方法論記事

スプレイグドーリーラットの脂肪組織由来間葉系幹細胞の単離と同定

DOI：

10.3791/65172

⸱

2023年4月7日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Doctorado en Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, 2Medical Research Unit in Biochemistry, Specialties Hospital, National Medical Center SXXI, Instituto Mexicano de Seguro Social, 3Department of Agricultural and Animal Production, Division of Biological and Health Science, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco, 4Molecular Biology Research Laboratory, Center for Congenital Malformations, Children Hospital of Mexico Federico Gomez (HIMFG)

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、Sprague Dawleyラットから脂肪組織由来間葉系幹細胞(MSC)を単離および同定するための方法論について説明しています。

要約

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成体間葉系細胞は、ここ数十年で分子生物学と細胞生物学に革命をもたらしました。それらは、自己複製、遊走、および増殖のための優れた能力に加えて、異なる特殊な細胞型に分化することができます。脂肪組織は、間葉系細胞の最も侵襲性が低く、最もアクセスしやすい供給源の1つです。また、他の供給源と比較して高い収率、および優れた免疫調節特性を有することが報告されている。最近、異なる組織源および動物種から成体間葉系細胞を得るための異なる手順が公開されている。一部の著者の基準を評価した後、さまざまな目的に適用でき、簡単に再現できる方法論を標準化しました。腎周囲脂肪組織および精巣上体脂肪組織からの間質血管画分(SVF)のプールにより、最適な形態と機能を備えた初代培養を開発することができました。細胞は24時間プラスチック表面に接着して観察され、線維芽細胞様の形態を示し、延長およびコロニーを形成する傾向を示した。フローサイトメトリー(FC)および免疫蛍光(IF)技術を用いて、膜マーカーCD105、CD9、CD63、CD31、およびCD34の発現を評価しました。脂肪由来幹細胞(ASC)が脂肪生成系統に分化する能力も、因子(4 μMインスリン、0.5 mM 3-メチル-イソ-ブチル-キサンチン、および1 μMデキサメタゾン)のカクテルを使用して評価されました。48時間後、線維芽細胞様形態の漸進的な消失が観察され、12日目にオイルレッド染色陽性の脂肪滴の存在が確認された。要約すると、再生医療への応用に最適で機能的なASC培養物を得るための手順が提案されています。

概要

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間葉系幹細胞(MSC)は、自己複製、増殖、遊走、および異なる細胞系譜への分化能力が高いため、再生医療に大きな影響を与えています1,2。現在、さまざまな病気の治療と診断の可能性に焦点を当てた多くの研究が行われています。

間葉系細胞には、骨髄、骨格筋、羊水、毛包、胎盤、脂肪組織など、さまざまな供給源があります。それらは、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ウマなどのさまざまな種から得られます3。骨髄由来MSC(BMSC)は、再生医療における幹細胞の主要な供給源として、また胚性幹細胞の使用に代わるものとして長年使用されてきました4。しかしながら、脂肪由来MSC、または脂肪由来幹細胞(ASC)は、それらの収集および単離の容易さ、ならびに脂肪組織のグラム当たりに得られる細胞の収量のために大きな利点を有する重要な代替物である5,6。ASCの収穫率は一般的にBMSCよりも高いことが報告されています7。当初、ASCの修復/再生能力は、他の細胞系譜に分化する能力によるものであると提案されました8。しかし、近年の研究により、ASCによって放出されるパラクリン因子の修復可能性における主要な役割が強化されています9,10。

脂肪組織(AT)は、エネルギー貯蔵量であることに加えて、内分泌系、神経系、および心血管系と相互作用します。また、出生後の成長と発達、組織の恒常性の維持、組織の修復、および再生にも関与しています。ATは、脂肪細胞、血管平滑筋細胞、内皮細胞、線維芽細胞、単球、マクロファージ、リンパ球、前駆脂肪細胞、およびASCで構成されています。後者は免疫原性が低いため、再生医療において重要な役割を果たしています11,12。ASCは、酵素消化および機械的処理によって、または脂肪組織外植片によって得ることができる。ASCの初代培養は、維持、成長、および拡張が容易です。ASCの表現型の特徴付けは、免疫蛍光法やフローサイトメトリーなどの方法を用いて特異的膜マーカーの発現を評価することにより、細胞の同一性を検証するために不可欠です13。国際脂肪治療科学連盟(IFATS)と国際細胞治療学会(ISCT)は、ASCがCD73、CD90、およびCD105を発現する一方で、CD11b、CD14、CD19、CD45、およびHLA-DR14の発現を欠くと定義しています。したがって、これらのマーカーは、ポジティブとネガティブの両方で、ASCの特性評価に信頼できると見なされます。

このプロジェクトは、ラットのATから抽出された成体間葉系細胞の単離と同定の手順を説明することに焦点を当てていましたが、この細胞源は胚性幹細胞とは異なり、倫理的な課題を提示しません。これは、骨髄由来幹細胞と比較してアクセスが容易で低侵襲な方法であるため、実行可能な選択肢として手順を固めます。

この組織源から得られる間葉系細胞は、その免疫調節能力と低い免疫拒絶反応のために、再生医療において重要な役割を果たしています。したがって、本研究は、それらのセクレトームと、糖尿病などの代謝性疾患を含むさまざまな疾患における再生医療としての応用に関する将来の研究の基本的な部分です。

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プロトコル

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すべての実験手順は、実験動物ケア国際評価認定協会(Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999、メキシコ)の勧告に基づいて、動物ケアに関するメキシコのガイドラインに従って実施されました。プロトコルは、メキシカーノデルセグロ社会研究所の健康研究のための倫理委員会によってレビュー、承認、および登録されました(R-2021-785-092)。

1. 外科的切除によるラットからの脂肪組織の除去

  1. 20 mLの滅菌1xリン酸緩衝生理食塩水-抗生物質抗真菌薬(PBS-AA)溶液(1x PBS、ゲンタマイシン[20 μg/mL]、およびアムホテリシン[0.5 μg/mL])を含む2本のコニカルチューブを準備し、氷上で維持します。
  2. 健康状態の良い2匹の成体のオスのスプレイグドーリーラット (R. ラットが生後3〜4か月で、体重が350〜450gであることを確認してください。
  3. 20 mg / kgの塩酸キシラジンで鎮静し、5分後、120 mg / kgの塩酸ケタミンの麻酔薬を腹腔内に投与します。.乾燥を防ぐために眼科用軟膏で両目を滑らかにします。次に、ペダル反射の欠如による麻酔の深さを確認します。
  4. 腹部と鼠径部をヨウ素溶液で剃って消毒します。無菌性を維持するために外科用ドレープを適用します。次に、胸骨から精巣領域まで正中縦切開を行います。
  5. 滅菌鉗子で精巣上体と腎臓の両方を囲む脂肪組織を取り除き、1x PBS-AA溶液に入れます。サンプルを氷の上に保管してください。
  6. 施設のガイドラインに従って必要に応じて切開部を縫合し、40 mg / kgのペントバルビタールナトリウムの心臓内用量で動物を安楽死させます。.死亡が確認されたら、施設の手順に従って死体を処分します。
    注:死は、間葉系細胞の免疫表現型、分化能力、およびパラクリン効果に影響を与えるシグナル伝達メカニズムを誘発します。したがって、組織採取は安楽死の前に行われます。

2.脂肪組織からの間葉系細胞の単離

  1. バイオセーフティキャビネット内の滅菌鉗子で脂肪組織を取り除き、直径100mmのペトリ皿の滅菌ろ紙に置いて余分なPBSを吸収します。
  2. 脂肪組織を別のシャーレに移し、10 mLピペットを使用して10 mLの1x PBS-AA溶液でそれぞれ5分間3回洗浄します。
  3. ハサミとメスを使用して組織を約1 cm2 の断片に機械的に分解します。
  4. コラゲナーゼIV型(0.075%)を、20 mLの非添加ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)で調製します。0.22 μmシリンジフィルターでろ過し、37°Cに保ちます。
  5. ステップ2.4で調製したコラゲナーゼ溶液(20 mL)を、断片化した組織と磁気バーを備えたクリスタルビーカーに加えます。容器を密封し、37°Cでゆっくりと連続的に攪拌しながらインキュベートします。
    注:酵素消化には約90分かかります(細胞膜の完全性を維持するためにゆっくりと攪拌を維持します)。
  6. 100 mmペトリ皿上のステンレス鋼、40メッシュ、0.38 mmアパーチャフィルターでホモジネートをろ過し、滅菌50 mLコニカルチューブで細胞懸濁液を回収します。
  7. 加温して添加したDMEM(10%ウシ胎児血清[FBS]、2 mMグルタミン、2 mMピルビン酸ナトリウム、100倍の非必須アミノ酸溶液、および100倍の抗生物質抗真菌溶液[AA])を20 mL加えます。間質血管画分(SVE)を慎重に懸濁します。
  8. 細胞懸濁液を290 x g で10分間遠心分離し、25 mLピペットで上清を廃棄し、40 mLの非添加DMEM培地で細胞を穏やかに洗浄します。
  9. この手順を繰り返します。ステップの間に新しい滅菌円錐形のチューブを使用して、最小限の量の細胞残骸と脂肪をドラッグします。
  10. ペレットを5 mLピペットで5 mLの添加DMEMに懸濁し、T-25 cm2 ボトルに移します。37°C、5%CO2で24時間インキュベートします。
  11. 翌日、加温した5 mLの1x PBS-AAで3回の洗浄を行い、非添加DMEMで2回の洗浄を行い、細胞残渣および非接着細胞を除去します。5 mLのピペットで5 mLの新鮮で温めたDMEMを追加し、3〜4日ごとに培地を交換します。

3. ASC初代培養の維持・拡大

  1. 細胞が90%〜100%コンフルエントに達したら(8〜2日±)、5 mLの非添加DMEMで2回洗浄します。加温した0.025%トリプシン-2 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)1 mLを加え、37°Cで5〜7分間インキュベートします。
  2. 細胞単層が剥離したら、添加したDMEMを4 mL加え、細胞懸濁液を穏やかに分解します。
  3. 細胞懸濁液を15 mLのコニカルチューブに移し、加温して添加したDMEMを5 mL加え、穏やかに懸濁させてホモジナイズします。
  4. 290 x g で5分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを1 mLの添加DMEMに穏やかに混合します。ノイバウアーチャンバー内の細胞をトリパンブルーで染色した後にカウントします。
  5. 最後に、T-75フラスコに2.5 x 103 細胞/ cm2 を1:4の分割比で播種します。このステップは、コロニー形成と高い増殖率を確実にします。

4. ASC初代培養の形態特性評価

  1. 倒立顕微鏡でASCの形態を観察します。
    注意: 組織学とASC識別のために取り付ける前に、カバーガラスを1%ゼラチン溶液で処理してください。紫外線を15分間照射します。
    1. 70%エタノール溶液からカバーガラスを取り出し、5分間乾燥させます。
    2. カバーガラスを滅菌1%ゼラチン溶液に浸し、水気を切り、室温(RT)で乾燥させます。
    3. 各カバーガラスを6ウェルプレートの各ウェルに入れ、プレートにUV光を15分間照射します。
    4. ウェルの中央に25 x 103 細胞を含む一滴を播種し、1分間待ってから、1 mLの添加DMEM培地を追加します。37°C、5%CO2で96時間インキュベートします。
    5. 培地を取り出し、トランスファーピペットを使用して1x PBS-AAで3回の洗浄を行います。
    6. 各ウェルに1 mLの3.5%中性ホルマリンを加え、RTで1時間インキュベートします。 ホルマリンを慎重に取り出し、各ウェルに1 mLの冷たい70%エタノールを加えます。
    7. 乾燥を防ぐために、使用時までプレートをパラフィルムで密封してください。
      注:ASCの細胞形態は、異なる継代中のヘマトキシリン-エオジン染色によっても評価されます。
    8. 各ウェルから70%エタノールを除去し、蒸留水で5分間細胞を水和します。その間、染色溶液を濾過する。
    9. 水を取り除き、ハリスのヘマトキシリン溶液で15分間ゆっくりと攪拌しながら細胞を染色します。
    10. 染色液を除去し、1x PBSで2回洗浄します。
    11. ゆっくりと撹拌しながら1分間エオジン溶液で細胞を染色する。次に、溶液を取り除き、1x PBSで2回の洗浄を行います。
    12. 各ウェルからカバーガラスを慎重に取り外し、PBS-グリセロール封入溶液(1:1 v/v)の滴にスライドを取り付けます。
    13. カバーガラスの周りにマニキュアのラインを置き、光学顕微鏡の下で組織学的スライドを観察します。

5. 免疫蛍光法によるASCの発現マーカー

  1. 1x PBS-0.05% Tween 20を含む洗浄バッファーを調製します。RTでゆっくりと振とうしながら洗浄を行います。プレートを2 mLのバッファー/ウェルで3回洗浄します(各洗浄で3分間インキュベートします)。
  2. ブロッキング試薬1 mL(1:10)を入れ、ゆっくりと攪拌しながら20分間インキュベートします。
  3. CD9(モノクローナルマウス)、CD34(ポリクローナルウサギ)、および抗CD63(ポリクローナルヤギ)の一次抗体200 μL(1:50希釈)を各ウェルに追加します。4°Cで一晩インキュベートします。
  4. プレートを再度3回洗浄し、抗マウスIgG FITC結合ヤギ、ロバ抗ヤギIgG DyeLight 550、およびヤギ抗ウサギIgG Cy3の二次抗体200 μL(1:50希釈)でインキュベートします。
  5. 1x PBS-0.05% Tween 20で3回洗浄し、細胞核を100 μLのDRAQ-7(希釈:1 mLの二重蒸留水に17 μL)で20分間対比染色します。
  6. さらに3回洗浄し、手順4.1.12〜4.1.13に従ってスライドを取り付けます。サンプルは光から保護し、使用するまで冷凍して保管してください。
  7. 落射蛍光共焦点顕微鏡下で、この装置に推奨される適切な設定とソフトウェアを使用してサンプルを視覚化します。

6. フローサイトメトリーによるASCの発現マーカー

  1. トリプシン処理または解凍した細胞(サブ継代3または4)からの単一細胞懸濁液を、1 x PBS-5%FBSの1 x 106 細胞/ mLの濃度で調整します。100 μLを100,000細胞とともに1.5 mL遠沈管に分注します。自己蛍光制御のためにラベルなしで1つのアリコートを使用してください。
  2. 製造元の指示に従って、適切な量の抗CD105 AF-594および抗CD31 AF-680をすべて追加して休息させます。暗所で4°Cで20分間インキュベートします。
  3. 余分な染色剤を1 mLの1x PBS-5%FBSで250 x g で5分間遠心分離して洗浄し、300 μLの1%ホルマリンに懸濁します。
  4. フローサイトメーターでサンプル取得を行います。細胞のゲーティング戦略は、FSC-A対SSC-Aゲーティング、SSC-H対SSC-A、続いてFSC-A対FSC-Hを使用して単一セルゲーティングに基づいています。
  5. CD105 AF-594にはY610-mCherry-A検出器を、CD31 AF-680にはR660-APC-A検出器を使用してください。

7. ASCの脂肪系統への分化

  1. 6ウェルプレートに、1 cm2あたり1 x 10 4細胞(P-4)を播種し、37°C、5%CO2で60-80%コンフルエント(~72-96時間)になるまでインキュベートします。4 μMインスリン、1 μMデキサメタゾン21-アセテート(Dxa)、および0.5 mMの3-イソブチル-1-メチルキサンチン(MIX)を培地に直接適用して分化を誘導します。2〜3日ごとに分化培地を交換してください。
  2. 2 mLの滅菌超純水に800 μMインスリンのストック溶液を調製し(完全に溶解するために20 μLの1 N HClを加えます)、-20°Cで保存します。 あらかじめ1:100に希釈したインスリンストック10 μLを加え、ウェルあたり最終容量2 mLで10 μLを塗布します。
  3. 滅菌超純水5 mLに1 mM Dxaの原液を調製します(完全溶解は起こりませんのでご注意ください)。4°Cで保存してください。 40 μL/ウェルの Dxa ストックの 1:4 希釈液を加えます。
  4. 2.5 mLの0.1 N NaOH溶液中の100 mMのMIXストックを調製し、ボルテックスし、40 μLの1 N NaOHを加えて完全に溶解します。-70°Cで保存してください。 10 μL/ウェルのMIXストックを追加します。
  5. 保存前に、0.22 μmの滅菌シリンジフィルターでストック溶液をろ過してください。
  6. 12日目に、細胞を1x PBSで3回洗浄し、500 μLの4%ホルマリンとともにRTで1時間インキュベートします。 続いて蒸留水で各ウェルを2回洗浄し、続いて60%イソプロパノールで5分間乾燥させます。
  7. 60%イソプロパノール(500 μL/well)で希釈した0.5%オイルレッドOを加え、RTで20分間インキュベートします。 蒸留水1 mLで3回洗浄し、倒立顕微鏡で観察します。
    注意: 必要な試薬、機器、および材料については、 材料表を参照してください。

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結果

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脂肪組織は、生後3〜4ヶ月齢で体重401±41g(幾何平均±SD)の成体Sprague Dawleyラットから得られた。精巣上体脂肪組織および腎周囲脂肪組織の平均値3.8gは、15回の実験的抽出の分析に対応していた。24時間の培養後、細胞集団はプラスチック表面に付着したままであり、不均一な形態を示した。最初の継代は8±2日目に実現され、合計8回の実験で1.4±0.6 x 106 細胞の収量が得られました。明視野の直接観察(図1)とヘマトキシリン-エオジン染色(図2)により、光学顕微鏡による形態学的特性評価が容易になりました。伸長した伸長と豊富な細胞内マイクロフィラメントで広範な細胞質が見られ、間葉系間質細胞の特徴でした。

ASCは、異なるサブ継代(1、3、7、および9)において間接免疫蛍光によって特異的に可視化された表面マーカーを発現しました(図3)。ASCは、試験したすべてのサブパ...

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ディスカッション

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間葉系幹細胞の発見から過去40年間、いくつかの研究者グループが、さまざまな組織や種から間葉系幹細胞を取得するための手順を説明してきました。ラットを動物モデルとして使用する利点の1つは、その容易な維持および迅速な発生、ならびに脂肪組織からのMSCの入手の容易さである。ASCを得るために、内臓脂肪、腎周囲脂肪、精巣上体脂肪、および皮下脂肪などの異なる組織源が記載されている12、13、14、15、16。

ここで採用されている抽出手順に関して、著者らは、ラットの体重を生後4か月で達成可能な350〜450 gにすることを推奨しています。動物の体重が450〜600 gで生後8か月までの場合、ラットあたりの脂肪組織の量(5.5 ± 2.1;平均± SD)が高かった。しかし、...

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開示事項

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著者は、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、メキシコ社会保障研究所(IMSS)とメキシコ小児病院、フェデリコ・ゴメス(HIMFG)、およびIMSS研究調整のBioterioスタッフに、このプロジェクトを実施するために与えられた支援に感謝しています。AOC(815290)奨学金を提供してくれた全米科学技術評議会と、視聴覚資料の技術サポートを提供してくれたアントニオドゥアルテレイエスに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アムホテリシン BHyCloneSV30078.01
分析天びんザルトリウスAX224
抗体 抗CD9 (C-4)サンタクルスSc-13118
抗体 抗CD34 (C-18)サンタクルスSc-7045
抗体 抗C63サンタクルスSc-5275
抗体 抗エンドグリン/CD105 (P3D1)Alexa Fluor 594 Santa CruzSc-18838A594
抗体抗CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680Santa CruzSc-18916AF680
抗体 ヤギ抗ラビットIgG (H+L) Cy3 NovusNB 120-6939
抗体 ロバ抗ヤギ IgG (H+L) DyLight 550 InvitrogenSA5-10087
抗体抗マウスIgG FITC 標識ヤギF (ab´)RDシステム。No. F103B
ボトルトップフィルター 滅菌済みCORNING10718003
細胞・組織培養フラスコBIOFIL170718-312B
セルカウンター ブライトライン血球計算計 セルカウンティングチャンバースライド付きSIGMA Aldrich Z359629
セルウェル:6ウェル、蓋付きCORNING25810
遠心分離機用コニカルチューブHeTTICHROTANA460R
遠心分離機 エッペンドルフチューブフィッシャー・サイエンティフィックM0018242_44797
コラーゲンIV ワージントンLS004186
クライオビアルSPL ライフサイエンス43112
培養チューブグライナー バイオワン 191180
CytExpert 2.0ベックマン・コールター無料版
CytoFlex LX サイトメーターBeckman CoulterFLOW-2463VID03.17
DMEMGIBCO31600-034
DMSOSIGMA Aldrich 67-68-5
DraQ7 DyeThermo Sc. D15106
EDTASIGMA アルドリッチ60-00-4
エオシン 黄色がかったハイセル300
エタノール 96%ベーカー64-17-5
ファルコンチューブ 15 mLグライナー バイオワン 188271
ファルコンチューブ 50 mLグライナー バイオワン 227261
ウシ胎児血清 コーニング35-010-CV
ゼラチンSIGMA アルドリッチ128111163
ゲンタマイシンGIBCO15750045
グリセリン高純度Herschi Trading 56-81-5
ヘマトキシリンAMRESCO 0701-25G
Heracell 240i CO2 インキュベーター Thermo Sc.
ケタミンペット(ケタミンクロリドレート)アランダSV057430
L-グルタミンGIBCO /サーモSc。 25030-081
LSMソフトウェア Zen 2009 V5.5無料版
生物学的安全キャビネット クラス IINuAire12082100801
エピ蛍光顕微鏡 ツァイス Axiovert 100M21.0028.001
倒立顕微鏡 オリンパス CK40CK40-G100
非必須アミノ酸 100XGIBCO11140050
マイクロチューブ 2 mL ザルスタット 72695400
マイクロチューブ 1.5 mLザルスタット 72706400
マイクロピペット 0.2-2 μLフィンピペットE97743
マイクロピペット 2-20 μLフィンピペットF54167
マイクロピペット 20-200 μLフィンピペットG32419
マイクロピペット 100-1000 μLフィンピペットFJ39895
窒素タンク 液体テイラーウォートン681-021-06
パラホルムアルデヒドSIGMA アルドリッチSLBC3029V
ペニシリン/ストレプトマイシン GIBCO/サーモ Sc.
ペトリ皿 細胞培養CORNING Inc480167
ピペットチップAxygen Scientific301-03-201
Pisabental (ペントバルビタールナトリウム)PISA AgropecuariaQ-7833-215
塩化カリウム J.T.Baker7447-40-7
リン酸二塩性カリウム J.T Baker2139900
S1ピペットフィラーサーモSC9531
セロジカルピペット 5 mLPYREXL010005
セロロジカルピペット 10 mLPYREXL010010
重炭酸ナトリウムJ.T Baker144-55-8
塩化ナトリウム J.T.Baker15368426
リン酸二塩基性無水J.T Baker7558-79-4
ピルビン酸ナトリウムGIBCO BRL11840-048
シリンジ フィルター 滅菌CORNING 431222
分光光度計PerkinElmer ラムダ 25L6020060
力価プレート シェーカーLAB-LINE1250
トランスファー ピペットSamco/Thermo SC728NL
トリパン ブルー豚GIBCOの1198566
トリプシンSIGMA Aldrich102H0234
Tween 20SIGMA Aldrich9005-64-5
Universal Blocking Reagent 10xBioGenexHK085-GP
Xilapet 2% (塩酸キシラジン)Pet's ファーマQ-7972-025
5011604715140122膵臓からのを染色します

参考文献

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