ミトコンドリアDNA合成と分布のハイスループット画像ベースの定量

Summary

mtDNAの合成と分布を検出および定量するためのマルチウェルプレートフォーマットおよび自動免疫蛍光イメージングを使用して、細胞内のミトコンドリアDNA(mtDNA)代謝のダイナミクスを研究する手順について説明します。これはさらに、mtDNA代謝に対するさまざまな阻害剤、細胞ストレス、および遺伝子サイレンシングの影響を調べるために使用できます。

Abstract

細胞プロセスの大部分はエネルギーの継続的な供給を必要とし、その最も一般的なキャリアはATP分子です。真核細胞は、酸化的リン酸化によってミトコンドリアでATPの大部分を産生します。ミトコンドリアは、複製されて次世代の細胞に受け継がれる独自のゲノムを持っているため、ユニークな細胞小器官です。核ゲノムとは対照的に、細胞内にはミトコンドリアゲノムの複数のコピーがあります。ミトコンドリアゲノムの複製、修復、および維持に関与するメカニズムの詳細な研究は、正常状態と疾患状態の両方でミトコンドリアおよび細胞全体の適切な機能を理解するために不可欠です。ここでは、 インビトロで 培養したヒト細胞におけるミトコンドリアDNA(mtDNA)の合成および分布のハイスループット定量を可能にする方法が提示される。このアプローチは、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)取り込みによって標識された活発に合成されたDNA分子の免疫蛍光検出と、抗DNA抗体によるすべてのmtDNA分子の同時検出に基づいています。さらに、ミトコンドリアは特定の色素または抗体で可視化されます。マルチウェル形式で細胞を培養し、自動蛍光顕微鏡を利用することで、mtDNAの動態やミトコンドリアの形態を様々な実験条件下で比較的短時間で研究することが容易になります。

Introduction

ほとんどの真核細胞にとって、ミトコンドリアは多くの細胞プロセスにおいて重要な役割を果たすため、不可欠な細胞小器官です。何よりもまず、ミトコンドリアは細胞の主要なエネルギー供給者です¹。ミトコンドリアは、細胞の恒常性(例えば、細胞内酸化還元²およびカルシウムバランス³)、細胞シグナル伝達^4,5、アポトーシス⁶、異なる生化学的化合物の合成^7,8、および自然免疫応答⁹の調節にも関与しています。ミトコンドリア機能障害は、様々な病的状態およびヒト疾患に関連している¹⁰。

ミトコンドリアの機能は、核ゲノムとミトコンドリアゲノムの2つの別々のゲノムにある遺伝情報に依存します。ミトコンドリアゲノムは核ゲノムに比べて少数の遺伝子をコードしていますが、mtDNAにコードされた遺伝子はすべて人間の生活に不可欠です。mtDNAを維持するために必要なミトコンドリアタンパク質機構は、nDNAによってコードされています。ミトコンドリアレプリソームの基本成分、およびいくつかのミトコンドリア生合成因子はすでに同定されています(以前の研究^{でレビュー11,12})。しかし、ミトコンドリアDNAの複製と維持のメカニズムはまだ理解されていません。nDNAとは対照的に、ミトコンドリアゲノムは複数のコピーで存在し、ミトコンドリア遺伝子発現を調節するための追加の層を提供します。オルガネラ内のmtDNAの分布と分離、これらのプロセスがどの程度調節されているか、もしそうなら、どのタンパク質が関与しているかについては、現在ほとんど知られていません¹³。分離パターンは、細胞に野生型と変異したmtDNAの混合集団が含まれている場合に重要です。それらの不均等な分布は、有害な量の変異mtDNAを有する細胞の生成をもたらし得る。

これまでのところ、mtDNAの維持に必要なタンパク質因子は、主に生化学的方法、バイオインフォマティクス分析、または疾患関連研究によって特定されてきました。この作業では、以前に識別を逃れた要因を特定する可能性が高いことを保証するために、別の戦略について説明します。この方法は、チミジンのヌクレオシド類似体である5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)による複製または修復中のmtDNAの標識に基づいています。BrdUは、DNA合成中に新生DNA鎖に容易に組み込まれ、一般に、核DNAの複製をモニタリングするために使用されます¹⁴。しかし、ここで開発された手順は、抗BrdU抗体の免疫蛍光を用いてmtDNAに取り込まれたBrdUを検出するために最適化されています。

このアプローチにより、 in vitroで培養したヒト細胞におけるmtDNA合成と分布のハイスループット定量が可能になります。比較的短時間でさまざまな実験条件下でテストを実施するには、ハイスループット戦略が必要です。したがって、プロトコールでは、細胞培養のためのマルチウェルフォーマットおよびイメージングのための自動蛍光顕微鏡法を利用することが提案されている。このプロトコルには、siRNAライブラリによるヒトHeLa細胞のトランスフェクションと、その後のBrdUによる新しく合成されたDNAの代謝標識を使用したmtDNA複製または修復のモニタリングが含まれます。このアプローチは、抗DNA抗体の助けを借りてDNAの免疫染色と組み合わされます。両方のパラメータは、定量的蛍光顕微鏡を用いて分析される。さらに、ミトコンドリアは特定の色素で視覚化されます。プロトコルの特異性を実証するために、mtDNAを含まない細胞(rho0細胞)、よく知られているmtDNA維持因子のサイレンシング時のHeLa細胞、およびmtDNA複製阻害剤で処理した後のHeLa細胞でBrdU染色をテストしました。mtDNAレベルも独立した方法、すなわちqPCRによって測定された。

Protocol

1. siRNA混合物の調製

1. 実験開始の1日前に、細胞(例えば、HeLa)を100mmディッシュ上に播種し、翌日に70%〜90%のコンフルエントに達するようにする。
   注意: すべての操作は、層流チャンバー内の無菌条件下で実行する必要があります。
2. Opti-MEM培地で140 nMの濃度に希釈したsiRNAを適量調製します( 材料表参照)。96ウェルプレートをリザーバーとして使用できます。
3. 5 μLのsiRNA溶液(またはコントロールサンプルの場合はOpti-MEM培地)を黒色の384ウェル細胞培養マイクロプレートの各ウェルに追加します。
   注:テストするsiRNAサンプルの数に応じて、電子ピペットまたはマルチチャンネルピペットを使用できます。
4. 適量のRNAiMAXトランスフェクション試薬溶液( 材料表参照)をOpti-MEM培地で調製します。培地100 μLごとにRNAiMAXを1 μL添加します。
5. 10 μLのトランスフェクション試薬溶液を384ウェルプレートの各ウェルに加えます。これを行う最も便利で最速の方法は、試薬ディスペンサーを使用することです。
6. siRNAをトランスフェクション試薬とともに室温で30分間インキュベートします。

2. トランスフェクション用細胞の調製

1. インキュベーション中(ステップ1.6)、吸引装置( 材料表を参照)を使用して培地を吸引し、細胞を3 mLのPBSで洗浄します。
2. PBSで1:2に希釈したトリプシン1.5 mLを加え、細胞を37°Cで10分間インキュベートします。
3. セルが剥離していないか確認してください。その場合は、10%FBSを含む3 mLのDMEM培地を追加します。細胞を完全に懸濁し、15 mLチューブに移します。少なくとも150 μLの懸濁液を取り、細胞計数チャンバー内の細胞をカウントします( 材料表を参照)。
4. 10%FBS、ペニシリン、およびストレプトマイシンを含むDMEM培地に適切な濃度(HeLa株の場合は35,000 / mL)で細胞懸濁液を調製します。

3. 細胞トランスフェクション

1. 試薬ディスペンサーを使用して、20 μLの細胞懸濁液を384ウェルプレートの各ウェルに加えます。これにより、ウェルあたり700個の細胞が播種されます。
2. 細胞を室温で1時間インキュベートし、次いでインキュベーターに72時間(37°Cおよび5%_CO2)置く。

4. BrdUの設立

1. 10%FBSを含むDMEM培地中のBrdUの90 μM溶液( 材料表を参照)を調製します。
2. siRNAトランスフェクションの56時間後(細胞固定の16時間前)に、10 μLの90 μM BrdU溶液を384ウェルプレートの各ウェルに加えます(最終的なBrdU濃度は20 μMです)。
   注意: アクションはできるだけ早く実行する必要があります。したがって、試薬ディスペンサー、電子ピペット、またはマルチディスペンサーピペットを使用するのが最善です。BrdUを添加せずにコントロールウェルを準備することを忘れないでください。
3. 細胞を16時間インキュベートします(37°Cおよび5%_CO2)。

5.ミトコンドリアの標識

1. 10%FBSを含むDMEM中のBrdUの20 μM溶液を調製し、それにミトコンドリア追跡色素溶液( 材料の表を参照)を1.1 μMの濃度で加えます。
2. BrdU取り込み開始から15時間後(細胞固定の1時間前)に、10 μLのミトコンドリア追跡色素溶液( 材料表を参照)を384ウェルプレートの各ウェルに加えます(最終色素濃度は200 nMです)。
   注意: 試薬ディスペンサー、電動ピペット、またはマルチディスペンサーピペットを使用してください。BrdUを添加せずに、ミトコンドリア追跡色素を添加してコントロールウェルを保持することを忘れないでください。
3. 細胞を1時間インキュベートします(37°Cおよび5%_CO2)。

6.細胞固定

注:すべての洗浄はマイクロプレートウォッシャーを使用して最も便利に実行されますが、試薬の添加は試薬ディスペンサーを使用して最も迅速に実行されます。

1. マイクロプレートウォッシャー( 材料表を参照)を使用して、各ウェルを100 μLのPBSで2回すすぎます。2回目の洗浄後、25 μLのPBSをウェルに残します。
   注:PBSをウェルに残しておくと、次のステップで液体を追加する際の細胞剥離の可能性が低くなります。すべての洗浄はPBSを残したまま完了します。したがって、次のステップで添加される溶液は、残りのPBSと等量で添加されるため、常に2倍の濃度で調製する必要があります。
2. 0.4% Triton X-100およびHoechst 33342を含むPBS中の8%ホルムアルデヒド溶液25 μLを4 μg/mLの濃度で添加して細胞を固定します(個々の試薬の最終濃度はそれぞれ4%、0.2%、および2 μg/mLです)( 材料表を参照)。
3. プレートを暗所で室温で30分間インキュベートします。

7. ブロッキング

1. 各ウェルを100 μLのPBSで4回すすぎます。最後の洗浄後、25 μLのPBSをウェルに残します。
2. PBS中の6%BSAを25 μL加えます(最終的なBSA濃度は3%)。
3. プレートを暗所で室温で30分間インキュベートします。

8. 一次抗体の添加

1. マイクロプレートウォッシャーを使用してBSAを吸引し、ウェルに10 μLの溶液を残します。
2. PBS中の3%BSAで調製した一次抗体溶液10 μLを加えます。抗BrdUは0.8 μg/mL、抗DNAは0.4 μg/mL(抗体の最終濃度はそれぞれ0.4 μg/mLおよび0.2 μg/mL)を使用してください( 材料表参照)。
3. プレートを暗所で4°Cで一晩インキュベートします。

9. 二次抗体の添加

1. 各ウェルを100 μLのPBSで4回すすぎます。最後の洗浄後、ウェルに10 μLのPBSを残します。
2. PBS中の6%BSAで調製した4 μg/mL二次抗体溶液10 μLを追加します(最終濃度は2 μg/mLです)。Alexa Fluor 488やAlexa Fluor 555などの蛍光色素に結合したアイソタイプ特異的抗体(抗マウスIgG1および抗マウスIgM)を使用します( 材料表を参照)。
3. プレートを暗所で室温で1時間インキュベートします。
4. 各ウェルを100 μLのPBSで4回すすぎます。最後の洗浄後、50 μLのPBSをウェルに残します。
5. 粘着シーリングフィルム( 材料表を参照)でプレートをシールし、4°Cの暗所で保管します。 イメージングは2週間以内に行う必要があります。

10. イメージング

注意: イメージングは自動広視野顕微鏡で実行する必要があります。顕微鏡には、プレートの個々の領域を自動的に画像化するためのコントロールを備えたモーターステージを装備する必要があります。

1. プレートのコーナー領域(ウェルA1、A24、P24、P1)と中央のオートフォーカス設定を確認します。
   注意: イメージングには、可能な限り高い開口数を持つ20倍の短い作動距離対物レンズ( 材料表を参照)を使用することをお勧めします。
2. ライブビューモードでイメージングソフトウェアによって生成された強度ヒストグラムに基づいて、結果の画像が過飽和にならないように、個々の蛍光チャネルに対して十分に長い露光時間を選択します。
3. Z 軸でのイメージングに適した平面数を設定します。
   注: 倍率 20 倍の視野は十分に大きいため、すべてのセルが同じ焦点面にあるわけではないため、すべてのセルを正しい焦点面で表示するには、Z セクションを実行する必要があります。通常、5つの飛行機で十分です。ディスク容量の可用性に応じて、個々の Z スタックまたは最大強度投影のみを保存できます。代表的な結果のセクションに示されている画像解析は、最大強度投影に基づいています。
4. ウェルごとに表示する適切な数の視野を選択します。
   注:合流点にもよりますが、1つの視野で約60〜300個の細胞を画像化できます。通常、コンフルエントが60%〜90%のHeLa細胞の場合、5つの視野をイメージングすることで、500細胞から1,000を超える細胞まで分析できます。
5. イメージングするウェルを選択し、イメージングを開始します。

11. 定量画像解析

注:取得した画像の定量分析は、Cell Profiler¹⁵などのオープンソースソフトウェアを使用して実行できます。本研究では、ScanR 3.0.0ソフトウェアを使用して分析を実施しました( 材料表を参照)。

1. すべての蛍光チャンネルからのすべての画像に対してバックグラウンド補正を実行して、分析を開始します。分析対象物のサイズに応じて、適切なフィルターサイズ(細胞核に80ピクセル、BrdUおよびmtDNAスポットに4ピクセル)を選択します。
2. 細胞核に対応するチャネルのバックグラウンドに対する蛍光シグナルの強度の比に基づいてメインオブジェクトのマスクを作成することにより、画像のセグメント化を開始します。
3. BrdUスポットとmtDNAスポットをそれぞれ表すサブオブジェクトのマスクを、所定の構造に適した蛍光チャネルを使用して作成します。
   注: 各サブオブジェクトは、最も近いメイン オブジェクト(細胞核)に割り当てられます。
4. 分析中に測定するパラメータを設定し、すべての蛍光チャンネルの各マスク内の個々のピクセルの強度を測定します。
   注:特定の細胞核に割り当てられたサブオブジェクトの数と各サブオブジェクトの面積を計算する必要もあります。
5. 取得したデータに基づいて計算する派生パラメータを定義します。BrdUまたはmtDNAチャネルの総蛍光強度を取得するには、特定の細胞核に割り当てられたすべてのサブオブジェクトの強度を合計します。平均蛍光強度を得るには、総蛍光強度を、所与の細胞核に割り当てられたサブオブジェクトの面積の合計で割る。
   注:作成されたサブオブジェクト(BrdUまたはmtDNAスポット)が実際にミトコンドリアにあることを確認するには、ミトコンドリア追跡色素からの蛍光強度に基づいてそれらをゲートする必要があります。
6. R 4.2.2統計ソフトウェア¹⁶と次のパッケージを使用して、ScanRソフトウェアで取得したデータのさらなる分析を実行します:dplyr 17、data.table 18、ggplot2¹⁹、およびggpubr²⁰。この手順は省略可能です。

Results

mtDNAの合成および分布のダイナミクスのハイスループット研究のための手順のスキームを 図1に示す。マルチウェルプレートフォーマットを使用することで、siRNAライブラリを使用した異なる遺伝子のサイレンシングなど、多くの異なる実験条件の同時解析が可能になります。BrdUで新たに合成されたDNA分子を標識するために使用される条件は、HeLa細胞のミトコンドリアにおけるBrdU標識DNAの検出を可能にします(図2A)が、他の細胞タイプのアッセイを設定するための開始条件としても使用できます。BrdUとのインキュベーション時間は、時間経過実験に基づいて個々の細胞株に対して選択する必要があります(補足図1)。本研究では、siRNAのスクリーニングには高効率でトランスフェクトできる細胞が必要であるため、HeLa細胞を使用しました。重要なことに、抗BrdU抗体で得られるシグナルは、BrdUで処理された細胞でのみ観察できるため、特異的です(図2

Discussion

歴史的に、BrdUの取り込みおよび抗体検出によるDNA標識は、核DNA複製および細胞周期研究において使用されてきた14,27,28。これまでのところ、BrdU標識DNAを検出するためのすべてのプロトコルには、エピトープの露出を可能にし、抗体の浸透を促進するためのDNA変性ステップ(酸性または熱)または酵素消化(DNaseまたはプロテイナーゼ)が含まれています。これらのプロトコルは、密集した核DNA用に開発されました。しかし、mtDNAの異なる構成により、変性ステップのない手順の開発が可能になりました。これにより、手順が簡素化され、高スループットアプリケーションにより適したものになりました。このアプローチは、変性ステップを省略すると、核の外側でのみBrdU標識DNAを検出できるため、優れた結果が得られました(図2および図3

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2′,3′-ジデオキシシチジン(ddC)	Sigma-Aldrich	D5782
384 Well Cell Culture Microplates, black	Greiner Bio-One	#781946
5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU)	Sigma-Aldrich	B5002-1G	BrdU粉末を水に溶かし、20 mMのストック溶液と分注してください。20 µを使用します。ラベリング用のM BrdUソリューション。
接着シールフィルム	Nerbe Plus	04-095-0060
Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウスIgG1二次抗体	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A-21121
Alexa Fluor 555 ヤギ抗マウスIgM二次抗体	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A-21426
BioTek 405 LS マイクロプレートウォッシャー	アジレント
ウシ血清アルブミン(BSA)	Sigma-Aldrich	A4503
セルカウンティングチャンバー Thoma	Heinz Herenz	REF:1080339
ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM)	Cytiva	SH30243.01
ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	41965-062
ウシ胎児血清 (FBS)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10270-106
ホルムアルデヒド溶液	Sigma-Aldrich	F1635	ホルムアルデヒドは有毒ですので、安全データシートをよくお読みください。
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
IgG1 マウスモノクローナル抗BrdU (IIB5) 一次抗体	Santa Cruz Biotechnology	sc-32323
IgM マウスモノクローナル抗 DNA (AC-30-10) 一次抗体	Progen	#61014
LightCycler 480 System	Roche
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	Thermoフィッシャーサイエンティフィック	#13778150
MitoTracker ディープレッドFM	サーモフィッシャーサイエンティフィック	M22426	ミトコンドリアトラッキング染料
Multidrop Combi 試薬ディスペンサー	サーモフィッシャーサイエンティフィック
Opti-MEM	サーモフィッシャーサイエンティフィック	51985-042
オルカ-R2 (C10600) CCDカメラ	浜松
ペニシリン-ストレプトマイシン	Sigma-Aldrich	P0781-100ML
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
PowerUp SYBR Green Master Mix	Thermo Fisher Scientific	A25742
qPCR Primeer Fw B2M (reference)			CAGGTACTCCAAAGATTCAGG
qPCRプライマー Fw GPI (参照遺伝子)			GACCTTTACTACCCAGGAGA
qPCRプライマー Fw MT-ND1			TAGCAGAGACCCAACCGAACC
qPCRプライマー Fw POLG			TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC
qPCRプライマー Fw TFAM			GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT
qPCRプライマー Fw TWNK			GCCATGTGACACTGGTCATT
qPCRプライマー Rev B2M (参照)			GTCAACTTCAATGTCGGATGG
qPCRプライマー Rev GPI (reference gene)			AGTAGACAGGGCAACAAAGT
qPCRプライマー Rev MT-ND1			アトガーアガアタッガアッガ
qPCRプライマー Rev POLG			GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG
qPCRプライマー Rev TFAM			GGACTTCTGCCAGCATAATA
qPCRプライマー Rev TWNK			AACATTGTCTGCTTCCTGGC
ScanR顕微鏡	オリンパス
siRNA制御	Dharmacon	D-001810-10-5
siRNA POLG	Invitrogen	POLGHSS108223
siRNA TFAM	Invitrogen	TFAMHSS144252
siRNA TWNK	Invitrogen	C10orf2HSS125597
吸引装置	NeoLab	2-9335	細胞培養用吸引器
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML
Trypsin	Biowest	L0931-500
UPlanSApo 20x 0.75 NAオ	リンパス