方法論記事

ヒトケロイド組織からの初代皮膚線維芽細胞の単離、培養、および特性評価

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DOI：

10.3791/65153

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2023年7月28日

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1Dermatology Hospital, Southern Medical University

この記事について

サマリー

この研究では、ケロイド組織から初代線維芽細胞を確立するための最適化されたプロトコルについて説明します 純粋で生存可能な線維芽細胞を効果的かつ着実に提供できます。

要約

ケロイド組織の主要な細胞型である線維芽細胞は、ケロイドの形成と発達に不可欠な役割を果たします。ケロイド組織に由来する初代線維芽細胞の単離と培養は、ケロイドの生物学的機能と分子メカニズム、およびそれらを治療するための新しい治療戦略のさらなる研究の基礎となります。初代線維芽細胞を得るための従来の方法には、細胞状態の悪さ、他の種類の細胞との混合、汚染に対する感受性などの制限があります。この論文では、線維芽細胞を取得する際に起こりうる問題の発生を減らすことができる、最適化され、簡単に再現できるプロトコルについて説明します。このプロトコルでは、線維芽細胞は単離後5日で観察され、10日間の培養後にほぼ80%のコンフルエントに達することができます。次に、線維芽細胞を継代し、免疫蛍光アッセイ用のPDGFRαおよびビメンチン抗体およびフローサイトメトリー用のCD90抗体を使用して検証します。結論として、ケロイド組織からの線維芽細胞は、このプロトコルを介して容易に取得することができ、ケロイド研究のための実験室で豊富で安定した細胞源を提供することができます。

概要

線維増殖性疾患であるケロイドは、プラークの継続的な成長として現れ、多くの場合、自己制限なしに周囲の正常な皮膚に侵入し、患者にさまざまな程度のかゆみ、痛み、美容的および心理的負担を引き起こします1。ケロイドに関与する初代細胞である線維芽細胞は、過剰な増殖、冗長な細胞外マトリックス産生、および無秩序なコラーゲンを通じて、この病気の形成と発症に不可欠な役割を果たします2,3。しかし、根底にある病因は不明であり、ケロイドの効果的な治療法はまだ不足しています。したがって、さらなる研究が急務です4,5。

in vivoでのケロイド研究に理想的な動物モデルがないため6,7,ケロイド組織から初代線維芽細胞を取得してin vitroモデルを構築することで、ケロイド研究の実現可能性と信頼性を提供できます2,6。初代細胞は生体組織から直接誘導される細胞であり、これらの細胞は細胞株と比較して複数の個体の生理学的状態および遺伝的背景により近いことが一般に認識されている8,9。初代細胞の培養は、細胞の成長と代謝、およびその他の細胞表現型を研究するための強力な手段を提供します。

現在、初代線維芽細胞を獲得するための2つの方法がある:酵素消化および外植片培養。しかし、初代線維芽細胞を得るには、さまざまな細菌や真菌による汚染のリスク、除去が容易ではない他の種類の細胞との混合、培養サイクルの長い期間、その後の元の細胞と比較した細胞特性の変化など、いくつかの障害が確認されています9.したがって、初代線維芽細胞を得るための実行可能で効果的なプロセスを開発することは、さらなる研究と応用の基礎となります。この研究では、ケロイド組織から初代線維芽細胞を抽出するための最適化されたプロトコルについて説明します 純粋で生存可能な線維芽細胞を効果的かつ着実に提供できます。

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プロトコル

この研究は、南部医科大学皮膚科病院の治験審査委員会によって承認されました(2020081)。個人から組織を採取する前に、インフォームド患者の同意を得た。

1. 事前準備

注意: 次の手順は、生物学的安全キャビネットの下の無菌環境で実行する必要があります。

  1. 高グルコースダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)に10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン-ストレプトマイシン-アムホテリシンB溶液(PSA)を加えて、完全な培地を調製します。
  2. 1%PSAを1x PBSに添加することにより、PSAを含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を調製します。1x PBSに1%FBSを加えて、FBSでPBSを調製します。
  3. オートクレーブ滅菌したハサミ、鉗子、メスをいくつか用意します。

2.除去した組織の入手

  1. 手術によってケロイド患者から組織を取得します。新鮮なケロイド組織を滅菌梱包袋または滅菌遠心チューブに収集し、できるだけ早く実験室の生物学的安全キャビネットに移します。
    注:このプロトコルでは、獲得されたケロイド組織のサイズは約~20 x 20 x 10 mm3であり、サイズは手術によって異なる場合があります。

3.分離

  1. 滅菌ピンセットを使用してケロイド組織を取り出し、1%PSAを含む10〜25 mLのPBSを含む50 mLの滅菌遠心チューブに10分間入れます。次に、6ウェルプレートを調製し、1%PSAを添加した4mLのPBSを各ウェルに添加する。滅菌したピンセットを使用してティッシュを取り出し、1%PSAを添加したPBSで2回洗浄します。滅菌鉗子を使用して、組織をあるウェルから次のウェルに順次移します。
  2. 外科用ハサミや手術用メスを使って脂肪層や表皮層を取り除き、真皮層はそのままにしておきます。真皮層をハサミで3〜5 mm2 個にトリミングして解剖し、滅菌鉗子を使用してこれらの断片を次のウェルに移し、1%PSA溶液を含むPBSで再度洗浄します。

4. 文化

  1. 滅菌鉗子を使用して真皮組織片をペトリ皿に入れます。ピースの数が10〜30で、各ピース間の距離が>5mmであることを確認します。ペトリ皿を逆さまにして、5°Cの37%CO2 インキュベーターに、組織片が少し乾いてペトリ皿にくっつくまで30〜60分間入れます。次に、10%FBSおよび1%PSAを添加したDMEMを添加し、ペトリ皿を37°Cの5%CO2 インキュベーターに注意深く入れます。
    注:線維芽細胞は、形態学的および機能的に不均一な細胞集団です。この複雑さを考慮すると、分離と培養のステップは注意して実行する必要があります。ケロイド真皮組織片を均等に選択し、これらの片をよく混ぜてからペトリ皿に入れます。
  2. 3日後、上清の半分を完全培養液と交換する。2〜3日ごとに培地を交換してください。毎日40倍の倍率で顕微鏡で線維芽細胞を観察します。
    注意: すべての手順は穏やかに実行する必要があります。組織片がペトリ皿に付着するのに時間がかかるため、分離後2日間ペトリ皿を動かさないでください。
  3. 組織片の周囲で増殖する線維芽細胞が約90%のコンフルエントに達したら、組織片と培地を取り除きます。線維芽細胞を滅菌1x PBSで洗浄し、滅菌1x トリプシン-EDTA溶液2 mLをプレートに加えます。加湿した5%CO2 インキュベーター内で37°Cで約3~5分間細胞をインキュベートします。培養皿を軽くたたき、顕微鏡で観察します。細胞の大部分がプレートから剥離したら、2 mLの完全培地を加えて消化プロセスを終了します。
  4. 細胞懸濁液を15 mL滅菌遠心チューブに移し、チューブを300 × g で室温で3分間遠心分離します。上清を注意深く廃棄し、細胞ペレットを完全培地に再懸濁する。線維芽細胞を9cmの細胞培養皿に播種し、加湿した5%CO2 インキュベーター内で37°Cでインキュベートする。

5. 維持・保全

  1. 約3〜4日後、線維芽細胞が80%コンフルエントに成長したら、ステップ4.2〜4.4を繰り返し、線維芽細胞を1:3の比率で継代します。継代した線維芽細胞をさらなる実験に使用します。
    注:線維芽細胞培養は、細胞が元の細胞と比較して変化した特性を示し始める可能性があるため、10回の継代後に停止する必要があります。
  2. P1-P3の継代細胞を液体窒素中で凍結保存し、さらに使用します。
    1. 手順4.2〜4.3を繰り返します。細胞懸濁液を15 mL滅菌遠心チューブに移し、チューブを300 × gで3分間遠心分離します。上清を注意深く廃棄し、90%FBSおよび10%DMSOを含む1 mLの細胞凍結培地に細胞ペレットを再懸濁し、懸濁液を細胞クライオチューブに移します。
    2. 細胞を冷凍ボックスに移し、凍結ボックスを-80°Cの冷凍庫に入れます。1日後、長期保存のために細胞を液体窒素に移します。

6. 免疫蛍光染色による線維芽細胞の同定

  1. 丸いカバーガラスを24ウェルプレートに入れ、継代した線維芽細胞を1 ×10 4 細胞/ウェルの濃度で培養します。線維芽細胞が60%コンフルエントに達したら、培養液を除去します。1 mLの4%パラホルムアルデヒドを加えて線維芽細胞を室温で20分間固定し、毎回PBSで3回1分間洗浄します。
    注:顕微鏡下で血球計算盤のスライドまたは自動セルカウンターを使用して細胞数を数えます。
  2. PBSを除去し、細胞膜の透過処理のために0.5%Triton X-100で20分間インキュベートした後、毎回1分間PBSで3回洗浄します。0.5%ウシ血清アルブミンを含むPBSを加え、30分間浸します。その後、それを取り出し、抗体希釈液で1:1,000に希釈したPDGFR-α/ビメンチン抗体を添加します。4°Cで一晩インキュベートします。
  3. 翌日、一次抗体を除去し、細胞をPBSで3倍3分間洗浄し、抗体希釈液で希釈した二次抗体Alexa Fluor-555ヤギ抗ウサギIgGを1:200で添加して1時間浸漬した。
  4. 二次抗体を除去し、細胞をPBSで3倍洗浄した。鉗子を使用して丸いカバーガラスを取り出し、スライドガラスに置き、50 μLの5 μg/mL 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)溶液を加えて細胞核を染色します。サンプルを湿った暗い箱に入れ、レーザー共焦点蛍光顕微鏡で観察します。
    注:非特異的染色を除外するために、一次抗体がなく二次抗体を含む陰性対照群を追加します。

7. フローサイトメトリーによる線維芽細胞の同定

  1. 細胞ペレットを1.5 mL滅菌遠心チューブに回収し、1%FBSを含む50 μLのPBSで再懸濁します。暗所で抗CD90と30分間インキュベートし、抗IgGアイソタイプコントロールを対照群に追加します。次に、1%FBSを含むPBSを200 μL加え、チューブを300 × g 、4°Cで10分間遠心分離します。
  2. 上清を除去し、1%FBSを含むPBSを200μL加えます。懸濁液を再懸濁し、セルストレーナー(70メッシュ)でろ過します。DAPIの5 μg/mLストック溶液を1:100でろ液に加え、フローサイトメトリーで結果を取得します。前方散乱(FSC)を横軸、側方散乱(SSC)を縦軸として設定し、主細胞集団を円で囲みます。細胞集団を選択し、フィコエリスリンを横軸として設定し、カウントを分析の縦軸として設定します。

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結果

プロトコルのタイムラインを 図1Aにまとめます。分離プロセスの代表的な画像を 図2に示します。表皮層および脂肪層を注意深く除去し、真皮層を3〜4mm2の小さな断片に分離し、それらをペトリ皿に接種した。

図3Aに示すように、組織片のいくつかの線維芽細胞伸長物は、処理後5日目に顕微鏡下で観察された。図3Bに示すように、線維芽細胞は高い増殖率を示し、10日後に高レベルのコンフルエントに達した。これらの線維芽細胞は細長い紡錘状の細胞体を有し、高レベルのコンフルエントに達すると束状に整列した。このプロトコルに従うことにより、線維芽細胞を継代し、2〜3週間以内に所望の量に拡大した。

線維芽細胞の同一性および純度を検証するために、線維芽細胞特異的マーカーPDGFRα10および...

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ディスカッション

ケロイド組織から初代線維芽細胞を得ることは、さらなる研究のための重要な基盤です。これまで、初代線維芽細胞を獲得するには、酵素消化と外植片培養の2つの方法がありました11、12、13、14。ただし、どちらの従来の方法にも、汚染に対する感受性、他の種類の細胞との混合、長い培養期間、成功率の低さなどの制限があります15,16。この研究では、最適化された方法を説明し、これらの既存の課題を解決し、ケロイド線維芽細胞の分離と培養の成功の可能性を高めるための明確な指示を提供しました。

微生物汚染の可能性は、一次線維芽細胞を得る際の主要な問題の1つです。すべての機器と溶液を滅菌し、プロトコルのすべてのステップで標準的な無菌技術を...

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開示事項

宣言する利益相反はありません。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学財団(助成金番号81903189および82073418)および広州科学技術財団(助成金番号202102020025)からの助成金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.5 mL 滅菌遠心分離チューブJETBIOFILCFT002015
15 mL 滅菌遠心分離チューブJETBIOFIL8076
4% ポリホルムアルデヒドBeyotime BiotechnologyP0099細胞固定
50 mL 滅菌遠心分離チューブJETBIOFIL8081ケロイド組織を入れ
Alexa Fluor-555 ヤギ抗ウサギ IgG アブカム・アレクサ フルーラ 555 免疫蛍光染色アッセイ用の2番目の抗体
抗ヒトCD90BioLegendB301002線維芽細胞の純度を特定する
希釈剤Beyotime BiotechnologyP0262
生物学的安全キャビネット Thermo Scientific1300 シリーズ A2単離および培養細胞
ウシ血清アルブミンアラジンB265993免疫蛍光染色アッセイのためのブロッキング
二酸化炭素インキュベーターESCOCCL-170B-8細胞培養に使用
細胞クライオチューブCorning43513で細胞を保管
サーモフィッシャーST16R上澄みを捨てる 
DAPIBeyotime BiotechnologyC1006細胞核の染色
DMSOMP Biomedicals196055細胞の保存に使用
ダルベッコの改変ワシ培地GibcoC11995500BT培養培地溶液
シ胎児血清BI04-001-1A
フローサイトメーターBDBD FACSセレスタ観察細胞
の同定 凍結ボックスThermo Scientific 5100-0050
倒立顕微鏡NikonECLIPSE Ts2
レーザー共焦点顕微鏡NikonAIR-HD25免疫蛍光染色法の観察
PDGFR-α 抗体CST3174T免疫蛍光染色法の最初の抗体
ペニシリン-ストレプトマイシン-Am溶液SolarbioP1410コンタミネーションを避けるために培地溶液を添加
ペトリ皿JETBIOFIL7556培養線維芽細胞
リン酸緩衝生理食塩水GibcoC10010500BT培地溶液
ウサギ (DAIE) mAB IgG XR (R) アイソチュージコントロール (PE)細胞シグナル伝達技術5742Sフローサイトメトリーのコントロールとして
ラウンドカバースリップバイオシャープ801007細胞培養
Triton X 100SolarbioT8200細胞膜のパンチホール
トリプシン-EDTAGibco25200072細胞の継代に使用
ビメンチン抗体アブカムab8978免疫蛍光染色アッセイ用の最初の抗体
ます 抗体 低温遠心分離機 ウ

参考文献

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