患者の突然変異シグネチャーを表すプラスミドDNAのエレクトロポレーションベースの送達を使用した in vivo での脳腫瘍のモデリング

サマリー

免疫療法試験には、一般的な患者の変異によって駆動される免疫能のある自家腫瘍モデルを前臨床試験に利用することが不可欠です。従ってこのプロトコルは共通の忍耐強い突然変異を表すプラスミッドDNAのelectroporationベースの配達を使用して脳腫瘍マウス モデルを発生させる方法を記述し、正確で、再生可能で、一貫したマウス モデルを提供する。

要約

腫瘍モデルは、より効果的な新しい治療法を探索するという点で、脳腫瘍の前臨床試験に不可欠です。免疫療法への関心が高まる中、脳内の腫瘍と免疫細胞の集団、およびそれらの治療に対する反応を調べるために、一貫性のある臨床的に適切な免疫適格なマウスモデルを持つことがさらに重要です。ほとんどの前臨床モデルでは、確立された腫瘍細胞株の同所性移植を利用していますが、ここで紹介するモデリングシステムでは、 in vivoで分裂する神経前駆細胞(NPC)に挿入されたDNAコンストラクトから、段階的かつ効果的に、患者固有の腫瘍変異を「個別化」して表現することができます。DNAコンストラクトは、デュアルリコンビナーゼ媒介カセット交換(MADR)法によるモザイク解析を特徴としており、ドライバー変異のシングルコピーの体細胞突然変異誘発を可能にします。生まれてから生後3日の間に生まれたばかりの仔マウスを用いて、側脳室を覆うこれらの分裂細胞を利用してNPCを標的にします。DNAプラスミド(MADR由来、トランスポゾン、CRISPR指向sgRNAなど)を脳室にマイクロインジェクションした後、頭部の吻側領域を囲むパドルを使用してエレクトロポレーションを行います。電気刺激を受けると、DNAは分裂細胞に取り込まれ、ゲノムに組み込まれる可能性があります。この方法の使用は、最も一般的な悪性脳腫瘍である神経膠芽腫を含む、小児および成人の両方の脳腫瘍の発症に成功しています。本稿では、若い仔マウスに麻酔をかける手順から、プラスミドミックスのマイクロインジェクション、それに続くエレクトロポレーションまで、この技術を用いて脳腫瘍モデルを開発するためのさまざまなステップについて説明し、実演します。この自生免疫正常マウスモデルにより、研究者は前臨床モデリングアプローチを拡張し、有効ながん治療の改善と検討に取り組むことができます。

概要

マウス脳腫瘍モデルは、脳腫瘍の形成と治療のメカニズムを理解する上で非常に重要です。現在のモデルには、通常、適切な免疫療法研究を妨げる免疫不全マウスを使用した、限られた数のドライバー変異または患者由来の異種移植モデルに基づいて、一般的に使用される腫瘍細胞株の皮下移植または同所性移植が含まれます^1,2,3,4。さらに、これらの前臨床結果は、そのようなモデルが治療に反応して劇的でしばしば治癒効果を示す可能性があるという点で、偽陽性につながる可能性がありますが、これはクリニックには変換されません^2,5,6,7。前臨床結果の妥当性を向上させるためには、患者の変異シグネチャーをより反映した遺伝子改変前臨床マウスモデルを迅速に作製する能力が不可欠です。

機能喪失(LOF)と機能獲得(GOF)の両方の変異を誘導するDNAプラスミドのエレクトロポレーション(EP)ベースの送達により、このようなモデルの生成が可能になります。私たちは、二重リコンビナーゼ媒介カセット交換によるモザイク解析(MADR⁸)と呼ばれるGOFドライバー変異をさらに正確に表現する方法を開発しました。この方法は、体細胞において、制御された遺伝子座特異的な方法で目的の遺伝子(または複数可)を発現することを可能にする⁸。クラスター型規則間隔短回文反復試験(CRISPR)などの他の分子ツールと組み合わせることで、異なる患者変異を組み合わせてマウス脳腫瘍モデルを開発することができます。この方法は、神経膠腫や上衣腫⁸などのさまざまな小児脳腫瘍や、神経膠芽腫(GBM)などの成人脳腫瘍モデルに使用されています。

腫瘍モデリングのEP法は移植ほど一般的ではありませんが、以下は、このモデリングシステムのこれまでの容易さと高い再現性を示しています。mTmGマウスは、MADRプラスミドDNA^の挿入に使用されます^8,9。このシステムにより、Rosa26遺伝子座に位置するloxPおよびFlpリコンビナーゼ標的(FRT)部位を組み換えて、ドナーDNAプラスミド(すなわち、目的のGOF遺伝子)を挿入することができます^8,9。以下のプロトコルは、入念な練習後のこの方法の単純さと、マウス脳腫瘍モデルを自生的で一貫した方法で開発する能力を示しています。

プロトコル

このプロトコルのすべての手順は、Cedars Sinai Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) によって承認されました。ホモ接合体mTmGマウスをC57BL/6Jマウスと交配し、以下のプロトコルで使用するために、混合性ヘテロ接合体mTmGマウスの同腹仔を得た。動物は市販の供給源から入手した(資料表参照)。マウスの仔は、出生後0日目から3日目(P0-P3)の間にエレクトロポレーションされました。

1.手術のセットアップ

1. 手術台に化学消毒剤(Vimobaなど)をスプレーして拭き取り、次に70%エタノールを拭き取り、もう一度拭き取ります。
2. プルドガラスキャピラリーピペット(ピペットの引っ張り方については参考文献¹⁰ を参照)、小さなハサミ、小さなバイオハザードシャープス廃棄物容器、マイクロリットルピペッターとピペットチップ、2xカットされた正方形のパラフィンフィルム、電極ゲル、電極、マイクロインジェクター用ホルダー、およびDNAプラスミドミックス( 材料表 および 補足ファイル1を参照)。
3. 指示されたら、手術台または床に次のアタッチメントを配置します:マイクロインジェクターコントロールパネル、ホルダー、および機械に取り付けられたプラグ、マイクロインジェクターホルダーを側面に保持するためのスタンド(はんだ付け補助具)、マイクロインジェクターフットペダル(床)、機械に取り付けられた電極、および電極フットペダル(床)( 材料表を参照)。
   注意: 電極フットペダルは、使用順序を思い出させるために、マイクロインジェクターフットペダルの右側に配置されました。
4. マイクロインジェクターと電極のコントロールパネルをオンにします。
   1. マイクロインジェクターの設定が実験に適していることを確認してください:プラスミド混合物の取り込み方法に応じて、圧力は220〜450 hPaでなければなりません。
   2. 電極パネルの設定が実験に合っているか確認してください。
      注:現在の実験(およびほとんどの脳腫瘍モデル)では、120 V(50 ms、950 ms間隔)の5つのパルスが使用されています。

2.術前の準備

1. マイクロインジェクターでプラスミドミックスを調製します。
   1. プルされたガラスキャピラリーピペットを1つ取り出し、マイクロインジェクターホルダーに挿入します。先端が所定の位置に保持されるようにねじ込まれていることを確認します。
   2. マイクロインジェクターホルダーを片手で持ち、小さなはさみをもう片方の手で持ちます。ピペットの先端を小さな鋭利なバイオハザード容器の上に置きます。はさみを閉じた状態で、長くしたガラスキャピラリーピペットを軽く押し下げます。開口部から約2mmの曲がりが見える場所でカットします。カットが成功したように見える場合は、慎重に横に置きます。
   3. 市販のプラスミドミックスチューブを手術台に平らに置き、開きます。ピペットチップボックスまたは別のアイテムをチューブの底の後ろに置いて、プラスミドミックスを吸い上げている間、チューブを安定させます。マイクロインジェクターラインに取り付けられたガラスピペットをテーブルの上に平らに置き、プラスミドミックスのチューブに静かに挿入し、チップがチューブの底付近でミックスにしっかりと収まっていることを確認します。
      注:自然な重力吸引により、プラスミドミックスの吸引はガラスピペットで開始され、その後積極的に吸引されます。
   4. ガラスピペットの先端をプラスミドミックスに入れた状態で、マイクロインジェクターパネルを使用して吸い込まれる量を増やします。0から始めて、右ノブを回し、マイナスの方向に-60にダイヤルすると、プラスミドミックスがガラスピペットに入ります。プラスミドミックスは~1インチのみ持ち込んでください。ノブを0に戻し、ピペットチップをミックスから取り外します。
      注意:負の方向にある間は、ミックスがマイクロインジェクターに放出され、場合によってはチューブに放出されるため、ピペットチップをミックスから取り外さないでください。
   5. 1本のパラフィンフィルムに混合物を注入して、1回の注入で混合液の量をテストします。フットペダルを踏んで1回押し、パラフィンフィルムにミックスを注入します。1 μLに設定したピペッターを使用して、パラフィンフィルム上の混合物を取り上げ、正確に1 μLであるかどうかを確認します。
      注意: 1μLよりわずかに小さい場合は、マイクロインジェクターの圧力を上げることができます。圧力が450 hPaに近づいても1 μL未満の場合は、ガラスピペットの開口部が小さすぎるため、さらにトリミングする必要があります。トリミングする前に、プラスミドミックスをチューブに戻すことをお勧めします。それにもかかわらず、はさみにはまだ残留混合物があるため、後でDNaseではさみを完全に洗浄して、残っている混合物を取り除くことが不可欠です。注入が 1 μL を超える場合は、新しいプルドガラスピペットを使用してトリミングする必要があります。試験量がちょうど1μLの場合、ガラスピペットチップは適切なサイズになります。
   6. ステップ2.1.4を繰り返して、手順のために追加のプラスミドミックス、またはプルされたガラスピペットに約2〜3インチ引き込みます。混合物がマイクロインジェクターの奥深くまで入り込みすぎて、端が見えないようにしてください。
      注:プラスミドミックスを吸い込むときは、気泡を避けることが重要です。気泡が存在する場合は、プルしたガラスピペットからプラスミドミックスを取り出し、最初からやり直すことで、このステップをやり直す必要があります。存在する気泡は、子犬の心室に注射するときの次のステップに有害です。
   7. プラスミドミックスをプルグラスピペットに用意した状態で、準備したピペットをはんだ付け補助スタンドの横に置き、誤って触れたりぶつけたりしないように邪魔にならないようにします。
2. 実験のために動物を準備します。
   1. 子犬に麻酔をかけるためのアイスペールを用意します。アイスペールに水を加えて溶かし、麻酔ホルダー(ピペットボックスの上部など)を冷やします。
   2. 箱の上部を溶かした氷の上に置いて冷まします。
   3. ケージから子犬を慎重に取り出し、氷の上に残っている冷却されたボックストップに入れます。冷却プロセスを助けるために、別の上部を下部の上にゆるく置きます。
   4. 2〜3分後、子犬を確認します。うつ伏せの姿勢のまま、子犬を互いに分離します。
      注:子犬は身をよじりますが、冷たい麻酔が始まると遅くなります。ボックスの上部は、子犬を見やすいように外しておくことができます。
   5. 適切な麻酔を確認するには、子犬の尻尾をつまんで反応を探します。反応がある場合は、手順2.2.4を繰り返します。鳴き声や少しの動きがない場合、子犬は手順の準備ができています。
      注:マウスは、処置後の回復能力に影響を与えるため、長時間氷上に置いておくべきではありません。麻酔下で注射とエレクトロポレーションの両方を行うことができる子犬の数だけを一度に氷上に置かなければなりません。経験を積めば、より多くのことができる。

3. 脳室へのDNAプラスミドミックスのマイクロインジェクション

1. 腹側の位置でテーブルの上に子犬を置きます。
2. 後頭部を少し後ろに引いて、頭蓋骨の縫合糸が皮膚を通して見えるようにします。頭蓋骨のラムダを見つけます。心室/注射部位は、ラムダと眼の中間になります。
   注:ラムダは、矢状縫合糸とラムドイド縫合糸が交差する場所です。マウスの頭蓋骨のラムダの同定については参考文献¹¹ を参照のこと。
3. ガラス製ピペットチップで皮膚を垂直な角度で刺します(ピペットは天井に向かってまっすぐ上にあります)。頭蓋骨を押すと、わずかな凹面のくぼみと最初の抵抗が観察されます。穿孔され、ガラスピペットの先端が凹面のくぼみを突き抜けると、適切な注入レベルに達します。
4. ガラス製ピペットチップを所定の位置に保持し、マイクロインジェクターのフットペダルを1回踏んで、プラスミドミックス1 μLを注入します。
   注:注入が成功したことを明確に確認するには、2つの方法があります。まず、プラスミドミックスが注入されるときにガラスピペットで下がるのを別のラボメンバーに見てもらいます。また、プラスミドミックスにファストグリーンまたは別の色素を使用する場合、色素は注射されると皮膚下の心室に目に見えて広がり、手術用ランプにかざすと簡単に見えます。

4. エレクトロポレーション

1. パラフィンフィルム(1つの正方形)をテーブルに置き、フィルムの上にある電極ゲルを絞り出します。各パドルにたっぷりとブラシをかけて、電極パドルを電極ゲルで覆います。滴り落ちている余分なジェルは、ペーパータオルで拭き取ることができます。
   注意: 最初のEPの後、各パドルのゲルが反対側に触れないようにしてください。これにより電荷が移動し、子犬の頭に塗布すると、焼けるような音が聞こえる場合があります。これは、ある電極からの子犬の頭のゲルが別の電極からのゲルと接触した場合にも発生します。
   注意: エレクトロポレーション中は、指をパドルから遠ざけるように注意する必要があります。
2. 子犬の体を片手(通常は利き手ではない手)で持ち、指を頭の後ろにしっかりと保ちます。
   注意: 右利きの場合は、左手で子犬を持ち、右手で電極を持つのが最も簡単です。左利きの場合は、その逆を行います。
3. 心室が標的とされている頭の外側に正極があるように、電極を子犬の頭に近づけて、適切な位置にあることを確認します(たとえば、左心室を標的にする場合は、プラスを子犬の左側に、マイナスを子犬の右側に配置します)。電極を配置する際に、頭部の後方にある体/首の背側で指(通常は親指)をそっとスライドさせて、頭を所定の位置に持ち上げます。
4. 尻尾をつまんで麻酔の深さを確認し、子犬が適切な麻酔面にある場合にのみエレクトロポレーションを進めます。マウスの頭の吻側部分にある電極パドルを軽く握り、目の上に置います。電極フットペダルを1回踏むと、エレクトロポレーションが開始されます。このプロトコルは、120 V(50 ms、950 ms間隔)の5つのパルスを使用します。各パルスが聞こえます。
   1. 各パルスで、電極パドルを反時計回りにわずかに回転させて、正のパドルがヘッドの上部に向かって移動するようにします。
      注:適切なエレクトロポレーションを行うと、マウスの子犬の体が脈拍ごとにけいれんするのを感じたり見たりします。
5. 最後のパルスの後、パドルを取り外して横に置きます。子犬を清潔なペーパータオルに移し、別のラボメンバーに子犬の頭からジェルをきれいにしてもらい、ペーパータオル「ボート」のヒートランプの下に置きます。
   注意: ヒートランプが子犬に近すぎないことを確認してください。このステップは必ず別のラボメンバーに手伝ってもらい、子犬を常に見守ってください。多くの場合、子犬の熱を上げるために、ヒートランプの下で子犬を手に持つと役立ちます。子犬の腹部を優しくマッサージすることも回復に役立ちます。
6. 子犬の体が健康なピンクがかった色になり、軽い尻尾のつまみにきしむような反応を示したら、子犬をホームケージに戻します。
   注意: ケージに戻す前に、家庭用ケージの寝具材料を少量取り、ケージの香りのために子犬を軽くブラッシングします。子犬を寝具の下のケージに戻し、飼育室に戻ります。

5.術後の手順

1. 未使用のプラスミドミックスをマイクロインジェクターガラスピペットからチューブに戻します。十分な混合物が残っている場合は、将来の手順で使用できます。-20°Cで保管してください。
2. 電極パドルからゲルをペーパータオルで拭き取ります。
3. すべての機器部品を元の場所に戻します。
   注:プラスミドミックスを吸収 した後 、ハサミを使用してガラスピペットチップを切断した場合は、ハサミを放置してDNase溶液で完全に洗浄してください。
4. テーブルに化学消毒剤をスプレーしてから拭き取り、続いて70%エタノールをスプレーして、もう一度拭き取ります。

結果

上記のプロトコルは、小児および成人の脳腫瘍マウスモデルの開発に成功裏に使用されており、前者はKim et ^al.8で詳細に発表されています。適切な技術とプラスミド設計の慎重な計画により、腫瘍のEP発生の成功は通常100%です。組織学は、レポータータンパク質を使用した場合にDNAプラスミドの挿入が成功したかどうかを確認するための最も迅速で簡単な方法です。このプロトコルには、組織学的分析によって確認されたように、100%浸透度のGBM脳腫瘍モデルを開発する方法に関する手順が含まれます。MADRドナープラスミドは、レポータータンパク質(smTagBFP2-V5)とSpCas9(補足ファイル1)の両方を発現していました。Nf1およびTrp53に向けられた2つの強力なドライバーLOF腫瘍抑制遺伝子シングルガイドRNA(sgRNA)も含まれました(sgRNAクローニング戦略については参考文献¹² を参照;このプロトコルで使用されるオリゴヌクレオチド配列については 補足ファイル1 を参照)...

ディスカッション

プラスミドDNAのエレクトロポレーションベースの送達は、遺伝子改変マウスモデルで使用されるものと同様の分子生物学のin vivo使用を可能にしますが、ウイルス形質導入の速度、局在化、および効率を備えています8,13,14。しかし、後者には、免疫反応だけでなく、安全性の懸念も伴います。プラスミドDNAのEP送達を用いたモデリングシステムにおいて、ガラスキャピラリーピペットを脳室に最初に挿入することで免疫応答が最小限になること^{を示しました8。}したがって、免疫療法のための現在の腫瘍モデリングシステムを改善するために、上記のプロトコルは、脳腫瘍のより便利で堅牢な前臨床モデリングシステムを可能にします。

この方法を用いた脳腫瘍モデリングを成功させるための最初の重要なステップは、プラスミドの設計です。このプロトコルには記載されていませんが、小児...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.1-2.5 µL 1チャンネルピペット	Eppendorf	3123000012
2 µLピペットチップ	フィッシャーサイエンティフィック	02-707-442
20 & マイクロ;Lピペットチップ	フィッシャーサイエンティフィック	02-707-432
2-20 & マイクロ;L 1チャンネルピペット	エッペンドルフ	3123000098
DNAZap PCR DNA分解ソリューション	フィッシャーサイエンティフィック	AM9890
ECM 830 スクエアポレーター エレクトロポレーター	BTX	45-0662
電極ゲル	Parker Labs	PLI152CSZ
ファストグリーン染料	Sigma-Aldrich	F7258-25G
ヘルピングハンズ はんだ付け補助	Pro'sKit	900-015
マイクロ解剖はさみ、4.5 "ストレートシャープ	ロボ	RS-5916
マウス系統:C57BL / 6J	クソン研究所	JAX:000664
マウス系統:Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato、-EGFP)Luo / J	ジャクソン研究所	JAX: 007676
Parafilm	Grainger	16Y894
プラスミド: pCag-FlpO-2A-Cre EV	Addgene	129419
Platinum Tweezertrode、直径 7 mm	BTX	45-0488
シャープス容器、1 クォート	Uline	S-15307
標準ガラス キャピラリー、4 インチ、外径 1 mm、内径 0.58 mm	World Precision Instruments	1B100F-4	キャピラリー ピペットを引っ張る必要があります - 詳細については、参考文献 10 を参照してください。
縦型マイクロピペットプーラー	サッター器具	P-30	熱設定: 880 で Heat #1、680 で Heat #2、800 で引っ張る。引っ張りの詳細については、参考文献10を参照してください。
Vimoba タブレットソリューション	Quip Laboratories	VIMTAB
XenoWorks デジタルマイクロインジェクター	サッター機器	BRE
XenoWorks マイクロピペットホルダー	サッター機器	BR-MH