします。繰り返しターゲットを削除して、高脂血症ターゲットリストを取得します。
    3. 手順 1.1.1 および 1.1.2 のこれらのリストを新しいスプレッドシートにコピーします。ツールバーの「データ - 重複の識別」機能を使用して、交差ターゲットを取得します。交差ターゲットリストをUniProtKB(http://www.uniprot.org/)にインポートして、遺伝子名とタンパク質名を標準化します。
      注:これらの標的は、FPと高脂血症の両方に関連しています。したがって、これらの交差ターゲットを高脂血症に対するFPのターゲットとして予測する。
  2. タンパク質間相互作用ネットワークの構築
    1. STRING データベース (https://string-db.org/) 11.5 を開きます。高脂血症に対するFPの交点ターゲットリストを「名前一覧」ダイアログボックスに貼り付けます。「生物」でホモサピエンス を選択し、[ 検索]をクリックして>続行します。
      注:ヒトとマウスは非常に類似した遺伝子を持っています。そのため、マウスを用いてさらなる実験的検証を行う。
    2. 結果が利用可能になったら、[詳細設定]で ネットワーク内の切断されたノードを非表示 にするにチェックマークを付けます。「最低限必要なインタラクションスコア 」に最高の信頼度(0.900) を設定し、 更新 ボタンをクリックします。
    3. タイトルバーの エクスポート をクリックし、タンパク質間相互作用(PPI)ネットワークの短い表形式のテキストをPNGおよびTSV形式でダウンロードします。
  3. 創薬-成分-疾患-標的ネットワークの構築
    1. Cytoscape 3.9.1を開きます( 材料表を参照)。手順 1.2.3 の TSV 形式のファイルをインポートします。コントロールパネルのスタイルバーを使用して、ネットワークノードの色、フォント、および側面を最適化します。
    2. ネットワークトポロジ解析には、「ネットワークの解析」機能を使用します。サイトスケープのサイトハッバによってハブ遺伝子を取得します。創薬-成分-標的-疾患ネットワークを確立する。
  4. GO および KEGG エンリッチメント分析
    1. DAVIDバイオインフォマティクスリソース(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)を開きます。[分析の開始 ]をクリックし、ターゲットリストを左側のダイアログボックスに貼り付けます。「識別子の選択」で 公式遺伝子記号 を選択します。「種を選択」で ホモサピエンス を選択します。「リストタイプ」の 遺伝子リスト をチェックします。[ リストの送信]をクリックします。
    2. 結果が利用可能になったら、 DAVIDツールの1つで上記の遺伝子リストを分析するをクリックします。GO機能エンリッチメント解析のための「遺伝子オントロジー」の GOTERM_BP_DIRECT、GOTERM_CC_DIRECT、GOTERM_MF_DIRECT 。KEGG経路エンリッチメント分析の「経路」の KEGG_Pathway にチェックマークを付けます。
    3. 機能アノテーションチャートをクリックして結果を表示します。
      注: エンリッチメント分析の統計的有意性のしきい値を p < 0.05 に設定します。

2. 実験計画

  1. FP水性抽出物調製物
    注:FPは、TCM8の成都大学のリナシア教授の研究室で処理されます。
    1. FP(90 g)の乾燥粉末を1 Lの純水にきれいな2 Lメスフラスコに浸します。超音波処理(4°Cの水浴中、電力:250W、周波数:35kHz)を使用して、30分間溶解します。溶液をろ過して、1 mm x 1 mmの二重層の滅菌医療用ガーゼで抽出物を得ます。上記の操作を3回繰り返して、FPが完全に溶解することを確認します。
    2. さらに濃縮するには、ロータリー蒸発法を使用してください。回転速度を50rpmに設定し、温度60°Cで4時間。水性抽出物を100mLに濃縮する。
    3. FPの粗抽出物(0.9 g / mL)を2つの部分(50 mL)に均等に分けます。一部は高用量FP液(0.9g/mL)として使用されます。50mLの純水を別の部品に加え、低用量FP液(0.45g/mL)と考えてください。投与には高用量および低用量のFP水溶液を使用してください。使用するまで液体を-20°Cで保管してください。
  2. 動物の準備
    1. 50匹のオスのC57BL / 6マウス(20 ± 2 g)を室温で換気の良い部屋に収容し、12時間の明暗サイクルで餌と純水に自由にアクセスできるようにします。
    2. マウスを2つのグループにランダムに割り当てます:10匹のマウスに通常の食事を与え、40匹のマウスに高脂肪食を与え( 材料の表を参照)、高脂血症を誘発します。
      注:8週間給餌した後、マウスはさらなる薬物介入のためにスクリーニングされた。
    3. 8週目に、各マウス軌道から約200μLの血液を採取する。血液を4°Cで5,733 x gで10分間遠心分離し、血漿サンプルを取得します。市販のアッセイキットでTCおよびTGレベルを測定します(材料表を参照)。
    4. 脂質レベルが最も正常な6匹のマウスを無治療対照(NC)群として選択した。脂質レベルが有意に高いマウスを高脂肪食群として24匹選択し、高脂肪食(HFD)群、低用量FP(FP_L)群、高用量FP(FP_H)群、ポジティブコントロール(PC)群の4群にランダムに分けます。
    5. FP_L群とFP_H群に2回のFP(低用量、4.5 g / kgと高用量、9 g / kg)で胃洗浄を投与します。シンバスタチン錠(5mg / kg; 材料表を参照)によるPC群への胃洗浄;NCおよびHFD群への胃洗浄は、同じ量の生理食塩水を1日1回4週間投与する。
      注:現在の研究では、治療にFPとシンバスタチンの水溶液を使用しました。
    6. 12週目に、1%ペントバルビタールナトリウム(30 mg / kg)による麻酔後、すべてのグループのマウスを屠殺します。.各マウスの眼窩静脈から~400 μLの血液サンプルを採取します。
      注意: ピンセットでマウスのつま先と足の裏を刺激します。反応がない場合は、適切な麻酔が証明されます。
    7. 血液を4°Cで5,733 x g で10分間遠心分離して血漿サンプルを取得し、市販のアッセイキットを使用してTC、TG、LDL-C、およびHDL-Cレベルを測定します( 材料の表を参照)。肝臓組織サンプル16 を取得し、それらを病理組織学的解析に供する。残りの血漿および肝臓サンプルをメタボロミクス解析に使用します(ステップ3)。
      注:すべてのサンプルは、使用するまで-80°Cで保管されます。
  3. 肝病理組織学的検査
    1. 新鮮な肝臓組織を4%パラホルムアルデヒド溶液で24時間以上固定します。固定液から組織を取り出し、メスで標的組織を滑らかにします。ティッシュと対応するラベルを脱水機に入れます。
    2. エタノール勾配で脱水する:75%アルコール4時間、85%アルコール2時間、90%アルコール2時間、95%アルコール1時間、無水エタノール1時間、キシレン30分。組織カセットをパラフィンワックス中の組織型に入れ、3回の洗浄を行い、各16回30分間行う。
    3. ワックスに浸したティッシュをティッシュエンベッダーに入れます( 材料の表を参照)。ワックスが固まる前に、脱水機からティッシュを取り出し、埋め込まれた箱に入れて、対応するラベルを貼り付けます。
    4. ワックスブロックを-20°Cの凍結テーブルで冷却し、埋め込まれたフレームから取り外して、ワックスブロックをトリミングします。
    5. ミクロトームを使用して、トリミングしたワックスブロックを3 μmの厚さのセクションにカットします( 材料表を参照)。切片を40°Cの水に浮かべ、スライドから取り出し、60°Cのオーブンで焼きます。水とドライワックスで焼いた後、取り出して室温に保ちます。
    6. 切片をキシレンIに10分間、キシレンIIに10分間、キシレンIIIを10分間、無水エタノールIを5分間、無水エタノールIIを5分間、75%アルコールで5分間連続して置き、水16で洗浄する。
    7. 切片をヘマトキシリン染色液で4分間染色し、鑑別のために1%塩酸アルコール溶液(75%アルコール)、1%アンモニア水溶液で青く戻し、水洗します。
    8. 切片をエオジン染色液で2分間染色し、水で洗浄します。
    9. 倍率200倍と400倍の光学顕微鏡を使用して切片を観察します。
  4. 液体クロマトグラフィー-質量分析)LC-MS)分析
    1. FPの成分同定
      注:分析は、ハイブリッド四重極-オービラップ高分解能質量分析(UPLC-Q-Orbirap HRMS、LC-MS ;材料表を参照)と組み合わせた超高速液体クロマトグラフィーを使用して実行されます。
      1. FPの乾燥粉末1 gを正確に測定し、きれいな50 mLメスフラスコに入れます。
      2. 25 mLの70%メタノールをメスフラスコに加え、正確に計量します。溶解を助けるために30分間超音波処理(4°Cの水浴中、電力:250W、周波数:35kHz)を使用します。溶解後の損失を正確に決定するために再度正確に計量し、70%メタノールを使用して損失を補います。
        注意: 特に4°Cの水浴の後は、メスフラスコのスケールが正確ではないため、容量を測定しないでください。
      3. 完全に混ぜるために振ってください。0.22 μmの微多孔膜を使用してろ過します。
    2. 血漿サンプル調製
      1. 1.5 mL遠心管内の2倍容量(200 μL)のアセトニトリルに100 μLの血漿(ステップ2.2.7)を正確に添加し、ボルテックスバイブレーターで少なくとも30秒間ボルテックスします。すべてのサンプルについて、次の手順に従います。
      2. すべてのサンプルを17,200 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 遠心分離後の上清を新しい1.5 mL遠沈管に移します。上清を窒素下で乾燥させる。200 μLの抽出溶媒(アセトニトリル:水 = 4:1 [v/v])で再構成します。
      3. 再構成した溶液を少なくとも30秒間ボルテックスし、超音波処理を10分間使用します(4°Cの水浴中、電力:250 W、周波数:35 kHz)。17,200 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
      4. 上清を0.22 μmのフィルターメンブレンでろ過し、分析のために4°Cに保ちます。
    3. 肝臓サンプル調製
      1. 90 mgの肝臓組織を氷冷メタノール水(1:1、v / v、1 mL)で1分間ホモジナイズし(ステップ2.2.7)、21,500 x g で4°Cで10分間遠心分離します。 上清を1.5 mLの遠沈管に移します。すべてのサンプルについて、次の手順に従います。
      2. 同じ手順に従って沈殿物を再度抽出し、上清を一緒に新しい1.5 mL遠沈管にプールします。上清を窒素下で乾燥させる。300 μLの抽出溶媒(メタノール:水 = 4:1 [v/v])で再構成します。
      3. 再構成した溶液を少なくとも30秒間ボルテックスし、超音波処理を10分間使用します(4°Cの水浴中、電力:250 W、周波数:35 kHz)。17,200 x g で4°Cで15分間遠心分離します。
      4. 上清を0.22 μmのフィルターメンブレンでろ過し、分析のために4°Cに保ちます。
        注:プールされた品質管理(QC)サンプルは、各血漿および肝臓サンプルから10 μLのアリコートを混合することによって調製されました(6サンプルごとに1つ)。
    4. LC-MSの分析パラメータ
      注:移動相は、0.1%ギ酸(溶媒A)とアセトニトリル(溶媒B)で構成されています。これらの溶媒を清潔なガラス瓶に移し、LC-MSシステムに接続します。
      1. LC-MSシステムの「インレットファイル」にある血漿サンプルのグラジエントプログラムを次のように設定します:1%B(0-1.5分)、1%-60%B(1.5-13.0分)、60%-99%B(13.0-20.0分)、99%B(20.0-25.0分)、99%-1%B(25.0-25.1分)に維持し、27分まで1%Bに維持します。
      2. LC-MSシステムの「インレットファイル」にある血漿サンプルのオートサンプラー条件を次のように設定します:注入量、2 μL;各分析の流量は0.3 mL/分です。
      3. LC-MSシステムの「インレットファイル」にある肝臓サンプルのグラジエントプログラムを次のように設定します:1%B(0-1分)、1%-53%B(1-15分)、53%-70%B(15-30分)、70%-90%B(30-32分)、90%-95%B(32-40分)、95%-1%B(40-42分)、および45分まで1%Bに維持します。
      4. LC-MSシステムの「インレットファイル」にある肝臓サンプルのオートサンプラー条件を次のように設定します:注入量、5 μL;各分析の流量は0.3 mL/分です。
      5. 血漿サンプルと肝臓サンプルの両方のMS検出条件をLC-MSシステムの「MSチューンファイル」に設定します。正イオン化モードと負イオン化モードの両方を使用してMS取得を実行します。
        注:加熱エレクトロスプレーイオン化パラメータは次のとおりです:スプレー電圧:正イオン化の場合は3.5 kV、負イオン化の場合は3.8kV。シースガス流量:55 Arb;補助ガス流量:15 Arb;プローブヒーター温度:300°C;毛細管温度:350°C。
      6. 収集した生データをCompound Discovererソフトウェアにインポートし、製造元の指示に従ってメソッドテンプレートを設定します( 材料表を参照)。

3. メタボローム検証

注:血漿および肝臓代謝物のメタボロームプロファイリングデータは、Compound Discovererソフトウェアにインポートされ、分子特徴抽出アルゴリズムを採用して代謝特徴抽出を実行します。パラメータを次のように設定します:質量偏差、5 x 10-6。質量範囲、100〜1,500。信号対雑音比(SNR)しきい値、3。保持時間の偏差、0.05。QCピーク領域の相対標準偏差(RSD)によってメタボロミクスの安定性と再現性を評価します。

  1. SIMCA-Pソフトウェア( 材料表を参照)を使用して、LC-MSの結果から得られた積分値の多変量統計分析を行います。直交偏最小二乗判別分析 (OPLS-DA) は、平均中心化データとサンプル クラスのモデリングに使用します。
  2. OPLS-DA検定の後、潜在的な分化代謝物として、投影(VIP)値>1およびスチューデントのt検定からのp値が<0.05の 可変重要度を持つ積分を持つ代謝物を検討します。
  3. ヒトメタボローム(HMDB;http://www.hmdb.ca/)、京都遺伝子ゲノム百科事典(KEGG;https://www.kegg.jp/)、MetaboAnalyst5.0(https://www.metaboanalyst.ca/)などのオープンデータベースソースによって、乱れた代謝物と代謝経路を特定します。
  4. MetaboAnalyst5.0と「ウーコン」プラットフォーム(https://www.omicsolution.com/wkomics/main/)による結果ビューを視覚化します。

4. 分子ドッキング

  1. 選択したFP成分の3D構造をTCMSPデータベースからそれぞれダウンロードします。「化学名」検索ボックスで成分名を検索し、対応する3D構造ファイルをmol2形式でダウンロードします。
  2. アルファフォールドタンパク質構造データベース(アルファフォールドDB;、https://alphafold.ebi.ac.uk/)から主要なターゲットの結晶構造をダウンロードしてください。検索ボックスでターゲット名を検索し、対応する結晶構造ファイルをpdb形式でダウンロードします。
  3. 成分とターゲット構造ファイルをAutoDockToolsソフトウェアにインポートします。水分子を削除するには 、[編集]>[水の削除] をクリックします。水素 >編集> 追加をクリックして水素を追加します。成分を「リガンド」として設定し、ターゲット全体を「受容体」として選択してブラインドドッキングを行います17。
  4. 「中央」と「サイズ」の後ろのボックスに値を入力すると、新しく開発された空間が調整され、リガンドと受容体を完全に包み込むことができます。リガンドファイルと受容体ファイルをpdbqt形式で保存します。
  5. AutoDock Vina を使用して分子ドッキングを実行します。"Receptor" バーを 'receptor.pdbqt' の名前に設定し、"Ligand" バーを 'ligand.pdbqt' の名前に設定します。受容体へのリガンド結合に最適な位置を取得します。結合エネルギー値を最適な位置に記録します。
    注意: ドッキングプロセスは、遺伝的アルゴリズム14によって計算されました。すべてのドッキング実行オプションはデフォルト値でした。ドッキングフレームは、結合エネルギーの最高から最低の束縛エネルギーに自動的にランク付けされます。
  6. ドッキングファイルをPILP(タンパク質-リガンド相互作用プロファイラー https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index)にインポートして、ビジュアルシステムモデルを取得します。モデルファイルをpse形式でダウンロードし、PyMOLソフトウェア(材料表を参照)にインポートして、さらなる視覚化を構築します。

5.統計分析

注意: データ分析にはSPSS統計ソフトウェア( 材料表を参照)を使用してください。 p < 0.05 の値を統計的に有意であると考えてください。

  1. 値を標準偏差 (SD) ±平均値で表します。
  2. 一元配置分散分析を実行し、その後に事後最小有意差(LSD)、ダネット(等分散の場合)、またはダネットのT3(不等分散の場合)を実行して、グループ間の統計的有意性を検定します。

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結果

ネットワーク薬理学
FP中の合計18の潜在成分を、データベースおよびLC-MS分析からの薬物動態学的および薬力学的特性に従ってスクリーニングしました(合計イオンクロマトグラムは補足図1に示されています)。関連する文献を通じて、没食子酸の含有量は他の成分よりもはるかに高く、脂質を下げるのに効果的です9,11。したがって、この成分も潜在的な成分と見なされました。FPの計19成分、134成分関連ターゲットが設立されました。全19成分を表1に示す。さらなる分析のために最も代表的な成分を選択するために、これらの成分を伝統的な漢方薬の分子力学のためのバイオインフォマティクス分析ツールデータベース(BATMAN-TCM;http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)にインポートしました。成分-標的-経路-疾患ネットワークによると、没食子酸、ケルセチン、β-シトステロールなどのいくつかの生理活性成分が、高...

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ディスカッション

近年、主に長期的な不健康な食生活により、高脂血症の発生率が上昇しています。TCMとその化学成分にはさまざまな薬理学的活性があり、近年広く研究されています37,38。FPは果物資源の一種であり、医薬品としても食品としても利用されており、高脂血症の治療に重要な可能性を秘めています。ただし、高脂血症に対するFPの潜在的な治療メカニズムには、さらなる研究が必要です。

ネットワーク薬理学は、薬物のポリ薬理学的効果を分子レベルで評価し、天然物とタンパク質の相互作用を予測して主要なメカニズムを決定する39。最初のステップは、薬の有効成分と主要なターゲットを選択することです。この研究では、9つの有効成分と62のハブ遺伝子が見つかりました。FPの高脂血症分子機構をさらに理解するために、ネットワーク薬理解析に基づいてPPIおよび成分-標的ネットワークを確立した。主要成分と標的の範囲を絞り込むために、高コレステロール血症と冠動脈硬化症に関連...

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開示事項

すべての著者は、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

本研究は、TCM健康維持・リハビリテーション(2022C005)の商品開発・イノベーションチームと「健康維持・リハビリテーション+」の新規事業越境統合に関する研究の支援を受けて行われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
101-3B オーブンLuyue Instrument and Equipment Factory\
80312/80302 ガラススライド江蘇Sitai実験装置有限公司\
80340-1630 カバースリップ江蘇Sitai実験装置有限公司\
AccucoreTM C18 (3 mm × 100 mm, 2. 6 μm)Thermo Fisher Scientific\
AcetonitrileFisher ChemicalA998Version 1.5.6
ACQUITY UPLC HSS T3 カラム(2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm)サーモフィッシャーサイエンティフィック\
エタノールフィッシャーケミカルA995バージョン3.0
アンモニア溶液成都ケルンケミカルズ株式会社1336-21-6バージョン3.9.1AutoDockTools
スクリップス海洋研究所\
BS-240VT全自動動物生化学検出システム深センMindrayバイオメディカルエレクトロニクス(株)\
化合物発見者サーモフィッシャーサイエンティフィック\
CytoscapeCytoscape Consortium\
DM500 光学顕微鏡ライカ\
DV215CD 電子天秤Ohaus Corporation ., LtdT15A63
Ethyl AlcoholChengdu Cologne Chemicals Co., Ltd64-17-5
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参考文献

  1. Nelson, R. H. Hyperlipidemia as a risk factor for cardiovascular disease. Primary Care: Clinics in Office Practice. 40 (1), 195-211 (2013).
  2. Mach, F., et al. 2019 ESC/EAS Guidelines for the management of dyslipidaemias: lipid modification to reduce cardiovascular risk: the Task Force for the management of dyslipidaemias of the European Society of Cardiology (ESC) and European Atherosclerosis Society (EAS). European Heart Journal. 41 (1), 111-188 (2020).
  3. Oesterle, A., Laufs, U., Liao, J. K. Pleiotropic effects of statins on the cardiovascular system. Circulation Research. 120 (1), 229-243 (2017).
  4. Last, A. R., Ference, J. D., Menzel, E. R. Hyperlipidemia: drugs for cardiovascular risk reduction in adults. American Family Physician. 95 (2), 78-87 (2017).
  5. Wu, S., et al. Recent advances of tanshinone in regulating autophagy for medicinal research. Front Pharmacol. 13, 1059360(2022).
  6. Mirunalini, S., Krishnaveni, M. Therapeutic potential of Phyllanthus emblica (amla): the ayurvedic wonder. Journal of Basic and Clinical Physiology and Pharmacology. 21 (1), 93-105 (2010).
  7. Zhao, H. J., et al. Fructus phyllanthi tannin fraction induces apoptosis and inhibits migration and invasion of human lung squamous carcinoma cells in vitro via MAPK/MMP pathways. Acta Pharmacologica Sinica. 36 (6), 758-768 (2015).
  8. Yan, X., et al. Current advances on the phytochemical composition, pharmacologic effects, toxicology, and product development of Phyllanthi Fructus. Frontiers in Pharmacology. 13, 1017628(2022).
  9. Yang, F., et al. Chemical constituents from the fruits of Phyllanthus emblica L. Biochemical Systematics and Ecology. 92, 104122(2020).
  10. Wu, L., et al. Phytochemical analysis using UPLC-MSn combined with network pharmacology approaches to explore the biomarkers for the quality control of the anticancer tannin fraction of Phyllanthus emblica L. habitat in Nepal. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 6623791(2021).
  11. Variya, B. C., Bakrania, A. K., Chen, Y., Han, J., Patel, S. S. Suppression of abdominal fat and anti-hyperlipidemic potential of Emblica officinalis: Upregulation of PPARs and identification of active moiety. Biomedicine & Pharmacotherapy. 108, 1274-1281 (2018).
  12. Gertsch, J. Botanical drugs, synergy, and network pharmacology: forth and back to intelligent mixtures. Planta Medica. 77 (11), 1086-1098 (2011).
  13. Nicholson, J. K., Wilson, I. D. Understanding 'global' systems biology: metabonomics and the continuum of metabolism. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (8), 668-676 (2003).
  14. Li, T., et al. Integrated metabolomics and network pharmacology to reveal the mechanisms of hydroxysafflor yellow A against acute traumatic brain injury. Computational and Structural Biotechnology Journal. 19, 1002-1013 (2021).
  15. Wang, F., et al. Network pharmacology combined with metabolomics to investigate the anti-hyperlipidemia mechanism of a novel combination. Journal of Functional Foods. 87, 104848(2021).
  16. Adams, J. M., Jafar-Nejad, H. Determining bile duct density in the mouse liver. Journal of Visualized Experiments. (146), e59587(2019).
  17. Wang, J. Y., et al. Use of viral entry assays and molecular docking analysis for the identification of antiviral candidates against coxsackievirus A16. Journal of Visualized Experiments. (149), e59920(2019).
  18. Wu, L. F., Liang, W. Y., Zhang, L. Z. Determination of main components of Tibetan medicine Phyllanthus emblica L. World Science and Technology-Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica. 22 (8), 2857-2863 (2022).
  19. El-Hussainy, E. H. M., Hussein, A. M., Abdel-Aziz, A., El-Mehasseb, I. Effects of aluminum oxide (Al2O3) nanoparticles on ECG, myocardial inflammatory cytokines, redox state, and connexin 43 and lipid profile in rats: possible cardioprotective effect of gallic acid. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 94 (8), 868-878 (2016).
  20. Huang, W. Y., et al. Quercetin, hyper, and chlorogenic acid improve endothelial function by antioxidant, antiinflammatory, and ACE inhibitory effects. Journal of Food Science. 82 (5), 1239-1246 (2017).
  21. Lu, T. M., et al. Hypocholesterolemic efficacy of quercetin rich onion juice in healthy mild hypercholesterolemic adults: a pilot study. Plant Foods for Human Nutrition. 70 (4), 395-400 (2015).
  22. Witkowska, A. M., et al. Dietary plant sterols and phytosterol-enriched margarines and their relationship with cardiovascular disease among polish men and women: The WOBASZ II cross-sectional study. Nutrients. 14 (13), 2665(2022).
  23. Turini, E., et al. Efficacy of plant sterol-enriched food for primary prevention and treatment of hypercholesterolemia: a systematic literature review. Foods. 11 (6), 839(2022).
  24. Alamro, S. A., et al. Fermented camel milk enriched with plant sterols improves lipid profile and atherogenic index in rats fed high-fat and-cholesterol diets. Heliyon. , e10871(2022).
  25. Gao, P., Wen, X., Ou, Q., Zhang, J. Which one of LDL-C/HDL-C ratio and non-HDL-C can better predict the severity of coronary artery disease in STEMI patients. BMC Cardiovascular Disorders. 22 (1), 318(2022).
  26. Sun, T., et al. Predictive value of LDL/HDL ratio in coronary atherosclerotic heart disease. BMC Cardiovascular Disorders. 22 (1), 273(2022).
  27. Maegawa, K., et al. Dietary raffinose ameliorates hepatic lipid accumulation induced by cholic acid via modulation of enterohepatic bile acid circulation in rats. British Journal of Nutrition. 127 (11), 1621-1630 (2022).
  28. Antony, B., Merina, B., Sheeba, V. AmlamaxTM in the management of dyslipidemia in humans. Indian Journal of Pharmaceutical Sciences. 70 (4), 504(2008).
  29. Antony, B., Benny, M., Kaimal, T. N. B. A pilot clinical study to evaluate the effect of Emblica officinalis extract (Amlamax™) on markers of systemic inflammation and dyslipidemia. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 23 (4), 378-381 (2008).
  30. Nambiar, S. S., Shetty, N. P. Phytochemical profiling and assessment of low-density lipoprotein oxidation, foam cell-preventing ability and antioxidant activity of commercial products of Emblica officinalis fruit. Journal of Food Biochemistry. 39 (3), 218-229 (2015).
  31. Gopa, B., Bhatt, J., Hemavathi, K. G. A comparative clinical study of hypolipidemic efficacy of Amla (Emblica officinalis) with 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme-A reductase inhibitor simvastatin. Indian Journal of Pharmacology. 44 (2), 238(2012).
  32. Jung, T. W., et al. Administration of kynurenic acid reduces hyperlipidemia-induced inflammation and insulin resistance in skeletal muscle and adipocytes. Molecular and Cellular Endocrinology. , 518(2020).
  33. Dong, Y., Li, X., Liu, Y., Gao, J., Tao, J. The molecular targets of taurine confer anti-hyperlipidemic effects. Life Sciences. 278, 119579(2021).
  34. Huang, B., Bao, J., Cao, Y. R., Gao, H. F., Jin, Y. Cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) catalyzes lipid peroxidation of oleic acid-induced HepG2 cells. Biochemistry. 83 (5), 595-602 (2018).
  35. Xia, H., et al. Alpha-naphthoflavone attenuates non-alcoholic fatty liver disease in oleic acid-treated HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice. Biomedicine & Pharmacotherapy. 118, 109287(2019).
  36. Dai, Z., et al. Protective effects of α-galacto-oligosaccharides against a high-fat/western-style diet-induced metabolic abnormalities in mice. Food & Function. 10 (6), 3660-3670 (2019).
  37. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278(2022).
  38. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl(2)-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568(2023).
  39. Noor, F., et al. Network pharmacology approach for medicinal plants: review and assessment. Pharmaceuticals. 15 (5), 572(2022).
  40. Li, X., et al. Role of potential bioactive metabolites from traditional Chinese medicine for type 2 diabetes mellitus: An overview. Front Pharmacol. 13, 1023713(2022).

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