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方法論記事

長期循環停止後の体外心肺蘇生法の小児動物モデル

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DOI:

10.3791/65266

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2023年5月26日

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1Sant Joan de Déu Research Institute, 2Vanderbilt University School of Medicine, Vanderbilt University, 3Department of Pediatric Critical Care Medicine, Sant Joan de Déu Hospital, 4BCNatal-Barcelona Center for Maternal Fetal and Neonatal Medicine, Sant Joan de Déu Hospital, 5Department of Pediatric Cardiology, Sant Joan de Déu Hospital, 6Department of Critical Care Medicine, University of Pittsburgh

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、心肺バイパス (CPB) の新生児ブタ モデルについて説明し、循環停止と心停止は、CPB に続発する重度の脳損傷やその他の合併症を研究するためのツールとして記述されています。

要約

先天性心疾患(CHD)は、最も蔓延している先天性奇形であり、世界中で年間約100万人の出生が影響を受けています。この疾患の包括的な調査には、適切で検証された動物モデルが必要です。子豚は、解剖学的構造と生理学が類似しているため、トランスレーショナルリサーチによく使用されます。この研究は、循環器系および心停止 (CA) を伴う心肺バイパス (CPB) の新生児子豚モデルを記述し、検証することを目的としていました 重度の脳損傷やその他の心臓手術の合併症を研究するためのツールとして。この作業は、資料のリストを含めるだけでなく、他の研究者がこのプロトコルを計画および実行するためのロードマップを提供します。経験豊富な開業医がいくつかの試験を行った後、モデルの代表的な結果は92%の成功率を示し、失敗は小さな子豚のサイズと異なる血管の解剖学的構造に起因していました。さらに、このモデルにより、開業医は、CAのさまざまな時間、温度変化、薬理学的介入など、さまざまな実験条件から選択することができました。要約すると、この方法は、ほとんどの病院ですぐに入手できる材料を使用し、信頼性と再現性があり、心臓手術を受ける子供のトランスレーショナルリサーチを強化するために広く採用できます。

概要

先天性心疾患(CHD)は、最も蔓延している先天性奇形であり、世界中で年間約100万人の出生が影響を受けています1。心臓胸部外科(CTS)と集中治療の現代の進歩により死亡率は改善されましたが、併存疾患は依然として非常に一般的です2,3,4,5。認知障害、運動障害、学習障害などの神経発達異常は、これらの患者の約25%〜50%で報告されています6,7,8。生後数日間の手術、特に循環器系および心停止(CA)を必要とする手術は、罹患率を増加させることが実証されています9。手術中の血行動態の変化は、脆弱な発達中の新生児の脳に重要な影響を与える可能性があります。これらの異常の原因をよりよく理解し、これらの患者の予後を改善するための神経保護戦略を調査するためには、実験モデルが不可欠です。

この集団を研究するための動物モデルの使用は、広く文書化されています5,10,11,12,13,14。特に、子豚は、心臓の解剖学的構造(図1)、ゲノム、および生理学の近似性、および他の動物モデル15(図2)と比較して比較的大きいサイズを考えると、優れた選択肢を提供します。心肺バイパス術 (CPB) と CA の両方の影響を研究するための子豚モデルの使用は、以前に説明されています。これらの実験動物モデルは、血行動態の変化および関連する末端組織器官合併症の研究に有用である14,16,17,18,19,20。これらのモデルは、研究者が制御された環境で人間の状況を研究できるように開発され、さまざまな実験条件に柔軟に対応できるように開発されました。ほとんどの研究で、高度な外科的技術が必要で、より高いリソース利用が必要であり、長期的な生存を確保することが困難である中央カニューレ挿入の使用が報告されています。以前の研究では、CPB12,15 の研究における子豚の使用が文書化されていますが、末梢カニューレ挿入技術を提案したものはほとんどありません。

この新しい末梢カニューレ挿入技術は、他の公開された研究と比較すると、より簡単で、攻撃性が低く、実現可能です19。さらに、新生児や小動物でこの技術を検証することは斬新であり、CHDとそれに関連する併存疾患の研究に動物モデルを使用することに関心のあるすべての研究者が使用することを検討する必要があります。これは、動物モデル実験の実施経験を持つ消耗品、リソース、および人員を備えた実験室にアクセスできる個人に特に適しています。

要約すると、この研究の主な目的は、CA を使用した CPB の新生児子豚モデルを記述し、検証することです。このプロトコルは、CPB 手術の重度の脳損傷やその他の可能性のある合併症を、さまざまな実験条件で制御された環境で研究することを目的としています。この方法は、一般化可能で信頼性が高く、高品質のモデルを提供し、さまざまな実験プロトコルに使用できます。

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プロトコル

本手続きは、カタルーニャ比較医学・バイオイメージセンター(CEEA-CMCiB)の動物実験倫理委員会(CEEA)によって承認されました。また、カタルーニャ州政府は、実験プロトコル(No.11652)、ファイル識別番号FUE-2022-02381434、ID QBXQ3RY3Jを承認しました。監督と支援を提供する認定獣医師を含む経験豊富な開業医が、すべての実験を行いました。本研究では、生後4〜6日、体重2.5〜3.5 kgの子豚(Sus scrofa domestica)を使用しました。関連するバイアスを避けるために、性別分布のバランスをとる試みがなされました。

1. 鎮静、挿管、アクセス

  1. 筋肉内ケタミン(20 mg / kg)、デクスメデトミジン(0.02 mg / kg)、およびミダゾラム(0.3 mg / kg)を使用して鎮静と鎮痛を開始します。.動物が深く鎮静されたら(前投薬の投与から5分後)、鼻マスク(2L /分)を介して100%O2 で酸素を供給します。次に、IVプロポフォール(0.5 mg / kg)で麻酔を誘発します( 材料の表を参照)。
  2. 子豚を背側横臥位に配置します。気管を直接可視化し、2.5 mmのカフ付き気管内チューブ( 材料の表を参照)を使用して気管挿管を行います。
    1. 肺基部の直接聴診 により 、適切な気管内チューブの配置を確認します。
  3. 毎分30回の呼吸数、8〜12 mL / kgの一回換気量、および4 cmH2Oの呼気終末圧を提供するように機械的換気を設定します。
  4. プロトコル中の麻酔の深さを、心拍数(HR)、血圧(BP)、酸素飽和度(spO2) を介して 継続的に監視します。必要に応じて、換気と鎮静のパラメータを調整します。
    注:バイタルの理想的な値は、HRが130〜160 bpm、BPが75〜95 / 60〜70、spO2が85>です。
  5. 1.5%セボフルランとフェンタニル(25-200μg/kg/分)で鎮静を維持します( 材料の表を参照)。
  6. 直接視覚化を使用して、カテーテルを大腿動脈(3 Fr)と静脈(4 Fr)に留置します( 材料の表を参照)。
    注:これらのカテーテルは、投薬とサンプル取得に使用されます。そのため、アクセスを維持することが重要です。

2. CPB回路のセットアップとプライミング

  1. 次の手順に従って、CPB 回線をカスタマイズしてセットアップします(図 3)。
    1. チューブをできるだけ短くしますが、機械から動物に到達するのに十分な距離を確保します。
    2. 膜型人工肺からの流出( 材料の表を参照)をポンプへの流入に接続するチューブブリッジを作成して取り付けます。
      注:ブリッジは、動物のCAが実行されている間、血液が機械内を循環し続けるために不可欠です。
  2. すべての接続ポイントが密閉されたら、300 mLのヘパリン生理食塩水(1 Lの生理食塩水に1,000 UIのヘパリンを混合)と300 mLの新鮮なドナー豚の血液で回路をプライミングし、続いて3.5 mEqの重炭酸ナトリウム、350 UIのヘパリン、および450 mgのグルコン酸カルシウムをプライミングします( 材料の表を参照)。
    1. 血液、ヘパリン-生理食塩水、重炭酸ナトリウム、およびグルコン酸カルシウムの混合物を0.3 L / minの速度で2分間回路全体に流すことにより、回路を「スイープ」します。

3. 手術とCPB開始

注: 補足図1 は、カニューレの配置に必要な手術材料を示しています。

  1. 左内頸静脈と右頸動脈を露出させて、カニューレ挿入の準備をします(図4)。
  2. カニューレ挿入には、セルディンガーまたは「オーバーザワイヤー」技術21を使用します。
    1. まず、左内頸静脈に針カテーテルを挿入します。血液の閃光が視覚化されたら、ガイドワイヤーを血管に慎重に挿入し、針を取り外して、ワイヤーが所定の位置に留まるようにします。
    2. 拡張器をワイヤーに通して容器に通し、拡張器を取り外します。
    3. ワイヤーを所定の位置に残したまま、8 Fr静脈カニューレを通し、血管内にゆっくりと~4 cm進めます。ワイヤーを慎重に取り外し、カニューレが所定の位置に留まることを確認します。
    4. 拡張してセルディンガーワイヤー技術を繰り返し、6 Frの小児用動脈カニューレ( 材料の表を参照)を右頸動脈に配置します。
    5. 動脈カニューレ挿入時には、新しく配置された動脈カニューレ を介して 静脈内ヘパリン(50 IU / kg)のボーラスを投与します。.
  3. アクセスが完了したら、3-0ポリ吸収性縫合糸とテープを使用して両方のカニューレを動物にしっかりと固定し、不注意による取り外しを防ぎます(図5)。
  4. カニューレをCPB回路に接続し、ヘパリンを含む生理食塩水が接続ポイントに追加されて、回路内の空気を防ぎます。
  5. 初期流量を80〜85 mL / kg / minに設定し、ゆっくりと増やして最終流量を150 mL / kg / minにします。
    注:動物は、実験に必要な限りCPBに留まることができます。ステップ 1 から 3 のスキーマを 補足図 2 に示します。

4. 循環器系および心停止(CA)

  1. CAを誘導するには、9 mEqのKClを投与します。必要に応じて、追加の KCl を管理します。
  2. 心臓が停止したら、動物を回路から隔離して循環停止を誘発します。
  3. 前述のブリッジ(ステップ3.5)を1,500rpmで循環させてCPB回路の流れを維持します。

5. 体外式心肺蘇生法(eCPR)

  1. 適切なCA条件(0分、30分、または60分)が達成されたら、eCPR蘇生を開始します。
  2. 子豚をCPB回路に再接続します。
  3. 3 mLのグルコン酸カルシウム(2.25 mmol / 10 mL、1:2に希釈)と6 mLの重炭酸ナトリウム(1 M、1:2に希釈)を末 ?? 動脈アクセス を介して 投与し、必要に応じて用量を追加します。.
    注:必要に応じて、除細動薬または変力薬(アドレナリンまたはドーパミン)を使用できます。

6. 術後ケア

  1. 蘇生後、安定性を確保するために15分間バイタルを監視します。
    注:集中治療室期間の理想的なパラメータは、HRが100〜150 bpm、BPが75〜95 / 60〜70、spO2が85>です。
  2. 動物を磁気共鳴画像法(MRI)に移します。
    注:イメージング後、動物は回復せず、麻酔下でペントバルビタールナトリウムの静脈内投与により安楽死させられ、組織学的分析のための脳サンプルを取得しました。サンプル収集戦略を含む、手順の実験部分のタイムラインは、 補足図3でご覧いただけます。

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結果

6 か月間に、小児救命救急医、小児心臓専門医、獣医師、および技術者の学際的なチームによって、完全なプロトコルが 12 回実施されました (補足図 2 および 補足図 3)。

図1と 図2 は、このプロトコルで使用される動物の予想される解剖学的構造を示しています。含まれた子豚は平均4.8日齢(4-6日)で、平均体重は2,814g(2,400-3,140g)であった。合計42%が女性でした。全員が鎮静剤を打錠し、挿管に成功しました。鎮静からカニューレ挿入までの平均時間は3.2時間(1.75-3.72時間)でした。血管カニューレ挿入とCAによるCPBは、実験の92%で成功裏に達成されました。1つの障害はカニューレ挿入中に発生し、おそらく小さな子豚のサイズとバリアント血管の解剖学的構造に続発します(表1)。KCl投与から停止までの平均時間は2分(1〜6分)、eCPR開始から心拍回復までの平均時間は12分(...

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ディスカッション

心肺バイパス術は、成人、小児、新生児の心臓手術でよく使用されます。これは、電動体外回路と膜型人工肺に依存しており、これらが連携して血液を酸素化し、肺と心臓の安定化を実現します。以前の研究では、CPB が多くの臓器系 (腎臓、脳、肺、心臓、消化器) に悪影響を与える可能性があることが実証されています 病気の患者と以前は健康な患者の両方 22,23,24。これは、動脈脈圧の喪失、血球の異物への曝露、および/またはカニューレ挿入に続発する局所的な低灌流など、さまざまな要因によって引き起こされている可能性があります25。

ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、イヌ、およびブタを含む、CPBのいくつかの動物モデルが提案されている26,27,28,29。...

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開示事項

著者は何も開示していません。

謝辞

このプロジェクトは、欧州連合(EU)のHorizon 2020研究・イノベーションプログラム(助成金契約第101017113なし)、Instituto de Salud Carlos III(PI20/00298)、Beca Carmen de Torres(Fundació Sant Joan de Déu)、Vanderbilt Medical Scholars Programから資金提供を受けています。ジョルディ・グリフォルス、マリア・デル・マル・アレバロ、フアン・リカルド・ゴンザレス、サラ・カプデビラ、ジョセップ・プイグ、ジェマ・クリスティーナ・モンテ・ルビなど、CMCiBのすべてのスタッフに感謝します。また、解剖図の協力をいただいたAbril Culell Camprubí氏とSergi Cesar Díaz博士にも特に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.5% セボフルオランZoetis20070289
2.5 mm 気管内チューブヘンリー・シャイン988-1782
3 末梢動脈アクセス用FrカテーテルProdimed3872.1
4 末梢静脈アクセス用FrカテーテルProdimed3872.13
6 フランス ECMO 小児動脈カニューレ メドトロニック 77206
8 フランス ECMO 小児静脈カニューレ メドトロニック 68112
アドレナリンB ブラウン469801-1119
アドソン鉗子Allgaier instruments08-030-130任意のブランドで代用できます
BP カフ ミンドレイ
・ブプレノルフィン (0.01 mg/kg)リヒター・ファーマ#9004114000537
グルコン酸カルシウム (2.25 mmol/10 mL)B ブラウン570-12606194-1119
デクスメデトミジン (0.5-2.0 & micro;オリオンファームGTN 064321000017253
Doletholvetoquinol#3605870004904
DopaminehikmaA044098010
フェンタニル (25-200 µg/kg/min)Kern Pharma756650.2H
新鮮ドナー豚血液O型Any 
熱交換器Maquet Gmbh &CoMCP70107.2130
ヘパリン (1350 UI)ROVI641641.1
Irwin retractorAesculapBV104R任意のブランドで代用可能
ケタミン (20 mg/kg)Richter Pharma#9004114000452
潤滑剤任意の口腔気管潤滑剤
ミダゾラム (0.3 mg/kg)Serra Pamies619627.4
蚊の鉗子AesculapBH109R任意のブランドを置き換えることができます
ニードル鉗子AesculapBM016R任意のブランドを置き換えることができます
ノーマル 生理食塩水 (0.9%)B ブラウン Fisiovet5/469827/0610任意のブランドを代用可能
チューブ用プラスチッククランプAchim Schulz-LauterbachDBGM任意のブランドを代用可能
塩化カリウム (9 mEq)B ブラウン3545156
プロポフォール (0.5 mg/kg)Zoetis579742.7
Quadrox 膜酸素供給器 Maquet Gmbh &CoBE-HMOSD 300000
直腸体温計Any
RotaFlow Console ECMO system Maquet Gmbh &CoMCP00703177新生児ECMOシステム
メスAesculapBB074R任意のブランドを代用できます
重炭酸ナトリウム (1 M)Fresenius Kabi634477.4 OH
外科用ハサミTalmed Inox112任意のブランドを代用できます
縫合糸 (3/0 poly absorbable)B Braun Novosyn (R)0068030N1任意のブランドを代用できます

参考文献

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