方法論記事

非扁平上皮非小細胞肺癌における超高速アンプリコンベースの次世代シーケンシング

DOI：

10.3791/65190

⸱

2023年9月8日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Clinical and Experimental Pathology, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Université Côte d’Azur, CHU de Nice, 2Hospital-Integrated Biobank (BB-0033-00025), Université Côte d'Azur, Hôpital Pasteur, CHU de Nice, 3Institut Hospitalo-Universitaire (IHU), RespirERA, Université Côte d'Azur, Hôpital Pasteur, CHU de Nice, 4FHU OncoAge, Université Côte d'Azur, 5Team 4, Institute of Research on Cancer and Aging (IRCAN), CNRS INSERM, Centre Antoine-Lacassagne, Université Côte d'Azur, 6Department of Pulmonary Medicine and Thoracic Oncology, Centre Hospitalier Universitaire de Nice, Université Côte d'Azur

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

非扁平上皮非小細胞肺がん(NS-NSCLC)のケア管理のために検査される分子バイオマーカーの増加は、迅速で信頼性の高い分子検出法の開発を促しています。超高速次世代シーケンシング(NGS)アプローチを使用したNS-NSCLC患者のゲノム変化評価のワークフローについて説明します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

非扁平上皮非小細胞肺がん(NS-NSCLC)患者の標的療法のためにテストされる分子変化の数は、ここ数年で大幅に増加しています。進行性または転移性NS-NSCLC患者の最適な治療には、分子異常の検出が必須であり、全生存期間を改善しながら標的療法を投与することができます。それにもかかわらず、これらの腫瘍は、新しい治療法を用いて標的化できる可能性のある耐性のメカニズムを発達させる。一部の分子変化は、治療反応を調節することもできます。NS-NSCLCの分子特性評価は、国際ガイドラインで推奨されているように、10営業日未満の短いターンアラウンドタイム(TAT)で実施する必要があります。さらに、ゲノム解析のための組織生検の起源は多様であり、そのサイズは、より侵襲性の低い方法とプロトコルの開発とともに継続的に減少しています。その結果、病理医は、効率的で迅速な診断戦略を維持しながら、効果的な分子技術を実行するという課題に直面しています。ここでは、NS-NSCLC患者の診断時に日常診療で使用される超高速アンプリコンベースの次世代シーケンシング(NGS)ワークフローについて説明します。このシステムは、胸部腫瘍学におけるプレシジョンメディシンで現在使用されている分子標的を適切なTATで特定できることを示しました。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

過去10年間で、標的療法や免疫療法の開発により、非扁平上皮非小細胞肺がん(NS-NSCLC)の全生存期間(OS)が大幅に増加しました1,2。この点で、NS-NSCLCを治療する際に解析すべき必須の遺伝子と分子標的の数は、ここ数年で増加しています3,4。

現在の国際ガイドラインでは、進行したNS-NSCLC5の診断時にEGFR、ALK、ROS1、BRAF、NTRK、RET、およびMETを検査することが推奨されています。さらに、最近、新薬が臨床試験で非常に有望な結果をもたらしたため、BRAC1/BRAC2、PI3KA、NRG1、およびNUT 6,7,8,9とともに、KRASおよびHER2を含む多くの追加遺伝子で追加のゲノム変化がまもなくスクリーニングされます。さらに、STK11、KEAP1、TP53などのさまざまな関連遺伝子の状態は、一部の標的療法および/または免疫チェックポイント阻害剤(ICI)に対する反応または耐性のより良い予測のために強い関心を持つ可能性があります10,11,12。

重要なことは、慎重な臨床的意思決定を確実にするために、分子の変化を大幅な遅延なく報告する必要があるということです。腫瘍の分子的特徴付けの欠如は、免疫療法を伴う/併用しない化学療法などの非標的療法の開始につながる可能性があり、化学療法反応は EGFR 変異や遺伝子融合などの実行可能な変化を伴う患者では限られているため、最適ではない治療戦略につながる可能性があります13。

さらに、ネオアジュバントおよび/またはアジュバント設定における標的療法/免疫療法の現在の開発は、ICIがEGFRおよびALKの野生型である腫瘍にのみ投与されるべきであるため、少なくとも初期段階のNS-NSCLCにおけるEGFRおよびALKの変化を体系的に探すことにつながる可能性があります EGFRおよびALK14。オシメルチニブ(第3世代EGFRチロシンキナーゼ阻害剤)はEGFR変異NS-NSCLCの補助療法として使用できるため、初期段階のNS-NSCLCにおけるEGFR変異の存在を検査することも現在必須である15。

NS-NSCLC患者におけるさまざまな標的療法および/または免疫療法に対する反応を予測する際のさまざまなバイオマーカーの評価戦略は急速に進んでおり、これらのバイオマーカーの連続的な同定を困難にしています3,16。この点で、次世代シーケンシング(NGS)は、NS-NSCLCの遺伝子変化のハイスループット並列評価に最適なアプローチです5,17。

しかし、NGSワークフローは習得が難しく、より長いTAT18,19まで実施される可能性があります。したがって、多くの施設では、シーケンシャルアプローチ(免疫組織化学(IHC)、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)および/またはターゲットシーケンシング)が依然として実施されています。ただし、この戦略は、サンプルサイズが小さい場合、そして何よりも、NS-NSCLC20でテストする必要がある実行可能な変異の数が多いため、制限されます。したがって、遺伝子変異の迅速な評価を可能にする超高速で簡単な検査方法は、最適な臨床的意思決定のためにますます重要になっています。さらに、特定の標的療法の処方には、分子検査の承認および認定システムが必須になりつつあります。

ここでは、フランスのニース大学病院の臨床実験病理学研究所(LPCE)で使用され、フランス認定委員会(COFRAC)によってISO 15189規格に従って認定されている、NS-NSCLCの分子検査用の超高速で自動化されたDNA/RNA NGSアッセイについて説明します(https://www.cofrac.fr/)。COFRACは、ラボが、ラボが実施するパネルを備えたシーケンサーでの自動NGSでの分子分析におけるテスト/キャリブレーションの活動に関する標準ISO 15189およびCOFRAC適用規則の要件を満たしていることを証明します。認められた国際規格ISO 15189に基づく認定は、定義された範囲に対するラボの技術的能力と、このラボにおける適切な管理システムの適切な運用を実証します。組織生検サンプルの調製からレポートの取得まで、このワークフローの利点と限界について説明します。

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プロトコル

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すべての手順は、地元の倫理委員会(Human Research Ethics Committee、Centre Hospitalier Universitaire de Nice、Tumorothèque BB-0033-00025)によって承認されています。サンプルと生成されたデータを使用することについて、すべての患者からインフォームドコンセントが得られました。すべてのサンプルは、2022 年 9 月 20 日から 1 月 31 日の間に LPCE (フランス、ニース) で NS-NSCLC と診断された患者から医療の一環として採取されました。

1. 自動精製装置(API)を用いたFFPE DNA・RNAサンプルの調製(処理時間:5時間15分)

  1. 装置で計画化を実行します。
    1. 機器の電源を入れ、ユーザー名とパスワード(資料表)を使用してサインインします。精製実行計画を作成するには、「 実行」→「 計画の追加」をクリックし、実行計画に名前を付けます。
    2. 次に、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)サンプルからDNAおよびRNAを連続的に精製するための適切な精製キットとプロトコルを選択します。精製後の定量が可能です。
    3. ドロップダウンリストから目的の溶出量(50 μL)を選択し、[ 次へ]をクリックします。抽出するサンプルの数を選択します。
    4. 次に、各サンプルを選択し、[ 編集] をクリックし、 サンプル ID を入力して、[ 保存] をクリックします。
  2. GPIを用いたFFPE DNAおよびRNAサンプルの分取
    1. FFPE組織サンプル(ミクロトームで10 μmの4つの切断切片)を調製するか、FFPEブロック上で直接マクロ解剖を行います。各FFPE組織サンプルを分離して同定したFFPEサンプル処理チューブに入れます(材料表)。
    2. 2000 x g で1分間遠心分離し、チューブの底で組織を回収します。
    3. 核酸精製キットから調製したプロテアーゼ消化マスターミックスを各FFPEサンプル処理チューブに添加し、60°Cで少なくとも60分間インキュベートします(材料表)。サンプルを90°Cで60分間インキュベートします。
    4. インキュベーション後、サンプルを室温(RT)で5分間冷却します。
    5. 各FFPEサンプル処理チューブについて、インナーチューブを持ち上げ、左に回してロックし、サンプルを2000 x g で10分間遠心分離します。
    6. 右に曲がってインナーチューブのロックを解除し、アウターチューブから分離して廃棄します。APIにロードされるまで、サンプルを外側のチューブに入れて氷上に保管してください。
    7. DNase 消化マスターミックスを調製し、プレフィルド FFPE DNA および RNA 精製プレート 2 にロードします。次に、調製したサンプルをFFPE DNA and RNA精製プレート1(材料表)にロードします。
  3. APIで精製実行を開始します。
    1. 「API」画面で、「 実行」をクリックし、「 実行計画」を選択して、「 次へ」をクリックします。
    2. 画面の指示に従って、精製の実行に必要な消耗品と試薬をAPIにロードします(材料表)。
    3. すべての試薬がロードされたら、[ 次へ]をクリックします。API ドアを閉じ、[ 開始] をクリックします。
    4. 分析の最後に、タッチスクリーンの 「アンロード」 をクリックし、精製したサンプルDNAとRNAが入った48ウェル核酸アーカイブプレートを直ちに取り外します。
    5. 定量結果をエクスポートします。プレートを密封し、精製したサンプルを-80°Cで保管します。 96ウェルプレートをシーケンサーに移して分析します。
  4. サンプルを作成し、実行を作成します。
    1. ソフトウェアを開いてサインインし、メニューバーで 「サンプル 」を選択し、「 サンプルの作成」をクリックします。
    2. サンプルの名前、性別、腫瘍細胞の割合を入力し、必要に応じて必須フィールドとオプションフィールドに入力します。
    3. 詳細を保存します(腫瘍細胞の性別と割合は、コピー数多型[CNV]の解析に重要です)。
    4. [Runs] と [Nucleic Acid] を選択して、メニューバーを表示します。
    5. セットアップ手順で実行名を入力します。「次へ」をクリックします。
    6. Assaysステップでassayを選択します。「次へ」をクリックします。
    7. [ Samples ]ステップでサンプルを選択し、アッセイで実行します。
    8. 次に、[ Selected Assays ]ペインで[ Assign]をクリックします。「 次へ」をクリックします。
    9. サンプル投入プレートのサンプル位置を確認します。「 次へ」をクリックします。
    10. 実行計画の概要を確認し、[ 保存して印刷 ] または [保存] をクリックします。

2. シーケンサーによるNGSの自動設定(処理時間:30分)

  1. サンプルプレートをセットします。
    注:最適な核酸濃度は0.5 ng / μLです。検証済みの核酸濃度範囲は0.33-1 ng/μLです。DNA および RNA については、1 ng/μL の濃度をラボで検証しました。
    1. シーケンサーには、20 μLの総容量が必要です。サンプルのローディングに十分な容量があることを確認してください。
    2. ポジティブコントロール(DNAおよびRNA)およびNTC(DNAおよびRNA)を抽出せずに精製装置の第1段階に添加します。各分析で DNA コントロールと RNA コントロールを使用して、分析を検証し、使用したバッチを検証します。API 分析の最後に DNA および RNA コントロールをプレートに添加します。
  2. シーケンサーを読み込み、実行を開始します。
    1. すべての試薬を箱から冷蔵庫または冷凍庫で取り出し、室温で最低30分(材料表)、最大12時間解凍します。
    2. 実験室では、オンサイトトレーニング中にサプライヤーから与えられたアドバイスに従って、シーケンサーを常にオンにしてください。システムにサインインします。
    3. プレートを粘着性PCRプレートホイルのシートで密封した後、サンプルを含む精製装置からプレートをロードします(材料表)。
    4. すべての消耗品をデッキに取り付けます。シーケンサーは、必要な各消耗部品を強調表示された位置にロードするためのステップバイステップの指示を提供します(材料表)。
    5. ストリップ3-HDのチューブ2に沈殿物がないことを確認します。 チューブをフリックするか、ストリップを静かにボルテックスして、必要に応じて沈殿物を溶解します。
    6. ストリップ 1 とストリップ 3 には磁気ビーズが含まれています。このステップは非常に重要です:ビーズが再懸濁されていることを確認してください。チューブの上部にビーズが残ってはいけません。
    7. ストリップを逆さまにして3〜4回戻して、ビーズを取り除きます。ストリップシールを上向きにして、ストリップの一端を持ちます。その後、素早く遠心力で腕を動かしてストリップを下向きに素早く振り、手首を鋭くフリックして仕上げます。
    8. 300 x g で15秒間遠心分離します。必要に応じて繰り返します。アダプターとストリップホルダーを使用してストリップを遠心分離し、ストリップの上部にあるボールの残留物に関連してランダムに観察される故障を最小限に抑えます。
    9. システムを閉じて、[ 次へ]をクリックします。シーケンシング試薬ベイドアを取り付けます(材料表)。戸を閉めて下さい。シーケンサーによって実行が自動的に開始されます。
  3. 清掃
    1. 実行後のクリーニングでは、実行が完了したら [ 次へ] をクリックします。
    2. ドアが次々と開く。画面の指示に従って廃棄物を空にし、すべての消耗品を取り外します。「 次へ」をクリックします。
    3. 終了したらデッキを閉じ、[ 次へ]をクリックします。2分間のUV洗浄が始まります。シーケンサーは、新しい実行を開始する準備ができています。

3. 統合ソフトウェアによる結果解析(患者別解析時間(サンプルADN、ARN):15分)

注:この技術は、フランス認定委員会(COFRAC)ISO 15189(https://www.cofrac.fr/)によって認定されています

  1. データと結果
    1. [結果]メニューで実行結果またはサンプル結果を選択します。[結果]/[実行結果]画面には、すべての実行が一覧表示されます。
    2. 列ヘッダーでフィルター処理して、結果の一覧を検索します。
    3. 「結果」をクリックし、「サンプル結果」をクリックします。次に、サンプル名列で目的のサンプルの名前をクリックして、一意のサンプルのシーケンシング結果を表示します。
    4. 画面の左上隅にある [列 ] をクリックするか、テーブルから列の選択を解除します。
  2. QC結果を表示し、アンプリコンカバレッジを表示します。
    1. [結果]画面の[QC]タブをクリックします。
    2. DNAについては、コピー数多様体(CNV)分析を検証するために、絶対ペアワイズ差(MAMED)の中央値が0〜0.5であることを確認してください。マップされた読み取りは 150 万より大きくなければなりません。
    3. RNA の場合、マッピングされたリードが 150,000 から 400,000 の間にあるかどうかを確認します。これを下回ると偽陰性のリスクがあり、それを超えると偽陽性のリスクがあります。
    4. サンプル名をクリックして、「 主な調査結果 」タブを開きます。
    5. [ amplicon Coverage Graphs] までスクロールします。
    6. カバレッジ グラフを確認します。アンプリコンカバレッジの最小しきい値を定義します(サプライヤーが提供しない場合)。範囲と閾値を定義するには、コントロールと野生型(WT)サンプルを混合します。次に、選択された1つ以上の変異のアンプリコンカバレッジの最小値を観察します。
  3. バリエーションの結果を表示します。
    1. データを表形式でエクスポートするには、画面の右上隅にある [ エクスポート ] をクリックします。
    2. 一核様体バリアント/挿入欠失バリアント(SNV/INDEL)の結果を表示するには、[ バリアント ]タブをクリックし、[ SNV/Indels]をクリックします。「 フィルターの編集 」をクリックし、「 フィルターなし」を選択します。
      注:感度閾値は、INCA(フランス国立がん研究所)グループ(https://www.e-cancer.fr/Professionnels-de-sante/Les-therapies-ciblees/Les-plateformes-de-genetique-moleculaire-des-cancers/Le-programme-d-assurance-qualite-des-plateformes)の推奨に従って5%に定義されています。
    3. 融合結果の表示と RNA エクソンバリアントの表示:[バリアント] タブをクリックし、[融合] をクリックします。
    4. 右上の[ Visualization and RNA Exon Variant]をクリックし、[ RNA Exon Variants ]プロットを確認します。
    5. このキットでは、EGFR、MET、AR遺伝子のエクソンスキッピングを検出することができます。[Visualization] をクリックします。分析が簡単です。
    6. RNAエクソンタイル融合の不均衡を表示する: 「 バリアント 」タブをクリックし、「 融合」をクリックします。
    7. 右上の [Visualization and RNA Exon Tile Fusion Imbalance] をクリックし、 RNA Exon Tile Fusion Imbalance プロットを確認します。不均衡融合とは、既知のパートナーとパネルでカバーされていないパートナーとの間の融合です。
    8. CNV 結果の表示: [バリアント] タブの [CNV] をクリックして、データを表示します。
      注:サンプルの性別とサンプルの腫瘍細胞の割合のサンプルの準備中に通知することにより、CNVの結果に注意する必要があります。 AR 遺伝子は X 染色体によってのみ運ばれます。性別が指定されていない場合、男性の性別が失われ、男性患者に偽陽性の結果をもたらす可能性があります。
  4. プラグインの結果を確認します。
    1. カバレッジ解析プラグインの結果を確認する: 右上の をクリックして [ファイルのダウンロード] を選択します。
    2. カバレッジ解析プラグインは、カバレッジ解析レポートを生成します。
    3. 分子 カバレッジ解析 プラグインの結果を確認する: 右上の をクリックして、ファイルをダウンロードを選択します。この分析では、すべてのアンプリコンがカバーされているかどうかを検証し、ソフトウェアが提供するコピー数バリアント(CNV)の結果を確認します。
  5. アッセイメトリクスとランレポートの表示
    1. 「実行の概要」の「レポートの実行」タブをクリックします。
    2. レポートを実行するには、ドロップダウンメニューで[サンプルの選択]オプションを選択します。
    3. アッセイメトリクスと実行レポート:画面上部にシーケンシングメトリクスが表示され、その後に[ Run Samples ]テーブルでサンプル固有のメトリクスが表示されます。
      注: カスタマー サポート アーカイブ (CSA) ファイルの情報は、結果のトラブルシューティングに役立ちますが、直接分析することはできません。CSA ファイルは、実行データ全体のデータを要約し、実行に失敗した場合の問題の原因を強調します。
    4. 実行レポートをダウンロードする: 「 レポート 」タブをクリックします。
    5. 「 レポートのダウンロード 」をクリックして、実行レポートの概要をPDF形式でダウンロードします。
  6. バリアント レポートを生成します。
    1. [設定]ステップで[レポートの生成]を有効にすると、実行のデータ分析中に各サンプルのバリアントレポートが自動的に生成されます。
    2. サンプルのバリアントレポートを生成すると、レポートは 2 つの場所で使用可能になります。 まず、 結果/サンプル結果 画面にリンクが表示されます。リンクをクリックしてPDFをダウンロードします。
    3. 次に、「レポート」タブの「バリアントレポート」ペインに移動し、「レポートのダウンロード」ボタンをクリックします。バリアントレポートに電子的または手動で署名します。
      注: 電子署名されたレポートには、[サンプル結果]画面のサンプル名の後に[サインオフ](Sign off)と表示されます。

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結果

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最近の出版物21で詳細に説明されている、ここで提示された手順を使用して、超高速アンプリコンベースの次世代シーケンシングアプローチを使用して、NS-NSCLC患者の診断のために日常的に行われる臨床診療における反射検査としての分子変化の評価に最適なワークフローを開発しました。この分析法の分子ワークフローを 図 1 に示します。パネルに含まれる遺伝子のリストを 補足図1に示します。

分子解析はNS-NSCLC患者259人を対象に実施された。153例の気管支生検、47例の経胸壁生検、39例の手術標本、および13例の胸水および7例のEBUSからの25個の細胞ブロックが含まれていた(表1)。242の有効または利用可能なNGS DNA/RNA解析において、KRAS(25.4%)、EGFR(18.2%)、BRAF(6.3%)、ERBB2(1.7%)およびMET(1.7%...

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ディスカッション

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NS-NSLCの診断時の分子変化評価のための反射検査としての超高速アンプリコンベースのNGSアプローチの開発は、NS-NSCLC5,22,23のすべてのガイドライン推奨および新しいバイオマーカーを検出するための最適なオプションです。シーケンシャル法(IHC、PCR、FISH)は特定の遺伝子のみに焦点を当てており、組織材料の枯渇を引き起こす可能性がありますが、このNGSワークフローでは、少量の核酸(この研究によると、DNAおよびRNAシーケンシングごとに最小13 ng)でも、突然変異、融合、増幅を含む50の遺伝子の状態を特異的かつ高感度に評価できます。

さらに、この方法は、NS-NSCLC患者の管理に迅速で適切な結果を提供します。オーダーメイドのアプローチと比較して、腫瘍の病期に応じて、医師の要求を待たずに分析する症例の初期選択がないため、貴重な時間を節約できます。このラインでは、進行したNS-NS...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Christophe Bontoux は、有料の講演活動に参加し、サーモフィッシャーサイエンティフィックから特典を受けています。Paul Hofmanは、有料の講演活動に参加し、サーモフィッシャーサイエンティフィックから利益と資金提供を受けています。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

サーモフィッシャーサイエンティフィックの装置と材料を使用する機会を与えてくださったサーモフィッシャーサイエンティフィックに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
96ウェルハードシェルプレートクリアサーモフィッシャーサイエンティフィック(米国マサチューセッツ州ウォルサム)4483354
接着剤PCRプレートホイルサーモフィッシャーサイエンティフィック(米国マサチューセッツ州ウォルサム)AB0626
AutoLys Mチューブ サーモフィッシャーサイエンティフィック(米国マサチューセッツ州ウォルサム)A38738FFPE サンプル処理チューブ
Genexus バーコード 1-32 HDサーモフィッシャーサイエンティフィック(米国マサチューセッツ州ウォルサム)A40261
Genexus GX5 チップおよびジェネクサスカプラーサーモフィッシャーサイエンティフィック(米国マサチューセッツ州ウォルサム)A40269
ジェネクサスピペットチップサーモフィッシャーサイエンティフィック(米国マサチューセッツ州ウォルサム)A40266
ジェネクサス精製装置サーモフィッシャーサイエンティフィック (米国マサチューセッツ州ウォルサム)A48148自動精製装置 (API)
ジェネクサスシーケンシングキットサーモフィッシャーサイエンティフィック (米国マサチューセッツ州ウォルサム)A40271
ジェネクサステンプレートストリップ 3-GX5 および 4サーモフィッシャーサイエンティフィック (米国マサチューセッツ州ウォルサム)A40263
Genexus Integrated SequencerThermo Fisher Scientific (米国マサチューセッツ州ウォルサム)A45727
Ion Torrent Genexus FFPE DNA/RNA精製コンボキットサーモフィッシャーサイエンティフィック(米国マサチューセッツ州ウォルサム)A45539
Oncomine Precision Assay GX(OPA)パネル(ストリップ1および2-HDを含む)Thermo Fisher Scientific(米国マサチューセッツ州ウォルサム)A46291

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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