本プロトコルでは、 ネッタイシマカ の一般的な生活パラメータデータ(繁殖力、翅の大きさ、繁殖力、性比、生存率、発育時間、男性の寄与度、成体の寿命など)を測定する方法を説明しています。これらの測定値は、トランスジェニック蚊の適応度を評価するために使用できます。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
トランスジェニック蚊は、野生型の蚊と比較して、しばしば適応度を示します。この点で、フィットネスコスト研究では、遺伝子組み換え蚊から生命パラメータデータを収集し、それらを同じ遺伝的背景からの導入遺伝子を欠く蚊と比較することが含まれます。この原稿は、ネ ッタイシマカの一般的な生活史形質(繁殖力、翼のサイズと形状、繁殖力、性比、生存率、発育時間、男性の寄与、成虫の寿命など)を測定する方法を示しています。これらのパラメータは、生殖の成功を反映し、測定が容易で、文献で一般的に報告されているために選択されました。代表的な結果は、遺伝子ノックアウトまたは遺伝子駆動要素の単一挿入のいずれかに関連する適応コストを定量化します。生命パラメータデータの収集方法を標準化することは重要です。なぜなら、このようなデータは、研究間で生成されたトランスジェニック蚊の健康状態を比較したり、シミュレートされた野生型蚊の集団における導入遺伝子固定率をモデル化したりするために使用できるからです。このプロトコルはトランスジェニック ネッタイシマカに特異的ですが、このプロトコルは他の蚊の種や他の実験的治療条件にも使用できますが、特定の生物学的状況では特別な適応が必要になる可能性があることに注意してください。
概要
適者生存とは、ダーウィンの考えで、自分の環境に最も適した遺伝子を持つ個人は、その遺伝子を次の世代に受け継ぐというものです1。これは、彼らの遺伝子が生き残るかどうかを決定するのはフィットネスであることを意味します。この150年以上の歴史を持つ概念は、おそらく、遺伝子組み換え蚊の遺伝子ドライブを成功させるための最も重要な決定要因です。遺伝子ドライブ、または利己的な遺伝的要素の超メンデル遺伝パターンは、それが集団2を通じて広がるのを可能にし、遺伝的害虫管理3のために探求されています。ベクターコントロールの文脈では、この戦略は、野生型(WT)の節足動物を病原体に耐性のある節足動物に置き換える(集団改変)か、それらをすべて一斉に排除する(集団抑制)かのいずれかを目指しています4。しかし、トランスジェニック蚊は、WT蚊と比較して適応度コスト(遺伝的負荷とも呼ばれる)を示すことが多く、これは、トランスジェニック蚊が彼らを凌駕できる集団で失われることを意味します。したがって、導入遺伝子を遺伝子ドライブシステムと結合させることは、適応度コストを相殺し、導入遺伝子を典型的なメンデル遺伝から予想されるよりも高いレベルで集団全体に押し出すために必要です4。
蚊媒介生物種全体の実験室研究は、導入遺伝子がしばしば適応度を示すことを示しています5,6,7。たとえば、Irvin et al. Drosophila actin 5Cまたは合成3XP3プロモーターの下で増強緑色蛍光タンパク質(eGFP)またはトランスポゼース遺伝子を発現するように操作されたネッタイシマカ(ae.)の様々な生命パラメータを測定し、それらを野生型のオーランド株(それらが由来したのと同じ遺伝的背景)と比較した5。最も注目すべきは、すべてのトランスジェニック株が生殖適性を有意に低下させたことです5。導入遺伝子に依存して、マラリア原虫の発達を阻害する導入遺伝子を発現する一部のハマダラカ(An.)蚊も適応度コストを示しました6。具体的には、構成的または血粉誘導性プロモーターの下でハチ毒ホスホリパーゼ(PLA2)を発現するAn. stephensiは、対照と比較して産卵数が有意に少なかった6。また、これらの著者らは、異なる導入遺伝子であるSM1ドデカペプチド四量体を発現するトランスジェニックハマダラカが適応度コストを示さなかったことを発見し、導入遺伝子による適応コストは、少なくとも部分的には産生されるトランスジェニックタンパク質の効果に依存していると結論付けた6。実際、適応度コストは、実験室で飼育された系統における導入遺伝子産物、位置効果、オフターゲット効果、挿入突然変異誘発、または近親交配効果に起因する可能性がある7。したがって、遺伝子ドライブは、これらの導入遺伝子による適応コストを相殺するのに十分な堅牢性を備えている必要があり、同時にドライブ自体をブロックする挿入や欠失(インデル)の発生も回避する必要があります。
発達または生殖フィットネスのコストは、実験室またはケージの研究7で測定できますが、フィールドの未知の要因も影響を与える可能性があるという注意点があります。それにもかかわらず、遺伝子ドライブプログラムなどの遺伝子組み換え蚊の放流を計画または評価する際の重要な最初のステップであり、トランスジェニック系統が次の世代にわたって持続するかどうかを判断します。例えば、Hammond et al. 評価 ガンビアのCRISPR/Cas9ベースの遺伝子ドライブは、女性の生殖能力に必要な遺伝子を破壊することを意図しています8。著者たちは、少なくとも25世代にわたって維持されたケージの研究を通じて、蚊がCRISPRを標的とした切断をブロックし、女性の生殖能力を回復させる遺伝子駆動抵抗性対立遺伝子を引き起こしたことを発見しました8。彼らのモデリング努力は、遺伝子ドライブに対してヘテロ接合体である女性の生殖能力が、シミュレートされた条件での遺伝子ドライブの固定に最も劇的な影響を与えたことを示唆しました8。これと同じ方針で、Ae. aegypti(ヒッグス白眼科、HWE)は、異なるプロモーターまたは異なる遺伝子間遺伝子座で自律的な遺伝子ドライブカセットを発現するように操作され、シミュレートされた集団で異なる遺伝子ドライブ固定率を示しました9。著者らは、MGDrivEモデリング10を用いて、測定されたインデル形成率、母体への影響、および実験室で収集された生命パラメータデータを組み合わせて、シミュレートされた条件9において、蚊の適応度が遺伝子ドライブの持続性に最も強く影響することを発見した。遺伝子ドライブ効率を損なう可能性が最も高い適応度コストは、内因性ドライブ自体ではなく、体細胞Cas9(過剰)発現または特にヘテロ接合体において標的とされる遺伝子に起因する11,12,13,14,15,16,17。
その重要性を考えると、適応度はトランスジェニック系統がその後の世代にわたって持続する能力にとって重要な要素であり、導入遺伝子に関連するあらゆる生理学的効果の指標として使用することができます。例えば、オフターゲット効果は、フィットネスコストと関連している可能性がある。この場合、トランスジェニック系統を数世代にわたって戻し交配することが推奨される。さらに、トランスジェニック集団が現実世界でどの程度競争できるかを調査するために、トランスジェニックラインをフィールド集団を反映するラインと交差させることも必要になる場合があります。適応度コストを定量化して比較できるようにするために、この原稿では、Ae. aegypti蚊の一般的な生活史形質を測定するための簡単なプロトコルを提供し、特に導入遺伝子に関連する適応度コストに重点を置いて、そのような研究をより簡単に再現できるようにしています。プロトコルには、繁殖力、生殖能力、性比、生存率、発育時間、男性の貢献、および成人の長寿が含まれます。翼の長さと面積の測定は、胸部の長さ18,19および体の大きさの測定値と相関するため、フィットネス測定値としても選択されました。これは、血液ミールのサイズ、繁殖力、および免疫力20,21に直接関連しています。フィットネスを評価する方法はたくさんありますが、これらのパラメーターが選択されたのは、生殖の成功を反映しており、測定が簡単で、文献で一般的に報告されているためです。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
注:このプロトコルは、以前に検証され確立されたトランスジェニックおよび野生型の Ae.aegypti 系統用に書かれています。トランスジェニック Ae. aegyptiの生成の詳細については、Kistler et al.22およびCoates et al.23.以下に概説するすべての実験は、標準的な Ae.aegypti 飼育手順の下で行われました。蚊は28°C、相対湿度75%〜80%、明暗サイクル12時間/暗度12時間で維持されました。統計上の目的のために、蚊の汚れごとに最低100枚の卵用紙を強くお勧めします。包括的なフィットネススタディは、完了するまでに約3か月かかります(図1)。
1. 雌の蚊の繁殖力の測定
- トランスジェニック蚊とWT蚊(遺伝的背景は同じですが、導入遺伝子がない)を孵化させます 卵の紙を昆虫の滅菌水に一晩入れます、標準的な飼育条件に従って。数滴(各約50μL)の魚のすりつぶし(テトラミン)スラリー(約30%w / v)を提供することにより、幼虫が自由に餌をやるようにします。最初の幼虫は、孵化後1日で認識できます。密集がないように幼虫を大きな容器に入れ、通常、100〜150匹の幼虫を表面積約250cm2の1Lの水で飼育できます。テトラミンスラリーを食料源として提供し続け、幼虫が自由に餌を与えることができるようにします。幼虫が常に十分な食物を利用できるように、そして水が濁って見えないように、個別の液滴に食品スラリーを追加します。幼虫はインスターごとにサイズが大きくなり、最終的には幼虫の鍋で蛹化します。
- 蛹が出現し始めたら、孵化後~5〜6日で、性別ごとにそれらを分離して、成虫が出現したときに(その後の交配のために)成虫が処女であることを確認します。
- 蛹を性別で分類するには、まず3mLのプラスチック製ピペッターを使用して、きれいな水道水が入った小さなプラスチックカップに蛹を摘み取ります。オスの蛹は、メスに比べて小さく、最初に出現する傾向があります。まず、蛹をサイズで並べ替えてから、この初期画面を形態で確認します。
- 蛹をガラス製の顕微鏡スライドに移し、ティッシュで余分な水分を取り除きます。これにより、蛹が動けなくなります。2倍から4倍の倍率のステレオスコープの下で、先端が細かく付けられた絵筆を使用して、蛹の腹側を上にして配置します。
- 尾を視覚的に分析して、生殖葉の形状の違いを確認します(パドルの後ろの蛹腹部セグメントの端にあります。図 2)。女性は性器葉を超えて伸びる尖ったひれを持っており、おおよそクラウンや吸血鬼の歯に似ていますが、男性の生殖葉は丸みを帯びており、これらの尖った構造を持っていません。Carvalho et al. を参照。追加の数字については24。
- オスとメスの蛹を別々のウォーターカップに入れ、適切な封じ込め、たとえば、1.9 L カートン (1/2 ガロンまたは 64 オンス) と 0.2 m x 0.2 m (8 インチ x 8 インチ) の白いオーガンジー生地にそれぞれ ~150 匹の蛹を入れます。
- ケージの上部に砂糖と水源を用意します(例:レーズンとガーゼで覆われた水入りカップを2本の輪ゴムで固定します)。カートンにペンサイズの穴を開け、ゴム栓で覆って、ケージが出てきたときに追加の蛹を追加できるようにします。
- 成虫の出現後3〜5日で、カートンを4°Cに2~5分間置いて蚊に麻酔をかけます。蚊はまだけいれんする可能性がありますが、大多数がカートンの底に落ちると、蚊は十分に麻酔されます。蚊を氷の上のガラスのペトリ皿に30分~1時間置きます。
注:蚊を4°Cに長時間放置すると、蚊の健康に大きな影響を与える可能性がありますが、氷の上に最大1時間放置しても影響は見られません。 - 交差WTまたはトランスジェニックGD1またはGD29(CRISPR/Cas-9ベースの遺伝子ドライブ)オスと処女WT(対照)メスを一 斉に、 麻酔をかけた蚊を5匹のWTまたはトランスジェニックオスと1匹のWTメスの蚊のカートンに追加し、それぞれに~150匹の蚊が含まれています。ケージには必ずオスのタイプごとにラベルを付けてください。
注:この交配スキームは、GD1またはGD29 ヘミジゴテス(すなわち、導入遺伝子の1つのコピーを保有する蚊)の適応性を決定するためのものです。ホモ接合性トランスジェニック系統の適応性を決定するために、トランスジェニック雄および雌がWT雄および雌の交配と比較して交配を許されるように、交配スキームを適合させることができる。 - 2〜3日後、ケージの上部に血液源を提供することにより、標準的な飼育方法25 に従って雌に血液を供給します。給餌効率を高めるために、給餌の24時間前に給餌する砂糖源と血液給餌前の~2〜3時間の水源を取り除きます。
- 血液供給後、ステップ1.5のように蚊を4°Cに置いて麻酔をかけます。
- 血液を与えられた(完全に充血した)女性と栄養を与えていない女性を選別します 腹部の充血を視覚的にスクリーニングします。給餌されていない、部分的に給餌されている、および男性を捨てます。
- 充血したメスをそれぞれのケージに戻し、ケージの上に砂糖と水源を提供します。
- 2〜3日後、鉛筆で事前にラベル付けされた濾紙で裏打ちされた50mLの円錐形チューブに個々の女性を入れます(図3)。円錐形のチューブをメッシュで覆い、2本の輪ゴムでシールします。
- メスが目を覚ましたら、すべてのチューブに~5mLの水道水を入れます。レーズンまたは砂糖を染み込ませたコットンボールの小片を各円錐形のチューブの上に置きます。女性を昆虫の中に1〜2日間放置し、産卵させます。
- 1〜2日後、各円錐形のチューブを排水し、蚊を4°Cに置いて麻酔をかけます。 迅速な処理を行うには、3 mLのプラスチック製ピペッターの先端をメッシュに押し付けて、各円錐形のチューブから水を排出します。チューブを逆さまに回転させ、ペーパータオルの上に置いて水気を切ります。50 mLのコニカルチューブをチューブホルダーに入れ、ラックを4°Cに置きます。
- 卵紙を集めて、各紙の卵の数を数えます。産卵しない雌を0として数え、分析に含めます。平均繁殖力は、各紙にカウントされた卵の総数をスクリーニングされた女性の総数で割ったものとして計算します。
注:個々の卵紙のデジタル写真は、カウント確認の視覚的な記録として役立つ場合があります(図4)。 - 卵紙を乾かし、昆虫に戻します。最適な孵化のために、卵紙を少なくとも3〜5日間乾燥させることをお勧めします25。
2. 翼の長さ、面積、重心サイズの測定
- 蚊のケージを-20°Cに約15分間置いて、完了した繁殖力研究から少なくとも25 WTまたはトランスジェニック年齢を一致させた血液供給雌を凍結します。
注意: 長期間凍結したり、容器を振ったり落としたりしないでください。蚊の羽が落ちる可能性があるためです。 - 各蚊の左翼を解剖し、翼と胸部の接合部を切除し、以下の手順に従って翼全体を取り除きます。
- 片手で蚊を鉗子で持ち、翼の下の胸部をつかみます。
- もう一方の手で別の鉗子を使用して、各蚊の左翼を解剖し、穏やかな圧力で翼と胸部の関節を切除して翼を引き抜き、翼の静脈を引き裂くことなく翼全体を取り除きます。
- 鉗子を使用して、翼をスライドガラスの上に置き、平らに置きます。トランスファーピペットを使用して、70%エタノールからなる15mLのストック溶液から1滴と食器用洗剤1滴をスライド上の翼に加えます。
- カバーガラスに80%グリセロールを1滴加え、翼の上部にエタノール石鹸溶液に入れます。
- スライドに取り付けられた翼を65mmレンズ(7D-65mm-1x、ズーム=1、200、6.3、ISO=100)のカメラで撮影します。ピクセル/mm スケールに注意し、これがすべての画像で同じままであることを確認してください。複数の翼をまとめて画像化する場合は、写真を個々の翼に切り抜き、各写真にスケールバーを追加します。画像をLZW圧縮のTIFF形式で保存し、各画像には個々の翼のすべての情報が明確にラベル付けされます。
注:翼は、異なるカメラと倍率を使用して撮影するか、他の研究のために顕微鏡に取り付けられたカメラを使用して撮影することができますが、設定が同じままで、研究で撮影された各翼のピクセル/ mmスケールが同じままである場合。ピクセル/mm 比は、測定値を決定する際に考慮されます。 - tpsUtil と tpsDig は、無料のモルフォメトリック画像処理ソフトウェアです。ソフトウェアの詳細については、Rohlf26,27 を参照してください。
- tpsUtilを使用して翼をデジタル化し、デジタル化の次のステップのために翼の写真のTPSファイルを作成します。
- これを行うには、tpsUtil を開き、 操作で [ イメージから tps ファイルをビルド] を選択します。 入力をクリックし、個々の翼の画像を含むファイルを選択し、任意の画像を選択してこのフォルダーを選択します。 [出力 ] をクリックし、.tps 形式で作成されるファイルに名前を付けます。 「保存」をクリックします。
- 次に、[ アクション] で [設定] をクリックします。 [すべて含める] を選択し、[ 作成 ] をクリックしてポップアップ ボックスを閉じます。 操作中に、標本を ランダムに順序付けするを選択します。 [入力 ] をクリックし、作成したばかりの *.tps ファイルを選択します。 [出力] をクリックし、サンプルがランダム化されたファイル バージョンであることを示すように .tps ファイルの名前を変更して、[ 保存] をクリックします。次に、「 作成」をクリックします。tpsUtil プログラムを閉じます。
注:測定誤差を減らすために、翼の写真を複製し、技術的な複製に2回利用することができます。
- tpsDig ソフトウェアを使用して、ランドマークの 2 次元デカルト座標を特定します。 [入力] で、手順 2.7 で作成した .tps ファイルを選択します。スケールをステップ2.5で決定したスケールに設定します。 [オプション] で [イメージ ツール] を選択し、[ 測定] をクリックします。
- デジタイズランドマークを表す青い十字線アイコンをクリックして、画像にランドマークを追加し、 次に図5に示されている翼のジョイントをランドマーク1からランドマーク14の順にクリックします。
注:これらのランドマークは、以前に翼のランドマークのデジタル化と分析19で使用されており、多くのサンプルにわたる翼脈の接合部で簡単に見つけることができ、翼のサイズと形状を捉えるのに十分な翼のランドマークを提供するため、選択されました。 - ランドマークをマークするときは、 M アイコンをクリックして tpsDig で欠落または不明瞭なランドマークを欠落としてマークし、それらを分析から除外し、ランドマークの正しい順序を保持します。赤い右向きの矢印をクリックして、ファイル内のすべての画像が完了するまで、次の画像のランドマーク デジタイズを繰り返します。ファイルを保存して閉じます。
注:翼の長さ、面積、およびサイズの計算を正しく行うには、各画像の正しい順序でランドマークを翼の画像に追加する必要があります。 - Supplementary File 1 で提供されている R スクリプトを使用して翼の長さと面積を計算し、実験に従って .tps ファイルの場所と画像スケールを変更します。
- 翼の重心サイズ (形状から統計的に独立したサイズの尺度) を計算し、翼の中心点 28,29 から各ランドマークの二乗距離の合計の平方根として定義されます。
- 一般化された procrustes アライメントを使用して、非形状の変動を削除し、すべてのランドマークがそのままの翼を使用して平均ランドマーク座標をプロットします。翼の重心サイズと平均ランドマークの決定の両方について、 補足ファイル2で提供されているRスクリプトを使用し、実験に従って.tpsファイルの場所と画像スケールを変更します。
3.卵子の受精能の評価
- 単身の雌から採取した紙(ステップ1で採取)から個々のF1 卵を孵化させ、~100mLの新たに滅菌した脱イオン水が入ったポリプロピレン製の透明デリ容器に入れます。 アドリタム フィードのために、挽いた魚のフードスラリーを2〜3滴加えます。容器の上部をメッシュまたはオーガンジーで裏打ちし、輪ゴムで固定します。
- 孵化後2〜3日で、卵紙を水から取り出し、蓋またはネットで覆われた新しい容器に入れて昆虫に入れたままにして、一晩乾かします。
- 卵紙を最初に孵化したのと同じ容器に卵紙を戻し、水容器に戻して再孵化させます。
注:卵紙を乾燥させて再孵化させると、孵化効率が大幅に向上します。これは、他の蚊の種には必要ないかもしれません。 - 最初の孵化後3〜5日で、幼虫(2番目 から4番目の 幼虫)を目視検査して、トランスジェニックマーカー(該当する場合; 図6)。ペーパータオルで裏打ちされたオーガンジーまたはメッシュの上に置かれた濾紙にそれらを置くことにより、蛍光顕微鏡で複数の幼虫を同時に検査します。ペーパータオルは余分な水分を吸収するため、濾紙を使用して固定化された幼虫をスクリーニングおよび操作できます。
- 陽性または陰性のトランスジェニック幼虫の数を記録します。陰性の幼虫を捨てます。
- 最適な発育時間を確保するために、幼虫の水をきれいにします。これを行うには、幼虫を小さなカップにピペットで入れ、汚れた水を捨てて、新鮮な水道水と交換します 陽性の幼虫を追加し、十分な魚のすりつろの餌スラリーが利用可能であることを確認します。
- トランスジェニック幼虫または対照幼虫の数を卵の総数で割ったものとして受精能を計算します。
4.蛹の性比の決定
- 孵化後14日まで、雄と雌の蛹の数の収集と記録を続けます(ステップ1.2.3で説明)。女性または男性は、性別ごとに、1.9Lの容器に収納された小さなカップにプールできます。
- 性比を決定するには、個々の成虫の雌の蚊ごとに研究タイムライン全体で収集されたF1 の女性の数またはF1 の男性の数を追加します。この数を、1人の女性から生成された同じ蚊の系統で収集された蛹の総数で割ります。
5. 幼虫の生存率の判定
- 幼虫の生存率を判断するには、個々の成虫の雌の蚊ごとに研究タイムライン全体で収集された蛹の総数を追加します。
- この数を、ステップ3でカウントしたのと同じラインの個々の成虫のメスの蚊ごとにカウントされた幼虫の総数で割ります。
6. 幼虫から蛹までの発育時間の決定
- 幼虫から蛹への発育を判断するには、幼虫の数とラインあたりの蛹の数を毎日追跡します。
- 孵化後、蛹が発育するまでの平均時間として、幼虫から蛹への発育を計算します。
7. 男性の貢献度の決定
- 年齢が一致した男性を使用して、氷の上で成虫の処女トランスジェニック雄蚊を麻酔し、成虫の処女男性と雌の防除蚊を麻酔します。
- トランスジェニックまたは対照雄の成体と対照の雄の成体を対照の女性の成虫と交配するには、トランスジェニックまたは対照の雄の成体と対照の成虫を50匹加え、対照の雌と100人の雌の合計が50匹の雄になります(対照の雌2匹:対照またはトランスジェニックの雄1匹)。トランスジェニックオスが入っているカートンと、コントロールオスが入っているカートンを必ずラベル付けしてください。
- 交配が2〜3日間行われるのを待ちます。この時間の後、標準的な飼育方法に従って蚊に血の食事を提供します。
- 血液供給の3日後、ステップ1(繁殖力アッセイ)で説明されているように、完全に充血した個々の女性を、事前にラベル付けされた白い濾紙で裏打ちされた50mLの円錐形チューブに分けます。餌を与えられていない女性を捨てるか、翌日に別の血の食事を提供します。すべてのチューブに~5mLの水道水を入れます。各円錐形のチューブの上に置かれたメッシュにレーズンの小片を置きます。
- 女性を昆虫に1〜2日間放置し、産卵させます。採血後4〜5日間、卵の紙を目視検査します。産卵率を上げるために、女性に産卵するための追加の日を許可します。
- 卵のペーパーを収集するには、水を切り、前述のように円錐形のチューブを4°Cに配置して女性に麻酔をかけます。70%エタノールに入れて雌の蚊を捨てます。
- 紙を昆虫のチューブに少なくとも5日間置いて乾かします。鉗子を使用して紙を取り出し、孵化のために~100mLの新たに滅菌した脱イオン水が入ったポリプロピレン製の透明なデリ容器に入れます。 アドリビタム 給餌のために2〜3滴の挽いた魚のフードスラリーを追加します。コンテナの上部をメッシュまたはオーガンジーで裏打ちし、輪ゴムで固定します。
- 孵化後2〜3日で、卵紙を水から取り出し、蓋またはネットで覆われた新しい容器に入れて昆虫に戻すことにより、卵紙を一晩乾燥させます。
- 卵紙を水容器に戻して、同じ容器に卵紙を入れ直します。
- 最初の孵化後3〜5日で、幼虫(2番目 から4番目の 幼虫)を目視検査して、トランスジェニックマーカー(該当する場合)を確認します。オスの寄与を、F2 トランスジェニック幼虫の数を蚊の系統あたりの総幼虫の数で割った値として計算します。
8. 蚊の寿命の決定
- 50匹のオスと50匹のメスのWTまたはトランスジェニックの年齢が一致した非血液供給蚊を適切な囲いに移します。実験が進むにつれて蚊に簡単にアクセスして操作できるように、上部の開口部にパンティホースが敷かれ、ねじれて結び目が閉じられた64オンスのカートンを使用します(図7)。
注: 統計上の目的で、これを 3 回で行うことをお勧めします。 - 砂糖と水源を提供します。ここでは、レーズンとガーゼで裏打ちされた水入りカップを2本の輪ゴムで固定しました。
- 毎日死んだオスとメスの蚊の数を追跡します。蚊がケージ全体で死ぬまでの平均経過日数として寿命を計算し、情報に基づかない原因(押しつぶされたり砂糖に溺れたりするなど、蚊の寿命に起因しない原因)で死亡した蚊を除外し、研究の終了時にまだ生きている蚊を除外します。
注:生存は、時間tまで生存している確率、または関数S(t)= Pr(T>t)として定義されます。生存期間の中央値は、生存確率が0.5、つまりT_0.5 = S-1 x 0.5である時間です。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
上記のプロトコルに従って、2つの蚊系統の適応度を評価しました:(1)Ae. aegypti D7L1 (AAEL006424)唾液タンパク質からのCRISPR/Cas9媒介ノックアウト、および(2)自律的なCRISPR/Cas9媒介遺伝子ドライブ9を発現するAe. aegypti系統。前者の場合、非相同末端結合経路(NHEJ)を利用して、D7L1遺伝子に特異的なsgRNAを胚にマイクロインジェクションした後に破壊を生成することにより、ホモ接合型のD7L1ノックアウトラインが確立されました。ヘテロ接合性のD7L1-KO蚊は、WTに4世代にわたって戻し交配した後、安定したホモ接合系統を生成して潜在的なオフターゲット効果を除去しました。後者の場合、ナノス(AAEL012107)またはインネキシン-4(AAEL006726)プロモーター(このプロトコルではそれぞれGD1およびGD2)のいずれかの下でCas9リボ核タンパク質を発現する遺伝子ドライブカセットを、前述のようにCRISPR/Cas9注入ミックスで胚を...
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
Ae. aegyptiの適応度研究は、この原稿で述べられているように、トランスジェニックカーゴ(遺伝子駆動要素など)または遺伝子ノックアウトに関連する適応度コストを評価するために、実験室でよく行われます。しかし、これらの研究は、ボルバキアに感染した30,31、殺虫剤耐性の32,33、アルボウイルスに感染した34など、Ae. aegyptiのグループの健康状態を評価することを目的としたさまざまな目的で実施される可能性があります。したがって、これらの実験は幅広い目的に使用できるため、プロトコルはシンプルで効率的、かつ再現性のあるものを目指していました。
研究者は、実験室で収集されたフィットネスデータを野外蚊に外挿する際には注意を払う必要...
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者は何も開示していません。
謝辞
著者らは、このプロトコルのサポートについて、ミズーリ大学のBill Reid博士とAlexander Franz博士に感謝します。また、著者らは、R解析を支援してくださったNIH/NIAIDのBenjamin Krajacich博士にも感謝します。この研究は、NIH、助成金番号R01 AI130085(KEO)、およびNIH / NIAIDの学内研究プログラムAI001246(EC)部門によって資金提供されました。
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1オンス 半透明のプラスチックスフレカップ | WebstaurantStore | 301100PC | |
| 2オンス 半透明のポリスチレンスフレカップ | WebstaurantStore | 760P200N | |
| 3 mL プラスチックピペット | コーニン | 357524 | |
| 50mLコニカルチューブ任意の | ブランド | ||
| 64オンスホワイトダブルポリコート紙フードカップ | WebstaurantStore | 999SOUP64WB | 蚊の囲い |
| 65mmレンズ用 | Canon | MP-E 65mm f/2.8 1-5x Macro Photo | Canon Macro Photo MP-E 65mm, 7D-65mm-1X; zoom=1, 200, 6.3, ISO=100; 翼や卵の紙の撮影には、他のカメラでも十分でしょう |
| Aedes aegypti 蚊BEI | として複数の株が利用できる | ||
| 人工膜フィーダー | https://lillieglassblowers.com/ | Meduim膜フィーダー、カスタムメイド、33ミリメートル | ケムグラスも提供していますが、サイズは私たちにとって間違っています。うちのものは約3cm? |
| ATP | MP バイオメディカル | ICN15026605 | 任意の良質の ATP、10mM フィルター滅菌アリコート -20 オート |
| クレーブ | を孵化するための滅菌水 | ||
| 用 | キヤノン | 3814B004 | 、ただし、他のカメラはおそらく十分な |
| 除細動羊の血液 | コロラド血清株式会社 | 60 ml、2週間ごとに | https://colorado-serum-com.3dcartstores.com/sheep-defibrinated |
| デュアルグースネック顕微鏡イルミネーター | ドラン・ジェンナー ファイバーライト 180 | 181-1 システム | |
| エタノール | |||
| 鉗子 | デュモン | 5SF | |
| ガーゼ | omnisorb ii | 4インチ 不織布スポンジ | |
| ガラス顕微鏡スライド | フィッシャーサイエンティフィック | 12-544-2 | |
| ガラスペトリ皿、100 × 15 mm | VWR | 75845-546 | 氷の上の蚊を麻酔/操作するための |
| の腸 | デリ | 、我々は大量に購入し、分割し、洗浄し、50ミリリットルの円錐 | |
| の氷のバケツ | |||
| Kimwipeで-20で~4X12 "の小さなアリコートで保存します | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Leica GZ4 StereoZoom microscope | for screening transgenic mosquitos (if applicable) | ||
| Paintbrush | AIT 合成ブラシ | サイズ10-0 | 幼虫/蛹を操作するための(アマゾン) |
| パンティストッキング | ウォルマート | L'eggs Everyday | 女性用 ナイロン <ストロング>プラス ニーハイ シアートゥ、16ペア(プラスカートンに適合) |
| 鉛筆 | ブランド | ||
| 2° カートンの保管 | ウォルマート | Sterilite 58 Qt 収納ボックス クリアベース 白い蓋 8 個セット | |
| 幼虫を育てるためのプラスチック容器 | ウォルマート | Sterilite 28 Qt. 収納ボックス プラスチック、 ホワイト、 | |
| 孵化幼虫用プラスチック容器 | ウォルマート | ステリライト 6 Qt. 収納ボックス プラスチック、ホワイト | |
| ポリプロピレンクリアデリコンテナ | ウェブスタウラントストア | 127DM12BULK | 12オンス、または必要に応じて16オンス より大きな(127RD16BULK) |
| 輪ゴム | オフィスマックス | #100736/#909606 /#3777415 | 12"、#64および#10 |
| ゴムスト | ッパーVWR | 217-0515 | 蚊の囲い込み用 |
| 角砂糖やレーズン | |||
| テトラミンフレーク食品 | テトラミン | 16106 | |
| tpsDig | Stony Brook Morphometrics | でオンライン配布される無料の形態測定画像処理ソフトウェア | |
| Stony Brook Morphometrics | 配布される無料の形態測定画像処理ソフトウェア | ||
| https://www.sbmorphometrics.org/ White organza fabric 8" × 8" | FabricWholesale.com | 4491676 | Joann Casa Collection Organza ファブリック by Casa Collection |
| ホイットマングレード1定性的濾紙 | ホイットマン | 1001-824 | 卵紙用。白い色は黒い卵を見やすくします。 |
参考文献
- Dawkins, R. The Selfish Gene. New edition. , University Press. Oxford, New York. Oxford. (1989).
- Crow, J. F. Unmasking a Cheating Gene. Science. 283 (5408), 1651-1652 (1999).
- Gould, F. Broadening the application of evolutionarily based genetic pest management. Evolution. 62 (2), 500-510 (2008).
- Williams, A. E., Franz, A. W. E., Reid, W. R., Olson, K. E. Antiviral effectors and gene drive strategies for mosquito population suppression or replacement to mitigate arbovirus transmission by Aedes aegypti. Insects. 11 (1), (2020).
- Irvin, N., Hoddle, M. S., O'Brochta, D. A., Carey, B., Atkinson, P. W. Assessing fitness costs for transgenic Aedes aegypti expressing the GFP marker and transposase genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (3), 891-896 (2004).
- Moreira, L. A., Wang, J., Collins, F. H., Jacobs-Lorena, M. Fitness of anopheline mosquitoes expressing transgenes that inhibit Plasmodium development. Genetics. 166 (3), 1337-1341 (2004).
- Dilani, P. V. D., Dassanayake, R. S., Tyagi, B. K., Silva Gunawardene,, N, Y. I. The impact of transgenesis on mosquito fitness: A review. Frontiers in Insect Science. 38, (2022).
- Hammond, A. M., et al. The creation and selection of mutations resistant to a gene drive over multiple generations in the malaria mosquito. PLOS Genetics. 13 (10), (2017).
- Reid, W., et al. Assessing single-locus CRISPR/Cas9-based gene drive variants in the mosquito Aedes aegypti via single-generation crosses and modeling. 3 (12), (2022).
- Wu, S. L., et al. MGDrivE 2: A simulation framework for gene drive systems incorporating seasonality and epidemiological dynamics. PLOS Computational Biology. 17 (5), (2021).
- Oberhofer, G., Ivy, T., Hay, B. A. Gene drive and resilience through renewal with next generation Cleave and Rescue selfish genetic elements. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (16), 9013-9021 (2020).
- Adolfi, A., et al. Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature Communications. 11 (1), 5553(2020).
- Carballar-Lejarazu, R., et al. Next-generation gene drive for population modification of the malaria vector mosquito, Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (37), 22805-22814 (2020).
- Champer, J., et al. A CRISPR homing gene drive targeting a haplolethal gene removes resistance alleles and successfully spreads through a cage population. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (39), 24377-24383 (2020).
- Champer, S. E. 15, et al. Computational and experimental performance of CRISPR homing gene drive strategies with multiplexed gRNAs. Science Advances. 6 (10), (2020).
- Li, M., et al. Development of a confinable gene drive system in the human disease vector Aedes aegypti. eLife. 9. 51701, (2020).
- Champer, S. E., Kim, I. K., Clark, A. G., Messer, P. W., Champer, J. Anopheles homing suppression drive candidates exhibit unexpected performance differences in simulations with spatial structure. eLife. 11, 79121(2022).
- Petersen, V., et al. Assessment of the correlation between wing size and body weight in captive Culex quinquefasciatus. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical. 49 (4), 508-511 (2016).
- Yeap, H. L., Hoffmann, A. A., Endersby, N. M., Ritchie, S. A., Johnson, P. H. Body size and wing shape measurements as quality indicators of Aedes aegypti mosquitoes destined for field release. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 89 (1), 78-92 (2013).
- Fecundity Briegel, H. metabolism, and body size in Anopheles (Diptera: Culicidae), vectors of malaria. Journal of Medical Entomology. 27 (5), 839-850 (1990).
- Hurd, H., Hogg, J. C., Renshaw, M. Interactions between bloodfeeding, fecundity and infection in mosquitoes. Parasitology Today. 11 (11), 411-416 (1995).
- Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Reports. 11 (1), 51-60 (2015).
- Coates, C. J., Jasinskiene, N., Miyashiro, L., James, A. A. Mariner transposition and transformation of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (7), 3748-3751 (1998).
- Carvalho, D. O., et al. Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil. Journal of Visualized Experiments. 83 (83), (2014).
- Clemons, A., Mori, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. Culturing and egg collection of Aedes aegypti. Cold Spring Harbor Protocols. (10), (2010).
- Rohlf, F. J. TpsDig (2.32) [Computer software. , (2018).
- Rohlf, F. J. TpsUtil (1.79) [Computer software. , (2018).
- Zelditch, M. L., Swiderski, D. L., Sheets, H. D., Fink, W. L. Geometric Morphometrics for Biologists. , Elsevier Academic Press. New York, NY. (2017).
- Size Klingenberg, C. P., shape, and form: concepts of allometry in geometric morphometrics. Development Genes and Evolution. 226 (3), 113-137 (2016).
- Axford, J. K., Ross, P. A., Yeap, H. L., Callahan, A. G., Hoffmann, A. A. Fitness of wAlbB Wolbachia infection in Aedes aegypti: Parameter estimates in an outcrossed background and potential for population invasion. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 94 (3), 507-516 (2016).
- Ross, P. A., Hoffmann, A. A. Fitness costs of Wolbachia shift in locally-adapted Aedes aegypti mosquitoes. Environmental Microbiology. 24 (12), 5749-5759 (2022).
- Rigby, L. M., Johnson, B. J., Peatey, C. L., Beebe, N. W., Devine, G. J. The impact of sublethal permethrin exposure on susceptible and resistant genotypes of the urban disease vector Aedes aegypti. Pest Management Science. 77 (7), 3450-3457 (2021).
- Smith, L. B., Silva, J. J., Chen, C., Harrington, L. C., Scott, J. G. Fitness costs of individual and combined pyrethroid resistance mechanisms, kdr and CYP-mediated detoxification, in Aedes aegypti. PLoS Neglected Tropical Diseases. 15 (3), 0009271(2021).
- Chaves, B. A., et al. Vertical transmission of Zika virus (Flaviviridae, Flavivirus) in Amazonian Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) delays egg hatching and larval development of progeny. Journal of Medical Entomology. 56 (6), 1739-1744 (2019).
- Kuno, G. Early history of laboratory breeding of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) focusing on the origins and use of selected strains. Journal of Medical Entomology. 47 (6), 957-971 (2010).
- David, M., Garcia, G., Valle, D., Maciel-de-Freitas, R. Insecticide resistance and fitness: the case of four Aedes aegypti populations from different Brazilian regions. BioMed Research International. , (2018).
- Wendell, M. D., Wilson, T. G., Higgs, S., Black, W. C. Chemical and gamma-ray mutagenesis of the white gene in Aedes aegypti. Insect Molecular Biology. 9 (2), 119-125 (2000).
- Koenraadt, C. J., Kormaksson, M., Harrington, L. C. Effects of inbreeding and genetic modification on Aedes aegypti larval competition and adult energy reserves. Parasites and Vectors. 3, (2010).
- Rezende, G. L., et al. Embryonic desiccation resistance in Aedes aegypti: presumptive role of the chitinized serosal cuticle. BMC Developmental Biology. 8, (2008).
- Farnesi, L. C., Vargas, H. C. M., Valle, D., Rezende, G. L. Darker eggs of mosquitoes resist more to dry conditions: Melanin enhances serosal cuticle contribution in egg resistance to desiccation in Aedes, Anopheles and Culex vectors. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (10), (2017).
- Carvalho, D. O., et al. Mosquito pornoscopy: Observation and interruption of Aedes aegypti copulation to determine female polyandric event and mixed progeny. PLoS ONE. 13 (3), (2018).
- Helinski, M. E., Harrington, L. C. Male mating history and body size influence female fecundity and longevity of the dengue vector Aedes aegypti. Journal of Medical Entomology. 48 (2), 202-211 (2011).
- Felipe Ramarez-Sanchez,, Camargo, L., Avila, C., W, F. Male sexual history influences female fertility and re-mating incidence in the mosquito vector Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of Insect Physiology. 121, 104019(2020).
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
