ニワトリ胚の脳内移植による腎オルガノイドの効率的な血管新生

サマリー

ここでは、ニワトリ胚のセロミック腔への腎臓オルガノイドの移植のための詳細なプロトコルを提示します。この方法は、8日以内にオルガノイドの血管新生と成熟の促進を誘発し、これらのプロセスを効率的に研究するために使用できます。

要約

ヒト人工多能性幹細胞由来の腎臓オルガノイドは、成人腎臓のネフロン様構造にある程度類似した構造を持っています。残念ながら、それらの臨床的適用性は、機能的な血管系の欠如、およびその結果としてのin vitroでの成熟の制限によって妨げられています。ニワトリ胚のセロミック腔への腎臓オルガノイドの移植は、糸球体毛細血管の形成を含む灌流血管による血管新生を誘発し、それらの成熟を促進する。この技術は非常に効率的であり、多数のオルガノイドの移植と分析を可能にします。この論文では、ニワトリ胚における腎臓オルガノイドの細胞内移植、それに続く灌流血管系を染色するための蛍光標識レクチンの注入、およびイメージング分析のための移植オルガノイドの収集のための詳細なプロトコルについて説明します。この方法は、オルガノイドの血管新生と成熟を誘導および研究するために使用でき、 in vitro でこれらのプロセスを強化し、疾患モデリングを改善するための手がかりを見つけることができます。

概要

ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)由来の腎臓オルガノイドは、発生研究1,2,3,4、毒性スクリーニング^5,6、および疾患モデリング^{5,7,8,9,10,11,12,13}の可能性があることを示しています。.しかしながら、これらおよび最終的な臨床移植目的へのそれらの適用性は、血管網の欠如によって制限される。胚性腎臓の発生中、足細胞、メサンギウム細胞、および血管内皮細胞(EC)が相互作用して糸球体の複雑な構造を形成します。この相互作用がなければ、足細胞、糸球体基底膜(GBM)、およびECからなる糸球体濾過バリアは、適切に発達することができません^14,15,16。in vitroの腎臓オルガノイドにはいくつかのECが含まれていますが、これらは適切な血管網を形成できず、時間の経過とともに減少します¹⁷。したがって、オルガノイドが未熟なままであることは驚くべきことではありません。マウスにおける移植は、腎臓オルガノイドの血管新生および成熟を誘導する¹⁸、^19、20、21。残念ながら、これは労働集約的なプロセスであり、多数のオルガノイドの分析には適していません。

ニワトリ胚は、1世紀以上にわたって血管新生と発生の研究に使用されてきました²²。それらは容易にアクセスでき、低メンテナンスを必要とし、完全に機能する免疫システムを欠いており、卵殻23,24,25,26を開いた後に正常に発達する可能性があります。絨毛尿膜(CAM)へのオルガノイドの移植は、血管新生につながることが示されています²⁷。しかしながら、CAM上の移植期間、ならびに移植片の成熟レベルは、CAM形成によって制限され、それは胚の7日目まで完了する。そこで、最近、ニワトリ胚のセロム内移植により、腎臓オルガノイドを効率的に血管新生・成熟させる方法が開発されました²⁸。ニワトリ胚のセロミック腔は、1930年代から胚組織の分化に好ましい環境であることが知られている^29,30。それは胚発生の早い段階でアクセスすることができ、移植片の全方向への比較的無制限の拡大を可能にする。

この論文は、4日目のニワトリ胚のセロミック腔へのhiPSc由来腎臓オルガノイドの移植のためのプロトコルを概説します。この方法は、8日以内に血管新生を誘導し、オルガノイドの成熟を促進します。胚を犠牲にする前に蛍光標識された水晶体凝集素(LCA)を注入することで、共焦点顕微鏡によるオルガノイド内の灌流血管の可視化が可能になります。

プロトコル

オランダの法律に従い、この研究には動物福祉委員会の承認は必要ありませんでした。

1. hiPS細胞由来腎オルガノイドの移植用調製

1. 高里らが開発したプロトコールを用いて、hiPS細胞を腎臓オルガノイドに分化させる^4,18,31.このプロトコルに従ったオルガノイドを、0.4 μmの細孔を有するポリエステル細胞培養インサート(細胞培養インサート)上で、分化の7日目+12日目まで培養します。各細胞培養インサートには3つのオルガノイドが含まれます。
2. 細胞培養インサートからオルガノイドを取り外します。
   1. 一対の解剖鉗子で細胞培養インサートの膜の中央に穴を開けます。解剖ハサミを使用して、細胞培養インサートの中央の穴から端まで膜に3つの切り込みを入れ、オルガノイド間を切ります。これにより、3つの膜が得られ、それぞれに1つのオルガノイドが付着し、それらは外縁で細胞培養インサートに接続されています。
   2. 一対の鉗子で外縁に近い膜片の1つをつかみ、細胞培養インサートから引き裂きます。オルガノイドを付着させた膜片をペトリ皿に入れる。脱水症状を避けるために、カルシウムとマグネシウムを含まないダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)(DPBS-^/-)を数滴オルガノイドに追加します。他の2つのオルガノイドについても繰り返します。
3. オルガノイドを鉗子で膜を所定の位置に保持し、両刃のステンレス鋼のかみそりの刃で半分に切断することにより、オルガノイドを二等分します(オルガノイド全体が大きすぎて、開発のこの段階ではセロムが収容できません)。2つのオルガノイドの半分を硬膜離片で膜からそっと押し出します。膜を廃棄し、移植までオルガノイドをDPBS-^/- のままにします。
   注:移植前にオルガノイドへのストレスを避けるために、一度に最大3つのオルガノイドを移植用に準備してください。理想的には、ある人がオルガノイドを準備し、別の人が移植を行います。

2.移植のための鶏胚の準備

1. 受精した白いレッグホーン卵を孵化させます。移植の正しいタイミングを確実にするために、腎臓オルガノイド分化7 + 8日目に卵の孵卵を開始します。
   1. 受精した白いレッグホーン卵(Gallus domestic us) をホルダーに水平に置きます(図1A; 0日目)、上向きの側面の中央を鉛筆でマークします。
      注意: カスタムメイドのプラスチックホルダーまたは卵パックのいずれかをホルダーとして使用して、卵を孵化させることができます。
   2. 卵の入ったホルダーを38 ± 1ºCの加湿インキュベーターに入れます(図1A; 0日目)。
   3. インキュベーター内の流域を満たしたまま、卵を3日間インキュベートします。
2. 孵卵の3日目に卵殻に窓を作ります。
   1. 孵卵の3日目に、卵の先のとがった先端(小さい方の端)に透明なテープの小片(~1 cm x 0.5 cm)を置きます。透明なテープの真ん中にある卵殻に、解剖ハサミの鋭い端で軽くたたくことで小さな穴を開けます。
   2. 卵黄嚢の損傷を避けて、5 mLシリンジの19 G針を45°の角度で穴に挿入し、卵から2〜3 mLの卵白を吸引して卵の中の胚を下げます。2枚目(~1 cm x 0.5 cm)の透明テープで穴を塞ぎます。
   3. 卵の鉛筆でマークされた上向きの側に透明なテープの大きな部分(~5 cm x 5 cm)を置きます。透明なテープの中央にある卵殻に、解剖ハサミの鋭い端で軽くたたくことによって穴を開けます(図1A; 3日目)。
   4. この穴から始めて、湾曲した解剖ハサミを使って卵殻の小さな円形の窓を切ります。このウィンドウを通して胚を見つけ、ウィンドウを拡大して胚へのアクセスを最適化します(図1A; 3日目)。
   5. 鉗子を使用して、胚の上に落ちた可能性のある大きな卵殻を取り除きます。プラスチックトランスファーピペットで胚にカルシウムとマグネシウム(DPBS+/+)を含むDPBS^を数滴入れ、卵殻でDPBS^+/+をピペットに吸引して、小さな断片を取り除きます。
   6. プラスチック製のトランスファーピペットを使用して、0.5%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したDPBS^+/+ を卵に3滴加えます。
   7. 大きな部分(~5 cm x 5 cm)の透明テープで窓を慎重に密封してから、胚がハンバーガー-ハミルトンステージ23-24(HH 23-24)³²にある孵卵4日目まで卵をインキュベーターに戻します。
      注:窓を密閉することは、胚の脱水や死を避けるために非常に重要です。
   8. テープを通して胚を見て、胚の生存率を毎日チェックします(脱水症状を避けるためにテープを剥がさないでください)。孵卵の最初の数日間、卵黄の色は胚の死時に明るい黄色からつや消しの黄色に変わります。死亡した胚を捨てる。
   9. インキュベーター内の流域を満たしたままにします。

3.インキュベーション4日目のイントラロミック移植

1. セロミックキャビティへのアクセスを取得する
   1. 湾曲した解剖ハサミで窓からテープを切り取ります。
   2. 卵を解剖顕微鏡下のゴムホルダーまたは卵パックの上に置きます。
   3. ニワトリ胚は現在HH 23-24にあり、左側に横たわり、右側が視聴者に面しています(図1A; 4日目)。セロムはこれらの2つの四肢芽の間でアクセスされるため、胚の右翼と脚のつぼみを見つけます。右翼と脚のつぼみの間の領域に、2対の解剖鉗子で保持し、反対方向にゆっくりと引っ張ることにより、卵子膜、絨毛膜、羊膜に連続して開口部を作ります。
      注:卵子膜は、卵を開いた後に最初に遭遇した膜であり、場合によっては、3日目に窓を作った後にすでに損傷しています。胚が回転している場合、左側が視聴者に面して右側に横たわっています(図1A; 4日目)、移植を可能にするためにそれを好転させる必要があります。これを行うには、卵子膜と絨毛膜に大きな開口部を作り、次に鉗子を使用して慎重に胚を回転させます。
   4. セロミック腔への遮るもののないアクセスがあるかどうかを確認します:一対の解剖鉗子で翼と四肢のつぼみの間の体壁の端をそっとつかみ、それを視聴者に向かってわずかに引っ張ります。セロミックキャビティははっきりと見えなければなりません。鈍いが細い器具(例:マイクロメスホルダーの鈍いタングステン線)をセロミックキャビティに挿入します。
      注意: 鈍い器具をセロミックキャビティに挿入できない場合は、1つまたは複数のメンブレンが適切に開かれていないことを意味します。
2. 移植
   1. 硬膜ディセクタを使用して、尿膜の上の卵の中に半分のオルガノイドを置きます。
   2. 解剖鉗子を使用して、体壁の端を注意深くつかみ、それを視聴者に向かってわずかに引っ張って、セロムへの開口部が見えるようにします。
      注意: 体壁の血管を傷つけないでください。
   3. マイクロメスホルダーに鈍いタングステンワイヤーを使用して、オルガノイドを体壁の開口部に向かってゆっくりとセロムに移動します。オルガノイドを少し頭蓋骨に押して、セロムの中に閉じ込めます。これで、翼のつぼみのすぐ後ろに見えるようになりました(図1A; 4日目)。
   4. プラスチック製のトランスファーピペットを使用して、DPBS^+/+ を卵に3滴加えます。
   5. 大きな部分(~5 cm x 5 cm)の透明テープで窓を慎重に密封してから、孵卵の12日目(移植後8日)まで卵をインキュベーターに戻します。
   6. テープを通して胚を見て、胚の生存率を毎日チェックし続けます(脱水症状を避けるためにテープをはがさないでください)。死亡した胚を捨てる。
      注:胚とその絨毛尿膜が成長するにつれて、それらはテープを通してよりはっきりと見えるようになります。胚による動きの欠如および虚脱またはまばらな血管は、胚死の兆候である。
   7. インキュベーター内の流域を毎日チェックし、満たしてください。

4. 蛍光標識レクチンの注入

1. 注射の準備
   1. 次の設定でマイクロピペットプラーでガラスマイクロキャピラリーを引っ張って、ガラスマイクロ注射針を作ります: ヒート533、プル60、速度150、時間200。解剖顕微鏡を覗きながら、解剖鉗子を使用してマイクロインジェクション針の先端を慎重に切り離し、開口部を作ります。
      注意: マイクロピペットプラーに必要な設定は、機械によって異なる場合があります。
   2. 注入システムを組み立てます。38 cmのシリコンチューブを2本取り、0.2 μmのフィルターを挟んで互いに接続します。フィルター出口に接続されているチューブの端にマウスピースを挿入し(シリコンチューブ1)、フィルター入口に接続されているチューブの端にコネクタを挿入します(シリコンチューブ2)。最後に、マイクロインジェクションニードルをコネクタに挿入します(図1B)。
   3. 蛍光標識した水晶体凝集素(LCA)をDPBS-^/- で0.5 mLチューブ中で2.5 mg ^mL-1 の濃度に希釈し、微量遠心分離機で~30秒間スピンダウンして凝集体をチューブの底に移動します。
   4. 20 μLのLCAをパラフィルム片にピペットで移します。
   5. パラフィルムから20 μLのLCAを組み立てられた注入システムのマイクロキャピラリー針に吸引します。
2. 注射
   1. 湾曲した解剖ハサミで窓からテープを切り取ります。卵を解剖顕微鏡下のゴム製ホルダーに入れます。
   2. 血管系を評価し、わずかに明るい赤色で動脈と区別できる静脈を見つけます(図1A; 12日目)。血管系へのアクセスを改善するために、湾曲した解剖ハサミで切断することによって慎重に窓を拡大する。アクセス可能性とサイズに基づいて注射する静脈を選択します。
   3. マイクロキャピラリー針の先端を選択した静脈に0°〜20°の角度で挿入します。先端をゆっくりと左右に動かして、針が静脈にあることを確認します。LCAを注入するために、注入システムに穏やかかつ着実に吹き込みます(図1A; 12日目)。
      注意: 静脈の針が正しい位置にある場合、それは静脈の境界内にとどまるはずです。
   4. 卵をインキュベーターに10分間戻し、LCAを循環させます。
      注:この間、卵をテープで密封する必要はありません。

5.インキュベーション12日目に移植オルガノイドを採取

1. 鶏胚を犠牲にする
   1. 卵をベンチのゴム製ホルダーに入れます。湾曲した解剖ハサミで窓からテープを切り取ります。次に、湾曲した解剖ハサミで胚を囲む膜を切り取ります。
      注:このステップでは、解剖顕微鏡は必要ありません。
   2. 穴あきスプーンで卵から胚をすくい上げ、すぐにハサミを使って胚を斬首します。胚の体を解剖顕微鏡下のペトリ皿に入れる。
2. オルガノイドの検索と収集
   1. 胚をペトリ皿に仰向けに置き、手足を広げます。
   2. 鉗子を使用して縦軸に沿って胚の腹壁を慎重に開きます。
   3. 胚の中のオルガノイドを見つけます。オルガノイドは、尾側または胸郭のすぐ下の頭蓋のいずれかで、最も頻繁に右肝葉に付着します(図1A; 12日目)。したがって、これらの場所を調べることから始めることをお勧めします。
   4. オルガノイドが見つかったら、マイクロハサミで胚の周りを切り取って胚から取り除きます。オルガノイドとそれに必然的に付着しているニワトリ組織を解剖顕微鏡下のペトリ皿に入れる。両刃のステンレス鋼のかみそりの刃でできるだけ多くの鶏の組織を取り除きます。
   5. 目的の分析に応じてオルガノイドを処理します。

6. ホールマウント免疫蛍光染色

1. 移植したオルガノイドを24ウェルプレートに入れ、500 μLの4%パラホルムアルデヒド(PFA)に4°Cで24時間固定します。DPBS-^/-で3回洗浄します。
2. オルガノイドを300 μLのブロッキング溶液(DPBS-/-10%ロバ血清中の0.3%^Triton-X を含む)に室温で2時間透過処理してブロックします。
3. 一次抗体ミックスを調製します:1つのオルガノイドに対して、一次抗体NPHS1(ヒツジαヒト、1:100希釈)、CD31(マウスαヒト、1:100希釈)、およびLTL(ビオチン結合、1:300希釈)を300 μLのブロッキング溶液で希釈します。抗体ミックスをオルガノイドに加え、4°Cで72時間インキュベートします。
4. DPBS-^/-で0.3%トリトンXで3回洗浄します。
5. 二次抗体ミックスを調製します:1つのオルガノイドに対して、二次抗体ロバαヒツジAlexa Fluor 647(希釈1:500)、ロバαマウスAlexa Fluor 488(希釈1:500)、およびストレプトアビジンAlexa Fluor 405(希釈1:200)を300 μLのブロッキング溶液で希釈します。二次抗体ミックスをオルガノイドに加え、室温で2〜4時間インキュベートします。二次抗体が光にさらされないようにアルミホイルで覆います。
6. DPBS-^/-で3回洗浄します。
7. オルガノイドを35 mmガラス底皿の~30 μLの封入剤に包埋し、アルミホイルで覆った室温で一晩乾燥させます。4°Cで保存してください。
8. 共焦点顕微鏡を用いた画像。

結果

hiPS細胞から腎臓オルガノイドへの分化、ニワトリ受精卵のインキュベーション、腎臓オルガノイドの移植、LCAの注入、およびオルガノイドの収集の方法とタイムラインを 図1Aにまとめます。オルガノイド分化と鶏卵孵化のタイミングを調整し、孵卵の15日前に分化を開始することが重要です。インキュベーションの0、3、4、および12日目のアクションは、タイムラインの下の写真で示されています。オルガノイドは、分化の7日目+12日目に4日目(HH 23-24)ニワトリ胚に移植される。LCAは、移植の8日後に胚の静脈系に注入され、灌流された血管系を染色してから、胚を犠牲にしてオルガノイドを回収します。組み立てられた射出システムを 図1Bに示します。

ニワトリ胚は孵卵の12日目に屠殺される(図1A)。胚を注意深く解剖すると、移植されたオルガノイドは通常肝臓に付着していることがわかります。解剖顕微鏡を通して見ると、血管新生してい...

ディスカッション

この原稿では、ニワトリ胚におけるhiPS細胞由来腎臓オルガノイドの細胞内移植のためのプロトコルが実証されています。移植時に、オルガノイドは、ヒトオルガノイド由来ECとニワトリ由来ECの組み合わせからなる灌流血管によって血管新生されます。これらはオルガノイド全体に広がり、糸球体構造に侵入し、ECと足細胞間の相互作用を可能にします。これがオルガノイド糸球体および管状構造の成熟の増強をもたらすことが以前に示された²⁸。移植は非常に効率的で、胚あたり~5分かかり、胚が必要とする唯一のメンテナンスは、インキュベーター内の水盤の定期的な補充です。したがって、この方法は多数のオルガノイドの分析に非常に適しています。

腎臓オルガノイドの血管新生および成熟は、マウスへの移植を通じて以前に実証されている^18,20。これらの労働集約型マウスモデルでは、オルガノイドを2〜最大12週間移植しました。ここに示すセロム内移植実験では、移植期間は8日...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.2 &マイクロ;mフィルター:Whatman Puradisc 30シリンジフィルター0.2µm	Whatman	10462200
35mmガラス底皿	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
校正済みマイクロキャピラリーピペット用アスピレーターチューブアセンブリ	Sigma-Aldrich	A5177-5EA	シリコンチューブ、マウスピース、コネクタが含まれています
共焦点顕微鏡:ライカ白色光レーザー共焦点顕微鏡	ライカ	TCS SP8
解剖用鉗子、簡易タイプ。チタン、湾曲、細かい鋭い先端を持つ	ハンマッハーカール	HAMMHTC091-10
剖鉗子、シンプルタイプ。チタン、ストレート、先端が細かく鋭い	ハンマッハー カール	HAMMHTC090-11
解剖顕微鏡	Wild Heerbrugg	355110
解剖ハサミ、湾曲、OPスペシャル、エクストラシャープ/シャープ	ハンマッハー カール	HAMMHSB391-10
ドンキー血清	Sigma-Aldrich	D9663
ドンキー-&α;-マウス Alexa Fluor 488 サーモ	フィッシャーサイエンティフィック	A-212-02	希釈率 1:500
ドンキー-&α;-羊 アレクサフロー 647	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A-21448	希釈 1:500
両刃のステンレス鋼のカミソリの刃	Electron Microsopy Sciences	72000
DPBS、カルシウム、マグネシウム (DPBS-/-)	ThermoFisher Scientific	14040133
DPBS、カルシウム、マグネシウムなし (DPBS+/+)	ThermoFisher Scientific	14190094
卵パックまたはカスタムメイドの卵ホルダー	NA	NA
受精した白いレグホーン卵 (Gallus Gallus Domesticus)	ドロスト・ルーズドレヒト B.V.		NA
インキュベーター	Elbanton BV	ET-3 combi
Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated	Vector Laboratories	B-1325	希釈率 1:300
マイクロハサミ、ストレート、シャープ/シャープ、切断長さ 10 mm	Hammacher Karl	HAMMHSB500-09
マイクロキャピラリー:薄肉ガラスキャピラリー 1.5 mm、フィラメント	World Precision Instruments	TW150F-3
マイクロピペットプーラー	サッター機器会社	モデルP-97	私たちは次の設定を使用します:熱533、プル60、速度150、時間200
マイクロメスホルダー:カストロビエホブレードとピンホルダー、12センチメートル、丸ハンドル、円錐形10ミリメートルの顎。	ユーロネクシア	L-120
封入材 プロロングゴールド 色あせ防止剤	サーモフィッシャーサイエンティフィック	P36930
オリベクロナデュラディセクタ18cm	レダ	41146-18
パラフィルム	ヒースロー・サイエンティフィ	HS234526B
ペニシリン・ストレプトマイシン 5,000 U/mL	サーモフィッシャー・サイエンティフィ	15070063
穴あきスプーン	ユーロネクシア	S-20-P
シャーレ 60 x 15 mm	CELLSTAR	628160
プラスチックトランスファーピペット	サーモフィッシャーサイエンティフィック	PP89SB
精製マウス抗ヒトCD31抗体	BD Biosciences	555444	希釈 1:100
ローダミン標識レンズ Culinaris 凝集素 (LCA)	Vector Laboratories	RL-1042	この製品は最近販売を終了しました。Vectorlabsは、Dylight 649標識LCA(DL-1048-1)およびフルオレセイン標識LCA(FL-1041-5)
ヒツジ抗ヒトNPHS1抗体	R&;D systems	AF4269	希釈 1:100
滅菌皮下注射針、19 G	BD microlance	301500
ストレプトアビジン Alexa Fluor 405	ThermoFisher Scientific	S32351	希釈 1:200
シリンジ 5 mL	BD エメラルド	307731
透明テープ	テサ	4124	ほとんどの金物店で入手可能
Triton X	Sigma-Aldrich	T9284
タングステンワイヤー、直径0.25 mm	サーモフィッシャーサイエンティフィック	010404.H2