ウマ骨格筋の高分解能蛍光呼吸測定

真核細胞のミトコンドリアは、細胞が仕事と維持に使用するATPの大部分を産生します¹。ATPのミトコンドリア産生における重要なステップは、酸素から水への変換であり、したがって、ミトコンドリアおよび関連細胞の代謝能力は、酸素消費量の測定を通じて頻繁に定量化されます²。しかし、ミトコンドリア生理学は酸素消費の単純なプロセスよりも複雑であり、このエンドポイントへの依存は、ミトコンドリア機能と機能障害が細胞の健康に与える影響の不完全な評価のみを提供します。ミトコンドリア機能の完全な特性評価には、酸素消費量だけでなく、ATPおよび活性酸素種(ROS)の産生も評価する必要があります。

重要なミトコンドリア機能の追加測定は、特定の蛍光色素を使用して呼吸の測定と同時に達成することができます。テトラメチルローダミンメチルエステル(TMRM)は、ミトコンドリア膜貫通電位に比例してミトコンドリアマトリックスに蓄積するカチオン性蛍光団であり、この蓄積により蛍光強度が低下します³。TMRMは、ミトコンドリア膜電位の相対的変化の指標として使用することも、蛍光シグナルをmVに変換することを可能にする定数を決定するための追加の実験により膜貫通電圧の正確な変化を定量化するために使用することもできます。マグネシウムグリーン(MgG)は、^Mg2+と結合すると蛍光を発する蛍光色素であり、マグネシウム二価陽イオン⁴に対するADPとATPの示差親和性に基づくATP合成の測定に使用されます。研究者は、特定の分析条件下でADPとATPの両方の特定の親和性/解離定数(Kd)を決定し、 MgG蛍光の変化をATP濃度の変化に変換します。アンプレックスUltraRed(AmR)は、ミトコンドリア呼吸中の過酸化水素およびその他のROSの生成を測定するために使用される蛍光色素です⁵。H 2 O₂とAmR(西洋ワサビペルオキシダーゼによって触媒される)との間の反応は、530nMの蛍光によって検出可能なレゾルフィンを生成する。これらのアッセイのそれぞれを、ミトコンドリア生理学のそれぞれの側面の同時測定を提供するために、リアルタイムのミトコンドリア呼吸のアッセイに個別に追加することができ、したがって、呼吸とミトコンドリア出力との間の直接的なリンクを提供する。

馬は、馬の骨格筋のミトコンドリア含有量が非常に高いこともあり、質量特異的酸素消費量が非常に高いため、この組織はミトコンドリア生理学の研究に非常に関連性があります。高解像度の肺活量測定の開発により、この新しい技術を使用した研究は、馬の顕著な運動能力と骨格筋疾患の病態生理学の両方に対する馬の骨格筋ミトコンドリアの寄与を定義するのに役立ちました6,7,8,9,10,11,12,13,14 .ウマ骨格筋ミトコンドリア機能の研究は、この組織を大量に得ることが非終末であるため、特に有利である。したがって、ウマの被験者は、ミトコンドリア機能の完全な特徴付けに十分な組織を提供するだけでなく、ミトコンドリア生理学に関する高品質で機械的な研究のための縦断的コントロールとしても機能します。このため、ウマ骨格筋におけるミトコンドリア生理学のより堅牢な特徴付けを提供するために、ミトコンドリア膜電位、ATP合成、およびこの組織における酸素消費量の測定を補完するROSの産生を定量化するための追加のアッセイが開発されました。

この研究は、オクラホマ州立大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。この研究では、4頭のサラブレッド騸馬(17.5±1.3年、593±45 kg)を使用して、代表的な結果を生成しました。

1. 骨格筋生検標本の採取

1. 半腱様筋(または他の関心のある筋肉)の中心から骨格筋生検(滅菌技術に従う)を取得し、軽い鎮静下で12 Gユニバーシティカレッジ病院(UCH)生検針( 資料表を参照)を使用し、以前に発表されたレポート¹¹に従って局所麻酔を使用します。
2. 生検標本を、氷冷生検輸送培地溶液(2.77 mM CaK 2-EGTA、7.23 mM K 2-EGTA、20 mM イミダゾール、20 mMタウリン、50 mM K-MES、0.5 mM ジチオスレイトール、6.56 mM MgCl₂、5.77 mM ATP、および15 mMホスホクレアチン、pH 7.1に調整したバイアルに移します;材料表を参照)。分析のために実験室に輸送する。
   注:生検輸送培地の調製に関する具体的な手順については、Doerrierら¹⁵を参照してください。
3. 製造元の指示に従って、市販のキットを使用して生検サンプルからミトコンドリアを分離します( 材料表を参照)。最終保存バッファーには、呼吸測定アッセイの一部であるADP、ATP、コハク酸塩などの基質が含まれていてはなりません。
4. ミトコンドリアの分離に使用した筋肉100 mgあたり80 μLの懸濁培地(225 mMマンニトール、75 mMスクロース、および1 mM EGTA; 材料の表を参照)を使用して、単離されたミトコンドリアの最終ペレットを再懸濁します。
5. 生検手順の時間からミトコンドリアの分離までの間隔を最小限に抑え、高解像度の呼吸計に追加されるまで、処理ステップ全体でサンプルを0〜4°Cに保ちます。
   注:予備研究では、孤立したミトコンドリアの懸濁液は、0〜4°Cに維持すると、約2時間後に機能能力を失い始めることがわかっています。

2.高解像度呼吸計のセットアップ

1. 高分解能呼吸計は、ミトコンドリア呼吸と関連プロセスを定量化するために使用されます。製造元が提供するソフトウェア制御プログラム( 材料表を参照)を使用して、呼吸計の制御、センサーのキャリブレーション、および生データの収集を行います。テスト条件ごとにサンプルを重複して分析します。
   注:すべての場合において、このプロトコルに記載されている推奨滴定と最終試薬濃度は、2mLの呼吸測定チャンバーに基づいています。
2. 製造元の指示に従って、亜ジチオン酸塩の連続滴定を通じて、2〜4週間ごとにバックグラウンドO₂ フラックスとO₂ センサーのゼロ点を決定します。キャリブレーションが繰り返されるまで、後続のアッセイのためにこれらのキャリブレーション定数を保持します。
   注:ミトコンドリアへのO 2の拡散制限を回避するために高酸素症(250〜500μM)が必要である透過処理筋線維^11,12,13,16を使用する以前に発表された手順とは対照的に、単離されたミトコンドリアは50〜200μM O₂の範囲を使用して評価できます。.これは、ミトコンドリア懸濁液を添加する前に(すなわち、毎日のシングルポイントキャリブレーションに続いて)呼吸媒体を室内空気と平衡化させることによって簡単に達成できます。同様に、呼吸チャンバの再酸素化は、酸素濃度を所望のレベルまで上昇させるのに十分な周囲酸素が呼吸測定媒体に溶解するまでチャンバを開くだけで達成することができる。
3. 呼吸計チャンバーにマグネシウムフリー培地(0.5 mM EGTA、60 mM K-ラクトビオネート、20 mMタウリン、10 mM KH₂PO₄、20 mM HEPES、110 mM スクロース、および1 g/Lウシ血清アルブミン[BSA]を基本的に脂肪酸フリーで充填し、pH 7.1に調整します; 材料の表を参照)。
   注意: 呼吸培地の準備に関する具体的な手順については、Komlodiら¹⁷ を参照してください。
   1. ウマの骨格筋の基礎温度を表すために器具のインキュベーション温度を38°Cに設定し、呼吸計チャンバーの底部で回転するマグネチックスターラーを使用して呼吸媒体の混合を800rpmに設定します。
   2. 蛍光センサーとの干渉を避けるために、チャンバー照明をオフにします。
   3. 800mVの分極電圧で酸素電極に通電し、得られた信号をゲイン設定1で増幅します。
   4. 2秒ごとに酸素濃度を記録し、酸素フラックスを前の40秒(20データポイント)の酸素測定値の負の傾きとして計算し、インキュベーション溶液のpmol x ^s-1 x mLとして報告します。
4. メディアが室内の空気と平衡になるようにして、酸素センサーを調整します。高分解能呼吸計で測定した気圧と標準大気酸素濃度に基づいて、基準酸素分圧を計算します。

3. TMRMを用いたミトコンドリア膜電位の測定

1. 「緑色」蛍光センサー(530 nmの主波長)を使用して、呼吸室からの蛍光信号を定量化します。センサーに400〜500mVで通電します。結果として得られる信号は、1:1,000のゲインで増幅されます。
   注意: センサーの線形範囲内で予想される信号をキャプチャするには、個々の機器に対して特定の設定を最適化する必要があります。
2. ミトコンドリアを添加する前に、TMRM(最終濃度2 μMに対して4 μLの1 mM溶液; 材料の表を参照)を追加します。
3. ミトコンドリアを添加する前に、蛍光シグナル(電圧)と蛍光色素の添加量(mM)の簡単な2点キャリブレーションを使用して、蛍光シグナルを校正します。
   注意: 機械制御ソフトウェアの蛍光信号校正機能を使用して、この信号を校正します。蛍光プローブからの生シグナルは、キャリブレーションの2番目のポイントを記録するために安定化するのに30分以上かかる場合があります。
4. 呼吸測定プロトコルの完了後、TMRM蛍光シグナルのさらなる増加が観察されなくなるまで、TMRM蛍光シグナルのさらなる増加が観察されなくなり、ミトコンドリア膜電位の完全な崩壊を示すまで、脱共役剤(シアン化カルボニルm-クロロフェニルヒドラゾン;滴定あたり2 μL)を数回送達することにより、TMRMシグナルの最終キャリブレーションを実行します(図1)。
   注:この蛍光シグナル値は0mV膜貫通電位に等しいと見なされ、呼吸滴定プロトコル中に記録された相対膜電位値の基準点として使用されます。

4. マグネシウムグリーン(MgG)を用いたATP生産量の測定

1. 「青色」蛍光センサー(465 nmの主波長)を使用して、呼吸室からの蛍光信号を定量します。個々の機器に対してこれらのセンサーに電力を供給して、センサーの線形範囲内で予想される信号をキャプチャします。
2. ミトコンドリアの添加後、基質の添加前に、MgG蛍光シグナルの化学的セットアップとキャリブレーションを実行します。呼吸測定チャンバーに8 μLの2 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を加えて、^MgGへの結合に関してMg 2+と競合する陽イオン(特に^Ca2+)をキレートし、次に4 μLの1 mM MgG(1.1 μM)を呼吸室に追加します。
3. 100 mM MgCl 2の10 x 2 μL逐次滴定で生の蛍光シグナルを校正し、滴定の合間に1分かけて蛍光シグナルを安定化させます(図2)。
   注:このプロセスは、アッセイの完了後、マシンの製造元および関連ソフトウェアが提供するテンプレートを使用してオフラインで完了し、 蛍光シグナルに対するマグネシウム濃度の2次曲線(予想されるr² > 0.98)、これは、既知の量のADPとともに使用されます 肺活量測定チャンバーに添加され、以前に決定_{されたCd値}を使用して、対応するATP11の濃度を決定します。
4. プロトコル全体の経時的なATP濃度の傾きであるATP合成の速度を決定します(図3)。

5. アンプレックスウルトラレッド(AmR)を用いたROSのミトコンドリア産生測定

1. 「緑色」蛍光センサー(530 nmの主波長)を使用して、呼吸室からの蛍光信号を定量化します。センサーを300〜400mVで通電します。結果として得られる信号は、1:1,000のゲインで増幅されます。個々の計測器の特定の設定を最適化して、センサーの線形範囲内で予想される信号をキャプチャします。
   注:MgCl 2を含まない呼吸培地を使用する場合は、AmRアッセイ用の試薬を追加する前に、これを追加する必要があります(1〜3 μM MgCl₂を生成するために100 mM MgCl₂を20〜60 μL)。
2. ミトコンドリアを添加する前に、AmRアッセイの化学的セットアップと初期キャリブレーションを実行します。30 μmolのDTPA(6 μLの5 mM溶液)を加えて反応を妨げる可能性のある陽イオンをキレートし、次にスーパーオキシドジスムターゼ(活性酸素生成をより包括的に検出するためにスーパーオキシドアニオンをH 2 O 2に変換する5,000 U/mLストック溶液₂μL)、西洋ワサビペルオキシダーゼ(5 μLの500 U/mLストック溶液)、 およびAmplex UltraRed(2 μLの10 mMストック溶液)(材料の表を参照)は、呼吸測定チャンバーでそれぞれ5 U / mL、1 U / mL、および10 μMを生成します。
3. 蛍光シグナルが安定するのを待ってから、0.2 μmolの過酸化水素(毎日作りたての40 μM溶液5 μL)を約5分間隔で2回加えます。
   注:_H2O2の2回の滴定前後の蛍光シグナルは、システムの3点線形検量線(予想されるr² > 0.95)を提供し、その傾きは、蛍光シグナルと_H2O2の生成(または添加)との関係を報告する際のシステムの全体的な応答性を反映しています。機械制御ソフトウェアの蛍光信号校正機能を使用して、この信号を校正します。
4. アッセイ全体を通して追加の2点キャリブレーション(毎日作りたての40 μM溶液5 μL)を実行し、アッセイ全体で呼吸測定の化学的性質が変化したときにアッセイの応答性を調整できるようにし、これらのキャリブレーションポイントの特定のタイミングは研究者の裁量で行います(図4)。

6. ミトコンドリア呼吸の測定

1. 15 μLの単離されたミトコンドリア懸濁液を各2 mLインキュベーションチャンバーに追加し(ステップ1.4)、結果が18.75 mgの筋肉のミトコンドリア収量を表すようにします。インキュベーションチャンバーを密閉します。各滴定の間にサンプルをボルテックスして、サンプルの均一な懸濁液を維持します。
2. 基質を添加する前に残留酸素消費量(ROX)を測定します。プロトコルの完了後、基質/脱共役剤/阻害剤滴定(SUIT)プロトコル¹¹の各ステップの酸素消費量値からこの値(通常は0.2 pmol O₂ x s-1 x ^mL-1未満)を差し引きます。
   注:酸素センサーと蛍光センサーの両方からの信号は、信頼できる結果を得るために滴定によって呼吸の全体的な状態が変化するため、少なくとも1分間安定させることが重要です(一次センサー信号の安定した計算された傾きによって評価されます)。これはすべての滴定ステップに適用されます。
3. 馬の骨格筋ミトコンドリア機能の初期特性評価を可能にする汎用SUITを使用してください。ピルビン酸(2 M水溶液5 μL)、グルタミン酸(2 M水溶液10 μL)、リンゴ酸塩(0.4 M水溶液10 μL)を各チャンバーに順次滴定して開始し( 材料の表を参照)、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)を生成し、複合体I_(LN)を介して酸化されたNADHによって支持される非リン酸化(リーク)呼吸を刺激します(図1、 図 3、 および図4)。
4. ADP(20 μLの500 mM水溶液; 材料の表を参照)を加えて、複合体I(P_N)を介したリン酸化呼吸を刺激します。
5. コハク酸塩(20 μLの1 M水溶液; 材料の表を参照)を添加し、複合体Iと複合体IIの組み合わせ(P_{N + S})を介してリン酸化呼吸を生成します。
   注:複合体Iと複合体IIの両方を介した呼吸の組み合わせにより、酸素消費量は、インキュベーション培地に溶解している酸素のほとんどを消費するのに十分高くなる可能性があります。O2濃度が50μM未満に減少した場合は、測定された_O2濃度が150μM以上に増加するまでインキュベーションチャンバーの封を開けてインキュベーション培地を再酸素化する。 ミトコンドリア呼吸に十分な_O2を維持するために、必要に応じてこのステップを繰り返します。
6. ロテノン(2 μLの0.1 mMエタノール溶液;材料の表を参照)を加えて複合体Iをブロックします。得られた酸素フラックスは、コハク酸塩単独の酸化(PS₎を介してミトコンドリアの酸素消費をサポートする複合体IIの容量を表します。
   注意: ロテノンは有毒物質です。標準的な実験室の安全性を使用し、摂取や吸入を避けてください。
7. 単一の生検のアリコートを含む個々の呼吸測定チャンバーにわたる特定の実験条件の平均値を計算します。
   注:フラックス制御比(FCR)などの派生計算は、さまざまな経路の相対的な変化を特定するのに役立ち、FCR_リーク(L N / P N)、FCR N(P N / P _{N +} S)、およびFCR S(P S / P_{N + S})が含まれます。計算された酸化的リン酸化効率(1-L N / P_{N + S})は、総呼吸能力に合わせて調整されたリーク呼吸の全体的な影響の推定値を提供します。

提案された基準状態は、健康な座りがちなサラブレッド(強制運動によるフィットネスの増加なし)と、ミトコンドリアに富むI型骨格筋繊維を高い割合で含み、安静時代謝に近い条件(すなわち、38°CおよびpH 7.0)でインキュベートされた姿勢筋の中心から収集された新鮮な筋肉サンプルです。これらの条件下で、研究者はL N値が2.71±0.90、PN 値が62.40 ± 26.22、PN + S値が93.67 ± 34.76、およびP S 値が46.93 ± 14.58 pmol O2 x s-1 x mL-1(図3および図4)。TMRMでインキュベートしたミトコンドリアの呼吸値は、その蛍光色素の阻害効果により低くなっています(図1)。FCRリーク、FCRN、および FCRS は、それぞれ 0.05 ± 0.01、0.66 ± 0.07、および 0.51 ± 0.07 です。計算された酸化的リン酸化効率は0.97±0.01である。これらの呼吸状態の絶対値は、個々の被験者および組織の酸化能力によって異なるが、これらの値の相対パターンは、透過処理されたウマ骨格筋線維からの公表された結果と一致している(すなわち、特定の基質の添加による呼吸の増加、複合体Iおよび複合体IIを介した呼吸の組み合わせは、電子伝達系の飽和のためにこれらの電子源のそれぞれよりも個々に少ない。 ダウンストリーム容量)。単離されたウマ骨格筋ミトコンドリアの計算された効率は、透過処理されたウマ骨格筋線維について報告された対応する値と一致する11。

ATP合成速度は、ミトコンドリアの分離に使用されるソース組織1mgあたり、PN呼吸で438.59 ± 397.10 pM x s-1、PN + S呼吸で383.18 ± 397.19、PS呼吸で172.07 ± 125.60と予想されています。コハク酸塩の添加によるATP合成の減少は、2つの電子供給によるETSのキノン接合部での競合による可能性が高く、複合体II(ミトコンドリア膜電位に直接寄与しない)からの供給は、複合体I(ミトコンドリア内膜を横切るプロトンのポンピングを通じてミトコンドリア膜電位に直接寄与する)を通る電子の流れを減少させる。

H 2 O2の生成速度は、ミトコンドリアを単離するために使用したソース組織1mgあたり、LN呼吸で0.079 ± 0.095 nmol.s-1、P N呼吸で0.021 ± 0.043、PN + S呼吸で0.026 ± 0.056、P S呼吸で0.237 ± 0.248と予想されています(図4)。ROS産生の相対速度は、ミトコンドリア膜電位の予測される大きさおよび高い膜電位とROS産生との関連と一致している。この関係の例外は、キノン接合部から錯体Iがロテノンによって遮断されたときに電子が逆流するため、呼吸が錯体IIのみを介して起こる場合の非常に高いROS産生である。

図1:馬骨格筋ミトコンドリア呼吸と相対膜電位の代表的な高解像度呼吸測定トレース。 上部のウィンドウは、チャンバーの酸素濃度(左側のY軸)と時間の経過に伴う酸素フラックス(右側のY軸)です(X軸)。下のウィンドウはチャンバーTMRM蛍光(左Y軸)と蛍光シグナル変化率(右Y軸)の経時変化率(X軸)です。垂直マークは、チャンバーへの特定の基質の添加を示します(mt:ミトコンドリア懸濁液;P:ピルビン酸;G:グルタミン酸;M:リンゴ酸;D: ADP;S:コハク酸塩;R:ロテノン;CCCP:カルボニルシアニドm-クロロフェニルヒドラゾン)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:マグネシウムグリーンのチャンバー蛍光シグナルのキャリブレーションとマグネシウムとアデニル酸塩のKd の決定の代表的な高分解能呼吸測定トレース。 チャンバーMgG蛍光(左Y軸)および蛍光シグナル変化率(右Y軸)経時変化率(X軸)。最初の垂直マークは、チャンバーへの特定の基質の添加を示します(MgG:マグネシウムグリーン; mt:ミトコンドリア懸濁液;P:ピルビン酸;G:グルタミン酸;M:リンゴ酸;S:コハク酸塩;EDTA:エチレンジアミン四酢酸)。これに続いて、蛍光シグナルを増加させる自動滴定ポンプ(TIP)を用いたMgCl2 の段階滴定、次いで蛍光シグナルを減少させるアデニル酸塩(この場合はATP)の段階滴定が続く。MgCl2 の滴定は、MgGシグナルを較正するために各アッセイの開始時にも使用されますが、ミトコンドリアおよびP、G、M、Sなどの呼吸測定基質を添加する前に行われます。 この 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:馬骨格筋ミトコンドリア呼吸とATP合成の代表的な高解像度呼吸測定トレース。 上部のウィンドウは、チャンバーの酸素濃度(左側のY軸)と時間の経過に伴う酸素フラックス(右側のY軸)です(X軸)。下のウィンドウはチャンバーMgG蛍光(左Y軸)と蛍光シグナル変化率(右Y軸)の経時変化率(X軸)です。垂直マークは、チャンバーへの特定の基質の添加を示します(mt:ミトコンドリア懸濁液;P:ピルビン酸;G:グルタミン酸;M:リンゴ酸;D: ADP;S:コハク酸塩;R:ロテノン)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:馬骨格筋ミトコンドリア呼吸およびH2O2の産生の代表的な高分解能呼吸測定トレース。上部のウィンドウは、チャンバーの酸素濃度(左側のY軸)と時間の経過に伴う酸素フラックス(右側のY軸)です(X軸)。下のウィンドウはチャンバーレゾルフィン蛍光(左Y軸)と蛍光シグナル変化率(右Y軸)経時変化率(X軸)です。垂直マークは、チャンバーへの特定の基質の添加を示します(mt:ミトコンドリア懸濁液;P:ピルビン酸;G:グルタミン酸;M:リンゴ酸;D: ADP;S:コハク酸塩;R:ロテノン)。また、H2O2を用いた蛍光シグナルの3つのアッセイ内2点較正も含まれる。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

著者は、この原稿に関連する利益相反はありません。