患者の突然変異シグネチャーを表すプラスミドDNAのエレクトロポレーションベースの送達を使用した in vivo での脳腫瘍のモデリング

Katie B. Grausam; Joshua J. Breunig

doi:10.3791/65286

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方法論記事

患者の突然変異シグネチャーを表すプラスミドDNAのエレクトロポレーションベースの送達を使用した in vivo での脳腫瘍のモデリング

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DOI:

10.3791/65286

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2023年6月23日

Katie B. Grausam^*¹ , Joshua J. Breunig^*¹^,²^,³^,⁴^,⁵

¹Board of Governor’s Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, ²Center for Neural Sciences in Medicine, Cedars-Sinai Medical Center, ³Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, ⁴Samuel Oschin Comprehensive Cancer Institute, Cedars-Sinai Medical Center, ⁵Department of Medicine, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

^* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

免疫療法試験には、一般的な患者の変異によって駆動される免疫能のある自家腫瘍モデルを前臨床試験に利用することが不可欠です。従ってこのプロトコルは共通の忍耐強い突然変異を表すプラスミッドDNAのelectroporationベースの配達を使用して脳腫瘍マウスモデルを発生させる方法を記述し、正確で、再生可能で、一貫したマウスモデルを提供する。

要約

腫瘍モデルは、より効果的な新しい治療法を探索するという点で、脳腫瘍の前臨床試験に不可欠です。免疫療法への関心が高まる中、脳内の腫瘍と免疫細胞の集団、およびそれらの治療に対する反応を調べるために、一貫性のある臨床的に適切な免疫適格なマウスモデルを持つことがさらに重要です。ほとんどの前臨床モデルでは、確立された腫瘍細胞株の同所性移植を利用していますが、ここで紹介するモデリングシステムでは、 in vivoで分裂する神経前駆細胞(NPC)に挿入されたDNAコンストラクトから、段階的かつ効果的に、患者固有の腫瘍変異を「個別化」して表現することができます。DNAコンストラクトは、デュアルリコンビナーゼ媒介カセット交換(MADR)法によるモザイク解析を特徴としており、ドライバー変異のシングルコピーの体細胞突然変異誘発を可能にします。生まれてから生後3日の間に生まれたばかりの仔マウスを用いて、側脳室を覆うこれらの分裂細胞を利用してNPCを標的にします。DNAプラスミド(MADR由来、トランスポゾン、CRISPR指向sgRNAなど)を脳室にマイクロインジェクションした後、頭部の吻側領域を囲むパドルを使用してエレクトロポレーションを行います。電気刺激を受けると、DNAは分裂細胞に取り込まれ、ゲノムに組み込まれる可能性があります。この方法の使用は、最も一般的な悪性脳腫瘍である神経膠芽腫を含む、小児および成人の両方の脳腫瘍の発症に成功しています。本稿では、若い仔マウスに麻酔をかける手順から、プラスミドミックスのマイクロインジェクション、それに続くエレクトロポレーションまで、この技術を用いて脳腫瘍モデルを開発するためのさまざまなステップについて説明し、実演します。この自生免疫正常マウスモデルにより、研究者は前臨床モデリングアプローチを拡張し、有効ながん治療の改善と検討に取り組むことができます。

概要

マウス脳腫瘍モデルは、脳腫瘍の形成と治療のメカニズムを理解する上で非常に重要です。現在のモデルには、通常、適切な免疫療法研究を妨げる免疫不全マウスを使用した、限られた数のドライバー変異または患者由来の異種移植モデルに基づいて、一般的に使用される腫瘍細胞株の皮下移植または同所性移植が含まれます^1,2,3,4。さらに、これらの前臨床結果は、そのようなモデルが治療に反応して劇的でしばしば治癒効果を示す可能性があるという点で、偽陽性につながる可能性がありますが、これはクリニックには変換されません^2,5,6,7。前臨床結果の妥当性を向上させるためには、患者の変異シグネチャーをより反映した遺伝子改変前臨床マウスモデルを迅速に作製する能力が不可欠です。

機能喪失(LOF)と機能獲得(GOF)の両方の変異を誘導するDNAプラスミドのエレクトロポレーション(EP)ベースの送達により、この....