自由に動くマウスにおけるマルチチャンネル細胞外記録

サマリー

プロトコルは自由に動く意識のマウスの細胞外の電気生理学的な特性を明らかにするための運動皮質(MC)の細胞外記録の方法論を、またローカル視野の潜在性(LFPs)および興味の行動の根底にあるネットワークの神経活動を評価するために有用であるスパイクのデータ分析記述する。

要約

プロトコルは自発的および/または特定の行動と電気生理学的な信号を関連付けることによって特定の仕事を遂行するマウスをすることのニューロンの発火およびネットワークローカル電界電位(LFP)の特性を明らかにすることを向ける。この手法は、これらの行動の根底にあるニューロンネットワーク活動を研究する上で貴重なツールとなります。本稿では、自由に動く意識のあるマウスにおける電極の埋め込みとそれに伴う細胞外記録の詳細かつ完全な手順について解説しています。この研究には、微小電極アレイを埋め込むための詳細な方法、マルチチャンネルシステムを使用して運動皮質(MC)内のLFPとニューロンスパイク信号をキャプチャし、その後のオフラインデータ分析が含まれます。意識のある動物におけるマルチチャンネル記録の利点は、より多くのスパイクニューロンおよびニューロンサブタイプを取得して比較できることであり、これにより、特定の行動と関連する電気生理学的信号との関係を評価できる。特に、本研究で説明したマルチチャンネル細胞外記録技術およびデータ解析手順は、行動マウスの実験を行う際に、他の脳領域にも適用できる。

概要

細胞外シグナルの重要な構成要素である局所電界電位(LFP)は、複数の行動の神経コードを形成するニューロンの大きな集団のシナプス活動を反映しています¹。ニューロンの活動によって生じるスパイクはLFPに寄与すると考えられており、ニュー^{ラルコーディング2}にとって重要である。スパイクとLFPの変化は、アルツハイマー病などのいくつかの脳疾患や、恐怖などの感情を媒介することが証明されています^3,4。多くの研究で、動物の覚醒状態と麻酔状態の間でスパイク活性が大きく異なることが強調されていることは注目に値します⁵。麻酔をかけた動物での記録は、高度に定義された皮質同期状態で最小限のアーチファクトでLFPを評価する機会を提供しますが、結果は覚醒した被験者に見られるものとはある程度異なります^6,7,8。したがって、脳に埋め込まれた電極を用いて、覚醒した脳状態で様々な疾患の神経活動を長い時間スケールと大きな空間スケールで検出することは、より有意義です。この原稿では、記録と分析を開始するために、スパイク信号とLFP....

プロトコル

すべてのマウスを商業的に入手し、室温22〜25°C、相対湿度50%〜60%で12時間の明/12時間の暗サイクル(現地時間午前8:00に点灯)で維持した。マウスは、餌と水を継続的に供給することができた。すべての実験は、華南師範大学の実験動物の飼育と使用に関するガイドラインに従って実施され、施設動物倫理委員会によって承認されました。生後3-5ヶ月の雄のC57BL/6Jマウスを用いた。

1. マイクロドライブシステム組立

1. 2つのスタルと可動マイクロドライブを固定するネジを使用して、2つのコンピュータ設計ボードを接続し、コネクタを1つのボードに取り付けます(図1A、Bi-iii)。ネジ(0.5 mm/円)をひねってマイクロドライブを駆動します。
2. マイクロドライブがMC領域の両側に8本のガイドチューブ(長さ~3 cm、内径~50 μm、外径~125 μm)を2セット搭載できることを確認し、同じ長さ(少なくとも15 mm; 図1Biv, v)。
3. 直径35μmのNiクロム線(~5cm)を16本切断し、ガイドチューブに連続して装填し、接着剤を塗布して固定します(図1Bi

結果

ハイパス(250Hz)フィルタを適用して、生の信号からマルチユニットスパイクを抽出しました(図6A)。さらに、PCAでソートした正常マウスのMCから記録された単位を検証し(図7A-D)、マウスのMCにおける単位の谷幅と波形持続時間を記録した。その結果、マウスのMC推定錐体ニューロン(Pyn)の谷幅と波形持続時間の両方が、推定介在ニューロン(IN)の谷幅と波形持続時間の両方が高いことが示されました(図7E、F;2サンプルのMann-Whitney検定;谷幅、推定Pyn:0.636 ms ± 0.004 ms、推定IN:0.614 ms ± 0.001 ms、p = 0.002; 波形の持続時間については、 推定Pyn:0.095 ms ± 0.004 ms、推定IN:0.054 ms ± 0.002 ms、p = 1.402 .......

ディスカッション

自由に動くマウスのマルチチャンネル記録は、神経科学研究において有用な技術であると考えられてきましたが、初心者が信号を記録して解析することはまだ非常に困難です。本研究では、マイクロドライブシステムの作成と電極注入の簡易ガイドラインと、スパイクソーティングソフトウェアと神経生理学的データ解析用ソフトウェア を介して 電気信号を捕捉および分析するための簡略化された手順を提供します。

自作のマイクロドライブシステムの品質は、自由に動くマウス^14,15,16,17の安定で定性的な信号の獲得に大きく貢献することから、本研究では、マイクロドライブシステムのために、より頑丈で軽量な構造を設計・用い、初心者でもマイクロドライブシステムを構築するための製造手順を簡単かつ明確に理解することができる。さらに、設計されたマイクロドライブ.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
2.54 mmピン	ヘッダーYOUXIN Electronic Co.、Ltd.	1 x 5	トゥルでスライドできる可動式マイクロドライブを申請します。
Adobe Illustrator CC 2017	Adobe	N/A	GraphPadから画像を最適化します。
BlackRock Microsystems	Blackrock Neurotech	Cerebus	このシステムには、ヘッドサッチ、DA変換、アンプ、コンピュータが含まれます。
真鍮ナット	東莞Gaosi Technology Co.、Ltd.	M0.8真鍮ナット	ナットはネジの位置を固定します。
真鍮ネジ	東莞Gaosi Technology Co.、Ltd。	M0.8 x 11 mm 真鍮ネジ	可動式マイクロドライブを固定するネジです。
C57BL/6J	広東Zhiyuanバイオメディカルテクノロジー株式会社	N/A	生後12週。
遠心分離管	Biosharp	15 mL;BS-150-M	スクロース液を持つマウスの脳を保存します。
塗料	の伝導性 Structure Probe, Inc.	7440-22-4	コネクタピンとNi線間のリード線接続品質を向上させる。
導電性銅箔テープ	3M	1181	を減らすため。
コネクタ	YOUXIN Electronic Co., Ltd.	2 x 10P	ヘッドテージをマイクロドライブシステムに接続します。
DC電源	Maisheng	MS-305D	電解病変用の電源装置。
歯科用セメント	Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd.	N/A	移植終了後、マウスの頭蓋骨に電極アレイを固定します。
デジタルアナログコンバーター	Blackrock	128-Channel	デジタルデータをアナログ信号に変換するデバイス。
エポキシ樹脂	Alteco	N/A	ピンを覆うため。
Excel	Microsoft	N/A	分析後にデータを集計します。
アイハサミ	JiangXi YuYuan Medical Equipment Co.,Ltd.	N/A	手術やニッケルクロム線の切断に。
細かい鉗子	JiangXiYuyuan医療機器有限公司	N/A	手術用。
鉗子	JiangXi YuYuan医療機器有限公司	N/A	手術やミルコドライブシステムの組み立てに。
冷凍ミクロトーム	Leica	CM3050 S	マウスをカットする」スライスに
脳 溶融シリカ毛細管	鄭州INNOSEPサイエンティフィック株式会社	TSP050125	To は、Ni-chromeワイヤーのガイドチューブとして機能します。
ガラス微小電極	Sutter Instrument Company	BF100-50-10	充填されたインクを使用して、注入の目的の場所をマークします。
GraphPad Prism 7	GraphPad Software	N/A	結果を分析して視覚化します。
ガイドチューブ	Polymicroの技術	1068150020	Niクロムワイヤーをロードするため。
ヘッドステージ	ブラックロック	N/A	信号を送信するツール。
ヘリウムバルーン	Yili Festive products Co., Ltd.	24インチ	ヘッドステージとマイクロドライブシステムの重量を相殺するため。
インク	セーラーペン(株)	13-2001	移植のための望ましい位置を印にするために。
ヨウ素チンキ剤	広東Hengjian製薬有限公司	N/A	マウスの頭皮を消毒します。
塩酸塩およびリドカインのリンコマイシン  塩酸塩ゲル	湖北kangzheng薬剤co.、ltd.	10g	炎症を抑えるために使用される薬。
メロキシカム	ヴィッキーバイオテクノロジー株式会社	71125-38-7	の術後の痛みを軽減するため。
マイクロマニピュレーター	サイエンティフィカ	サイエンティフィカ IVM トリプル	電極アレイの移植用。
顕微鏡	ニコン	エクリプス Ni-E	脳切片の画像取得
nanoZ インピーダンステスター	Plexon	nanoZ	マルチチャンネル微小電極アレイのインピーダンス測定や電極インピーダンス分光法(EIS)の実施に。
NeuroExplorer	Plexon	NeuroExplorer	電気生理学的データを解析するためのツール。
ニューロエクスプローラー	Plexon、米国	N / A	ソフトウェア。
Niクロム線	カリフォルニアファインワイヤー株式会社	M472490	35 μm ニッケルクロム線。
オフラインソーター	プレクソン	オフラインソーター	記録されたマルチユニットをソートするためのツール。
PCBボード	杭州Jiepei情報技術有限公司	N/A	コンピュータ設計のボード。
ペントバルビタール	シグマ	P3761	を麻酔します。
ペントバルビタールナトリウム	シグマ	57-33-0	を麻酔します。
蠕動ポンプ		Longer BT100-1F	灌流用装置
ポリホルムアルデヒド	サンゴンバイオテック	A500684-0500	マウス脳固定用固定液の主成分
PtCl4	天津金博蘭精化学有限公司	13454-96-1	金メッキ液の調製。
生理食塩水	広東Hengjianファーマシューティカル株式会社	N / A	マウスの頭蓋骨をクリーニングします。
銀線	蘇州Xinye電子有限公司	直径2mm	の接地電極と基準電極に適用します。
スカルドリル	RWD Life Science	78001	マウスの頭蓋骨に2つの小さな穴を慎重に開けます。
ステンレス鋼ネジ	YOUXIN Electronic Co.、Ltd.	M0.8 x 2	マイクロドライブシステムを保護し、グランド電極と基準電極をリンクします。
脳定位固定装置	RWD ライフサイエンス	68513	両側運動野の脳位固定装置の座標を行います。
スクロース	ダマオ	57-50-1	灌流後のマウスの脳を脱水する。
瞬間接着剤	Henkel AG & Co.	PSK5C	ガイドチューブとニクロム線を固定します。
温度調節器	ハーバード装置	TCAT-2	マウスの直腸温を37°Cに維持するため。C
テトラサイクリン眼軟膏	広東Hengjian Pharmaceutical Co.、Ltd.	N/A	手術中にマウスの目を保護するため。
スレッドラ	パラ	N/A	バルーンとヘッドステージをリンクします。
ワセリン	ユニリーバplc	N / A	電極アレイとマウスの頭蓋骨の間のギャップを覆うため。

ス干渉マウスマウスマウス