ショウジョウバエの自発運動活性をアッセイする簡単な技術

サマリー

本プロトコルは、オープンソースソフトウェアフィジーを使用して手作りのアリーナでのハエの動きを追跡および分析することにより、ショ ウジョウバエ の自発運動を評価し、高解像度ビデオ録画に基づいて各フレームのピクセルをセグメント化し、速度、距離などのパラメータを計算するプラグインと互換性があります。

要約

ショウジョウバエは 、高度な遺伝子操作技術が豊富で、多様な行動特徴があるため、さまざまな疾患を研究するための理想的なモデル生物です。動物モデルにおける行動不全の特定は、例えば、患者が運動機能の障害を経験することが多い神経変性疾患において、疾患の重症度の重要な尺度である。しかし、薬物治療やトランスジェニック個体など、ハエモデルの運動障害を追跡および評価するためのさまざまなシステムが利用できるため、複数の角度から正確に評価するための経済的でユーザーフレンドリーなシステムはまだ不足しています。ここでは、フィジーの画像処理プログラムと互換性のある AnimalTracker アプリケーションプログラミングインターフェース(API)に基づく手法を開発し、記録されたビデオから成虫と幼虫の両方の個体の移動活動を体系的に評価し、追跡行動の分析を可能にします。この方法は、行動を記録および分析するために高解像度カメラとコンピューター周辺機器の統合のみを必要とするため、トランスジェニックまたは環境行動障害のあるハエモデルをスクリーニングするための手頃な価格で効果的なアプローチになります。薬理学的に処理されたハエを用いた行動試験の例を挙げて、成虫のハエと幼虫の両方の行動変化を再現性の高い方法で検出する方法を示します。

概要

ショウジョウバエメラノガスターは、遺伝子改変¹、薬物治療²、老化³によって作成された神経疾患モデルにおける細胞および分子機能を調べるための優れたモデル生物を提供します。ヒトとショウジョウバエの間の生物学的経路、物理的特性、および疾患関連ホモログ遺伝子の高い保存により、ショウジョウバエは分子レベルから行動レベル⁴までの理想的な模倣になります。多くの疾患モデルにおいて、行動不全は重要な指標であり、さまざまなヒトニューロパシーに有用なモデルを提供します^5,6。ショウジョウバエは現在、複数のヒト疾患、神経発達、およびパーキンソン病や筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患の研究に使用されています^7,8。疾患モデルの運動能力を検出することは、病原性の進行を理解するために重要であり、疾患プロセスの根底にある分子メカニズムとの表現型の相関関係を提供する可能性があります。

最近、市販のソフトウェアツールと費用対効果の高いプ....

プロトコル

W¹¹¹⁸ 成虫のハエと3齢幼虫を本研究に用いた。

1. 実験準備

注: ショウジョウバエ の移動追跡のためのオープンフィールドアリーナは、無色無臭のシリカゲルで作られています。

1. 試薬Aと試薬Bを、シリカキットの製造元の説明書に従って1:10の比率で混合します( 材料表を参照)。色が白に変わるまで攪拌することにより、重炭酸ナトリウムが混合物に添加されていることを確認します。混合物をきれいなペトリ皿に移し、40°Cのオーブンに入れて48時間乾燥させます。
2. HDカメラ( 材料表を参照)を三脚にセットし、カメラのレンズがシリカアリーナの表面に垂直になるように調整します。カメラの焦点距離と絞りを調整し、カメラがシリカの表面に焦点を合わせ、ディスプレイが適切に照らされていることを確認します。実験のセットアップを 図1に示します。
3. フライをオープンフィールドアリーナに移して、少なくとも61秒の連続ビデオを録画します。
   注:幼虫の鈍い性質を考慮すると、10分以上のビデオ録画時間をお勧めします。
   1. フィジーでビデオを開き、進行状況バーを最初のフ....

結果

本研究では、ロテノンで処理された成虫のハエと3齢幼虫の自発運動障害を調べ、薬物溶媒ジメチルスルホキシド(DMSO)を与えられた対照ハエの運動活動と比較しました。ショウジョウバエにおけるロテノンによる治療は、脳²²においてドーパミン作動性ニューロン喪失を引き起こし、重大な自発運動障害²³を引き起こすことが示されている。図11および図12に示すように、ロテノンで処理された成虫のハエおよび3齢幼虫は、DMSOを与えられた対照のハエと比較して有意な自発運動障害を有する。図11および図12B-Eは、ロテノンの有無にかかわらず処理されたハエ間の移動パラメータの距離、速度、および不動時間の相対的な変化を示しています。図

ディスカッション

フィジーの画像処理プログラムと互換性のあるオープンソースの AnimalTracker APIに基づいて、研究者が成虫と個々の幼虫の両方のハエを追跡することにより、自発運動活動を体系的に評価できるようにする方法を設計しました。 AnimalTracke はJavaで書かれたツールであり、既存のデータベースや他のツールに簡単に統合して、アプリケーションで設計された動物の追跡行動の分析を容易にすることができます²⁴。成虫と幼虫の運動活動を数値化するソフトウェア計算式によるフレームごとの分析により、移動速度、移動距離、不動、方向変化角度などのいくつかのパラメータを柔軟に分析できます。行動移動のさまざまな側面を表すこれらのパラメータは、時間の経過に伴う自発運動の変化を示すためにプロットできます。さらに、グラフィカルユーザーインターフェイスを作成し、その使用法に関する詳細なドキュメントを提供し、アプリケーションプログラミングインターフェイスを提供することにより、プログラミングの経験がない研究者やカスタム実験パラダイムを作成する経験豊富なユーザーがこの方法にアクセス.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
アニマルトラッカー	脳研究プログラムバージョン	:1.7	pfficialウェブサイト:http://animaltracker.elte.hu/main/downloads
カメラソフトウェア	Microsoft	バージョン:2021.105.10.0	Windows10システム
コンピューターDELL	Vostro-14-5480win10	システムを実行しているコンプレッサーが利用可能です
ショウジョウバエ二酸化炭素麻酔ワークステーション	Wu han Yihong technology	#YHDFPCO2-018	:http://www.yhkjwh.com/
フィジーソフトウェア	フィジーチーム	バージョン:1.53v	公式サイト:https://fiji.sc/
フォーマット工場ソフトウェア	Pcfreetime	バージョン:X64 5.4.5	公式サイト:http://www.pcfreetime.com/formatfactory/CN/index.html
グラフパッドプリズム	GraphPadソフトウェア	バージョン:8.0.2	公式サイト:https://www.graphpad-prism.cn
高精細カメラ	TTQ	Jingwang2(HD1080P F1.6 6-60mm)	公式サイト:http://www.ttq100.com/product_show.php?id=35
Officeソフトウェア	Microsoft	バージョン:office 2019	公式サイト:https://www.microsoftstore.com.cn/software/office
シャーレ	Bkman	110301003	サイズ:60mm
シリカゲル	ダウ	シルガード184シリコーンエラストマーキット	指示に従ってよく混ぜ
重炭酸ナトリウム	マックリン	#144-55-8	シリカゲルとよく混ぜる

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