自由に動くマウスにおけるマルチチャンネル細胞外記録

細胞外シグナルの重要な構成要素である局所電界電位(LFP)は、複数の行動の神経コードを形成するニューロンの大きな集団のシナプス活動を反映しています¹。ニューロンの活動によって生じるスパイクはLFPに寄与すると考えられており、ニュー^{ラルコーディング2}にとって重要である。スパイクとLFPの変化は、アルツハイマー病などのいくつかの脳疾患や、恐怖などの感情を媒介することが証明されています^3,4。多くの研究で、動物の覚醒状態と麻酔状態の間でスパイク活性が大きく異なることが強調されていることは注目に値します⁵。麻酔をかけた動物での記録は、高度に定義された皮質同期状態で最小限のアーチファクトでLFPを評価する機会を提供しますが、結果は覚醒した被験者に見られるものとはある程度異なります^6,7,8。したがって、脳に埋め込まれた電極を用いて、覚醒した脳状態で様々な疾患の神経活動を長い時間スケールと大きな空間スケールで検出することは、より有意義です。この原稿では、記録と分析を開始するために、スパイク信号とLFP信号を迅速かつ簡単に計算するための一般的なソフトウェアを使用して、マイクロドライブシステムを作成し、パラメータを設定する方法に関する初心者向けの情報を提供します。

頭皮から記録された脳波(EEG)やイベント関連電位(ERP)などによる脳機能の非侵襲的記録は、ヒトやげっ歯類の研究で広く使用されてきましたが、EEGおよびERPデータは空間的および時間的特性が低いため、特定の脳領域内の近くの樹状突起シナプス活動によって生成される正確な信号を検出することはできません¹.現在、意識のある動物のマルチチャンネル記録を利用することで、霊長類やげっ歯類の脳にマイクロドライブシステムを移植することで、脳の深層部の神経活動を慢性的かつ漸進的に記録することができます1,2,3,4,5,6,7,8,9 .簡単に言うと、研究者は、脳の異なる部分を標的とするために、電極または四極管の独立した位置決めに使用できるマイクロドライブシステムを構築することができる^10,11。例えば、Changらは、軽量でコンパクトなマイクロドライブ¹²を組み立てることによって、マウスのスパイクおよびLFPを記録する技術を記述した。さらに、行動課題中のげっ歯類における複数の単一ニューロンおよびLFPを記録するために、カスタムメイドの付属部品を備えた微細加工されたシリコンプローブが市販されている¹³。マイクロドライブシステムの組み立てにはさまざまな設計が使用されてきましたが、マイクロドライブシステム全体の複雑さと重量の点で、これらの成功はまだ限られています。例えば、Lansinkらは、単一の脳領域から記録するための複雑な構造を有するマルチチャンネルマイクロドライブシステムを示した¹⁴。佐藤らは、自動油圧位置決め機能¹⁵を表示するマルチチャンネルマイクロドライブシステムを報告した。これらのマイクロドライブシステムの主な欠点は、マウスが自由に動くには重すぎることと、初心者には組み立てが難しいことです。マルチチャンネルの細胞外記録は、行動テスト中の神経活動を測定するのに適しており効率的な技術であることが示されていますが、複雑なマイクロドライブシステムによって取得された信号を初心者が記録および分析することは容易ではありません。自由に動くマウス^16,17では、マルチチャンネルの細胞外記録とデータ解析の全操作プロセスを開始することが困難であることを考慮し、本稿では、簡略化されたガイドラインを提示し、一般的に入手可能なコンポーネントと設定を使用してマイクロドライブシステムを作成する詳細なプロセスを紹介します。また、スパイク信号とLFP信号を高速かつ簡単に計算するための共通ソフトウェアのパラメータも提供されています。さらに、このプロトコルでは、ヘリウムバルーンの使用によりマウスを自由に動かすことができ、ヘッドステージとマイクロドライブシステムの重量を相殺することに貢献します。本研究では、マイクロドライブシステムを簡単に構築し、記録とデータ解析のプロセスを最適化する方法について概説する。

すべてのマウスを商業的に入手し、室温22〜25°C、相対湿度50%〜60%で12時間の明/12時間の暗サイクル(現地時間午前8:00に点灯)で維持した。マウスは、餌と水を継続的に供給することができた。すべての実験は、華南師範大学の実験動物の飼育と使用に関するガイドラインに従って実施され、施設動物倫理委員会によって承認されました。生後3-5ヶ月の雄のC57BL/6Jマウスを用いた。

1. マイクロドライブシステム組立

1. 2つのスタルと可動マイクロドライブを固定するネジを使用して、2つのコンピュータ設計ボードを接続し、コネクタを1つのボードに取り付けます(図1A、Bi-iii)。ネジ(0.5 mm/円)をひねってマイクロドライブを駆動します。
2. マイクロドライブがMC領域の両側に8本のガイドチューブ(長さ~3 cm、内径~50 μm、外径~125 μm)を2セット搭載できることを確認し、同じ長さ(少なくとも15 mm; 図1Biv, v)。
3. 直径35μmのNiクロム線(~5cm)を16本切断し、ガイドチューブに連続して装填し、接着剤を塗布して固定します(図1Bi、vi、vii)。
4. ワイヤの絶縁体を剥がし、チャネル マップに従ってコネクタから各ピンに露出した各ワイヤ、基準電極、および接地電極を連続的に撚り合わせ、各ピンに導電性塗料をゆっくりとコーティングします(図 1Bviii-x)。
5. エポキシ樹脂を使用してピンを覆い(図1Axi、xii)、インピーダンステスターを介して金メッキを行い、電極チップのインピーダンスを~350kΩに低減します(図1Bxiii、xiv)。インピーダンステスターのパラメータを次のように設定します:-10.08 μAの直流、1秒間、金めっき溶液、5 mM PtCl₄を含む。
6. 最後に、ネジをひねってマイクロドライブを上部に移動します。 図1A に示すように変更したマイクロドライブシステムの全体的なサイズを確認します(長さ約15 mm、幅10 mm、高さ20 mm、重量~1 g)。コンピュータ設計基板と可動部品の詳細な仕様を 図1Ai、ii.で確認する。

2. 電極アレイの埋め込み

1. 手術キットを滅菌し、滅菌手袋を着用し、手術開始前に医師の滅菌白衣を着用してください。
2. 痛みを管理するには、誘導チャンバー内のマウスにメロキシカム注射剤(5 mg / kg)の皮下注射を使用します。.次に、誘導チャンバー18,19でペントバルビタール(80 mg / kg)の腹腔内(i.p.)注射によってマウスに麻酔をかけます。つま先のつまみ反射がまだ存在する場合は、ペントバルビタール(20 mg / kg / h)の追加用量を適用します。.
3. マウスを脳定位固定装置に固定し、温度コントローラーを使用して直腸温度を37°Cに保ちます。
4. テトラサイクリン眼軟膏をマウスの両眼に塗布し、手術前に滅菌手袋を再度交換します。
5. マウスの毛皮を剃り、先端が滅菌した綿のアプリケーターを使用して、中心から外側に向かって同心円状にベタジンスクラブとアルコールを交互に3回交互に手術部位を消毒します(図2i、ii)。頭蓋骨を露出させるために、小さな正中線切開(~15 mm)を行います。すぐに、痛みを和らげるために1%リドカインを首の筋肉に局所的に塗布します。.次に、ハサミを使用して残存組織を取り除き、生理食塩水でコーティングされた綿棒を使用して頭蓋骨を洗浄します(図2iii)。
6. インクを充填したガラス微小電極を使用して、両側MCの埋め込みに必要な位置に印を付けます(図2iv、v)。以前の研究20に基づくと、両側MCの位置は次のとおりです:ブレグマの前方0.74 mm、正中線の外側^1.25 mm。
7. マイクロドライブシステムを保護するために4本のステンレス鋼ネジ(直径0.8 mm)を埋め込み、すべてのネジを基準電極と接地電極でリンクし、次に混合歯科用セメントで覆って壁を形成します(図2vi-xi)。
8. MC領域の調整された頭蓋骨の左側と右側の両方に頭蓋骨ドリルを使用して、2つの小さな穴(~1.5 mm²)を慎重に開けます(図2xii)。左右MCの脳定位座標を使用します:ブレグマの前方0.74 mm、正中線の外側1.25 mm、硬膜の腹側0.5 mm。
9. 細かい鉗子で硬膜を穴から慎重に取り外します(図2xiii)。
10. マイクロマニピュレーターを使用して、マイクロドライブシステムを10 μm/sで穴の中央に挿入します(図2xiv-xvii)。
11. マイクロドライブシステムの挿入が終わったら、ワセリンを歯科用セメントの壁に充填します(図2xviii)。
12. マイクロドライブシステムの底板と歯科用セメントの壁を混合歯科用セメントで接合します(図2xix)
13. 切開部を生理食塩水で洗浄した後、リンコマイシン塩酸塩と塩酸リドカインを含むゲルで局所処理を行い、術後の痛みを和らげます。
14. 導電性銅箔テープを埋め込み型マイクロドライブシステムに巻き付けます(図2xx)。
15. マウスを31〜33°Cに保たれたケージに移動し、麻酔からの回復をモニターします。
16. マウスを1週間回復させ、別々の給餌を行います。塩酸リンコマイシンと塩酸リドカインを含むゲルを3日間連続して塗布して切開部を確認し、治療します。

3. 自由動マウスの両側MCにおけるマルチチャンネル記録

1. 目覚めているマウスの頭を軽く慎重に持ちます。少なくとも1日前に、マイクロドライブシステム(図1Aii)の可動部分のネジをひねって、電極アレイ(~0.1mmの深さ)を下に移動します。
2. 目覚めているマウスの頭を軽く慎重に持ちます。ヘッドステージの中央とヘリウムバルーン(約0.02Lのヘリウム充填)をネジでリンクして、ヘッドステージとマイクロドライブシステムの重量を相殺します(図3A、B)。
3. 録音ソフトウェアで30kHzでサンプリングすることにより、記録電極とマルチチャンネルシステムを使用して生信号をキャプチャし、マルチチャンネルシステムからデジタルアナログ(DA)コンバーターを使用してデジタル化します。
4. 録音ソフトウェアで 10 kHz でリサンプリングして生データから LFP 信号を抽出し、録音ソフトウェアのノッチ フィルターを使用して 50 Hz のライン ノイズを除去します。
5. 自由に動くマウスから安定した状態で生データを少なくとも60秒間記録します。記録が終了したら、ヘッドステージとマイクロドライブシステム間の接続をゆっくりと取り外し、マウスをホームケージに戻します。
6. 記録したデータをコンピュータに保存し、オフラインで解析します(図4 、 図5)。
7. 実験終了後、研究所のガイドラインに従って安楽死を行い、3V出力の電源で電極の位置を確認し、1分間の電解病変を行い、その後組織学的解析を行います。凍結ミクロトームを用いてマウスの脳を30μmのスライスに切断し、MC切片を採取した後、顕微鏡で画像を撮影します(図3C、D)。

4. スパイクの選別と分析

1. スパイクソーティングソフトウェアで [File]>[Open > Nev files ]をクリックして、30 kHzでサンプリングされたスパイクデータを開きます(図4Ai)。
2. 「情報」をクリックしてソートされていないチャネルを選択し、「 ソート」>「ソート方法の変更」>「K-Meansの使用」を選択します。 K-Means Sorting>Valley-Seeking Sorting ボタンを押して、ソートされたユニットを取得します(図4Aii、iii)。
3. [File] > [Save as] をクリックし、ソートされたスパイク データをファイル名拡張子 .nev で保存し、[File] > [Export Per-Waveform Data] を選択して、.txtファイル名拡張子で PCA 結果をエクスポートします(図 4Aiv)。
4. 神経生理学的データ解析用のソフトウェアで[ File]>[Import Data > Blackrock File ]をクリックして、ソートされたスパイクファイルを開きます(図4Bi)。
5. [ 解析]>[オートコレログラム ]をクリックして、選択したユニットのオートコレログラムを取得し、パラメータを-0.05秒のX最小値、0.05秒のX最大値、0.001のビン値に設定します(図4Bii、iii)。
6. ソートされたスパイクデータをロードし、[ Analysis] > Interspike Interval Histograms をクリックしてスパイク間隔ヒストグラムを取得し、パラメータを0秒の最小間隔値、0.1秒の最大間隔値、0.001のBin値に設定します(図4Biv、v)。
7. Analysis > Crosscorrelogramsをクリックして、ソートされた2つの単位事象間のクロス相関図を取得し、参照事象とパラメータを-0.1秒のX最小値、0.1秒のX最大値、0.001のビン値に設定します(図4Bvi、vii)。
8. [結果] > [数値結果] をクリックして、オートコレログラム、スパイク間間隔ヒストグラム、およびクロス相関図の結果を.xlsファイル名拡張子で保存します(図 4Bviii、ix)。データを解析し、グラフを描画します。

5. LFP分析

1. 神経生理学的データ解析用のソフトウェアで[ File][Import Data > Blackrock File ]をクリックして、10 kHzでサンプリングされた連続信号データを開きます(図5Ai)。
2. [ Analysis > Spectrum for Continuous ] をクリックして、選択したチャネルからの LFP のパワー スペクトルを解析します。パラメータを次のように設定します:8,192の周波数値の数、3-5の複数のテーパー値、総パワースペクトル密度(PSD)のパーセンテージの正規化、および1Hzから100Hzまでの周波数範囲(図5Aii、iii)。
3. [ Analysis > Coherence for Continuous ] をクリックして、MC の左側と右側から 2 つの LFP のコヒーレンスを解析します。 リファレンスチャンネルとパラメータを次のように設定します。 コヒーレンス値、周波数値の数を8,192、マルチテーパー値を3〜5、周波数範囲を1Hzから100Hzで計算します(図5Aiv、 v).
4. MC の左側と右側から 2 つの LFP 間の相関関係を分析するには 、[Analysis > Corr. with Cont. Variables ] をクリックします。 基準チャンネル(LFPデータ)とパラメータを、X最小値を-0.1秒、X最大値を0.1秒、ビン値を0.001に設定します(図5Avi、 vii)。
5. [結果]>[数値結果]をクリックして、PSD、コヒーレンス、および相関の結果を.xlsファイル名拡張子で保存します(図5Aviii、ix)。
6. 各周波数帯域について代表的なトレースを抽出する必要があるチャンネルを選択し、[連続変数のデジタルフィルタリング>編集]をクリックして各周波数帯域を取得し、パラメータを[Filter Freq. Response as Bandpass]、[Filter Implementation]を無限インパルス応答(IIR)Butterworth、[Filter Order]の値を2に設定します。最後に、対象となる周波数範囲を設定します(図5Bi-iv)。
   注:ここで使用された周波数範囲は、デルタ(δ、1-4 Hz)、シータ(θ、5-12 Hz)、ベータ(β、13-30 Hz)、低ガンマ(低γ、30-70 Hz)、および高ガンマ(高γ、70-100 Hz)の発振です。
7. データを分析してグラフを描画します。

6. スパイクとLFPの相関関係

1. 神経生理学的データ解析用のソフトウェアで 、>データのインポート>ブラックロックファイルの ファイルをクリックして、連続信号データとスパイクデータを開きます。
2. [Analysis] > [Coherence Analysis] をクリックして 、選択したチャネルのスパイクと LFP の間のコヒーレンスを解析します。参照変数(スパイクタイミング)とパラメータを次のように設定します:コヒーレンス値、周波数値の数を512、マルチテーパー値を3〜5、周波数範囲を1Hz〜100Hzで計算します(図5Ci、ii)。
3. [結果]>[数値結果]をクリックして、スパイクフィールドの一貫性の結果を.xlsファイル名拡張子で保存します(図5Ciii、iv)。
4. データを分析してグラフを描画します。

ハイパス(250Hz)フィルタを適用して、生の信号からマルチユニットスパイクを抽出しました(図6A)。さらに、PCAでソートした正常マウスのMCから記録された単位を検証し(図7A-D)、マウスのMCにおける単位の谷幅と波形持続時間を記録した。その結果、マウスのMC推定錐体ニューロン(Pyn)の谷幅と波形持続時間の両方が、推定介在ニューロン(IN)の谷幅と波形持続時間の両方が高いことが示されました(図7E、F;2サンプルのMann-Whitney検定;谷幅、推定Pyn:0.636 ms ± 0.004 ms、推定IN:0.614 ms ± 0.001 ms、p = 0.002; 波形の持続時間については、 推定Pyn:0.095 ms ± 0.004 ms、推定IN:0.054 ms ± 0.002 ms、p = 1.402 x 10−16)であり、先行研究におけるPynとINの特徴に対応する21。また、推定 Pyn スパイクを基準として設定して、推定 Pyn と IN の間のクロスコレログラムを計算したところ、~18 ミリ秒で正のピークが見つかり(図 7G)、推定 Pyn スパイクが推定 IN スパイクの前に ~18 ミリ秒のウィンドウで発生することが示されました。

神経生理学的データ解析のために、ソフトウェアのIIRフィルターによってLFPから各周波数帯域の代表的なトレースをフィルタリングしました(図6A)。LFP解析では、正常マウスの左右MCのLFPはパワースペクトルが類似しており、左右のMC間の活動が同期していることが示唆された(図8A、B、2標本のMann-Whitney検定、δの場合、左MC:50.71±1.136、右MC:50.47±1.213、 p = 0.70、θの場合、左MC:2.197±0.187、右MC: 2.068 ± 0.193、 p = 0.40;βの場合、左MC:0.222±0.058、右MC:0.206±0.055、 p = 0.70;低γの場合、左MC:0.114 ± 0.034、右MC:0.093±0.018、 p = 0.70;高γの場合、左MC:0.054±0.027、右MC:0.04±0.015、 p = 0.40)。次に、左右のMC間のコヒーレンスと相関を計算し (図8C、D;左MC LFPは、右MC LFPの後、-1.167 ms±0.667 ms)~1.2 ms以内に続き、正常マウスの左MCのLFP(1-100 Hz)に同期した推定PynまたはINスパイクの大きさを計算しました(図8E)。これは、Pynと比較して、推定INのより強い低γコヒーレンスを示しました。

図1:電極とマルチチャンネル記録システムの図。 (A)マイクロドライブシステムのイメージ。私。コンピュータ設計基板の図面と仕様。ii. 可動マイクロドライブの概略図。(B)マイクロドライブシステムとマルチチャンネル可動式単電極ステップ。私。Niクロム線;電極の構成部分と、 iii. コンピュータ設計基板の組み立てコネクタと8本のガイドチューブを含む電極の予備組み立て。v.マイクロドライブの反対側。vi、vii。Niクロム線はガイドチューブに連続して装填されます。VIII-Xです。露出した各ワイヤは各ピンに連続して絡み合い、続いて各ピンに導電性塗料をコーティングします。xi,xii.ピンはエポキシ樹脂で覆われています。XIII、XIV。 金めっき。(C)自由に動くマウスのMCにおける細胞外記録の実験的デザイン。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:段階的な外科的処置。 i、ii.マウスの毛皮を剃り、ベタジンスクラブとアルコールを交互に3回投与して手術部位を消毒します。 マウスの頭蓋骨をきれいにします。iv. レベリング。v.脳の位置をマークします。ステンレス鋼のネジの位置に印を付けます。ステンレス鋼のネジを挿入します。ネジを基準電極と接地電極とリンクします。ix,xです。歯科用セメントを混ぜます。歯科用セメントで壁を作ります。xii、xiii。両側MCの上に2つの小さな穴を開け、続いて硬膜を取り外します。xiv. マイクロドライブシステムを準備します。xv-xixです。マイクロドライブシステムを移植し、その後、リンコマイシン塩酸塩と塩酸リドカインを含むゲルで局所治療を行い、術後の痛みを和らげます。 マイクロドライブシステムを導電性銅箔テープで保護します。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:意識のあるマウスの頭部固定記録の図。 (A)自由に動く記録の模式図。(B)自由に動く記録からの画像の詳細。私。埋め込まれたマイクロドライブシステムの平面形状。ii. ヘッドステージIII、IV.マイクロドライブシステムとヘッドステージが接続されています。v.ヘリウムバルーンは、ヘッドステージとマイクロドライブシステムの重量を相殺するために適用されます。(c)電解病変を用いて記録部位の位置を確認する説明図。(D)マウスのMCの電解病変によって標識された記録部位。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:スパイクのソートと分析の図。 (A)スパイクデータをクラスタリングし、結果をエクスポートするためのパラメータ。 私。スパイクデータをインポートします。ii. ソート方法を選択します。iii. κ 平均アルゴリズムを使用してスパイク データを並べ替えます。iv. ソートされた単位から結果をエクスポートします。(B)ソートされたユニットのスパイク間間隔ヒストグラム、オートコレログラム、およびクロスコレログラムを分析するプロセス。私。ソートされたスパイクデータをインポートします。ii. 自己相関分析を実施する。iii. オートコレログラムのパラメータを設定します。iv. スパイク間間隔ヒストグラムを取得します。v. スパイク間隔ヒストグラムのパラメータを設定します。vi. ソートされたユニットからのスパイク間の相互相関を計算します。vii. クロスコレログラムのパラメータを設定します。VIII、IX。結果をエクスポートします。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図5:連続データ解析の図。 (A)LFPのパワースペクトル、コヒーレンス、および2つのLFP間の相関を使用して計算されたLFP信号を分析するためのプロセスとパラメータ。 i. LFP データをインポートします。ii. バイラテラル MC からの LFP のパワー スペクトル密度を計算します。Aiii.LFPのパワースペクトル密度を計算します。iv,v. LFP 間のコヒーレンスを計算する。vi、vii。2 つの LFP 間の相関関係を計算します。結果をエクスポートします。(B)LFP信号から各周波数範囲をフィルタリングするプロセス。i. LFPデータから異なる周波数帯域を抽出します。II、III.フィルタリングされた LFP を表示します。iv. フィルター処理された LFP を拡張メタファイルとして保存します。(C)ニューロンスパイクとLFPの間のコヒーレンスを解析するプロセス。 I、II.LFP とソートされたスパイクの間のコヒーレンスを計算します。III、IV.結果をエクスポートします。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図6:記録された信号の代表的なトレース。 スパイクは、30 kHz でサンプリングされた生データから 250 Hz でハイパス フィルター処理されました。LFP は、10 kHz でサンプリングされた生データです。δは、LFPから1〜4Hzでバンドパスフィルタリングされたデルタ周波数帯域です。θ は、LFP から 5 〜 12 Hz でフィルタリングされたシータ周波数帯域です。βは、LFPから13〜30Hzでフィルタリングされたベータ周波数帯域です。低γは、LFPから30〜70Hzでフィルタリングされた低ガンマ周波数帯域でした。高γは、LFPから70〜100Hzでフィルタリングされた高ガンマ周波数帯域でした。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図7:選別されたユニットの特性とその発射パターン。 (A,B) 選別されたユニットは、同じ電極からの主成分分析(PCA)を使用してクラスター化されました。(C、D)推定興奮性ニューロン(Pyn)と推定される抑制性ニューロン(IN)の自己相関(上)とスパイク間間隔ヒストグラム(下)。(E)推定Pynの谷幅は、推定INの谷幅よりも有意に高かった(推定Pyn:n = 1,055スパイク、推定IN:n = 1,985スパイク)。(F)推定Pynの波形持続時間は、推定INの波形持続時間よりも強かった(推定Pyn:n = 1,005スパイク、推定IN:n = 1,059スパイク)。(G) 推定 Pyn と IN の相互相関。Mann-Whitney検定による統計分析。すべてのデータは、平均の平均±標準誤差、**p < 0.01、***p < 0.001として表されます。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図8:マウスの両側MCからの2つのLFPの解析と、スパイクイベントとLFPのコヒーレンス。 (A,B)マウスの各周波数帯域における両側MCの正規化されたパワースペクトル(n = 3)。(C)左右のMC間の2つのLFPのコヒーレンスの曲線(n = 3)。(D)±100msのタイムラグ(n=3)における左右MCの相関を示す2つのLFPの相互相関曲線。(E)マウスのMCにおけるスパイク場コヒーレンスの曲線。Mann-Whitney検定による統計分析。すべてのデータは、平均±平均の標準誤差として表されます。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

著者は何も開示していません。