ここでは、細胞核の調製を説明するプロトコルを提示します。心臓組織のマイクロ解剖および酵素的解離の後、前駆細胞を凍結し、続いて純粋な生細胞を単離し、単一核RNAシーケンシングおよびハイスループットシーケンシング分析によるトランスポゼーゼアクセス可能なクロマチンの単一核アッセイに使用しました。
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この記事について
サマリー
要約
発達中の心臓は、複雑な調節機構によって制御される様々な前駆細胞を含む複雑な構造である。個々の細胞の遺伝子発現とクロマチン状態の検査は、細胞の種類と状態の識別を可能にします。シングルセルシーケンシングアプローチは、心臓前駆細胞の不均一性の多くの重要な特性を明らかにしました。ただし、これらの方法は一般に新鮮な組織に限定されており、技術的なばらつきを減らすために新鮮な組織を同じ実行で一度に処理する必要があるため、多様な実験条件での研究が制限されます。したがって、この分野では、一核RNAシーケンシング(snRNA-seq)や、ハイスループットシーケンシングを備えたトランスポザーゼアクセス可能なクロマチンの一核アッセイ(snATAC-seq)などの方法からデータを生成するための簡単で柔軟な手順が必要です。ここでは、後続の単一核デュアルオミクス(snRNA-seqとsnATAC-seqの組み合わせ)のために核を迅速に分離するためのプロトコルを紹介します。この方法は、心臓前駆細胞の凍結サンプルからの核の単離を可能にし、マイクロ流体チャンバーを使用するプラットフォームと組み合わせることができます。
概要
先天性欠損症の中で、先天性心疾患(CHD)が最も一般的であり、毎年出生の約1%で発生します1,2。遺伝子変異は少数の症例でしか特定されておらず、遺伝子調節の異常などの他の原因がCHD 2,3の病因に関与していることを意味します。心臓の発生は、多様で相互作用する細胞型の複雑なプロセスであり、原因となる非コード変異と遺伝子制御への影響を特定することは困難です。心臓の器官形成は、心筋細胞、線維芽細胞、心外膜細胞、心内膜細胞など、さまざまなサブタイプの心臓細胞を生じさせる細胞前駆細胞から始まります4,5。シングルセルゲノミクスは、心臓の発達を研究し、健康と病気における細胞の不均一性の影響を評価するための重要な方法として浮上しています6。異なるパラメータの同時測定のためのマルチオミクス法の開発と計算パイプラインの拡大により、正常および病気の心臓における細胞タイプとサブタイプの発見が容易になりました6。本稿では、マウス胚から得られた凍結心臓前駆細胞について、下流のsnRNA-seqおよびsnATAC-....
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プロトコル
この研究で採用された動物の手順は、エクスマルセイユ大学の動物倫理委員会(C2EA-14)によって承認され、指定された動物実験のための国家倫理委員会によって承認されたプロトコルに従って実施されました。認可アパフィスN°33927-2021111715507212)。
1.解剖前の時限交配の設定
- マウス胚を作製するには、心臓領域単離の9.5日前に成体マウス間で時限交配を行う。この手順では、生後2〜6か月の野生型C57BL/6Jマウスを使用し、一晩で時限交配を行いました。
- 翌朝、雌のマウスに膣栓があるかどうかを確認します。プラグが胎児の日(E)0.5として識別された日を考えてみましょう。
2.組織調製と細胞分離
- 妊娠後9.5日目に生後2〜6か月の妊娠中の女性C57BL / 6JをCO2を介して安楽死させ、濃度を上げてから子宮頸部脱臼を行います。腹部の下部を70%エタノールできれいにします。
注:子宮頸部脱臼の前に麻酔薬を使用することは、その後のトランスクリプトームおよびエピゲノム研究に影響を与える可能性のある環境変化に胚をさらすため、推奨されません。 - 腹部と腹膜をハサミで開きます。子宮角を視覚化し、鉗子を使用して両方の角を切....
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結果
シングルセルアプローチ用のシングルセル懸濁液の調製と比較して、単一核懸濁液の調製ははるかに困難であり、より高いレベルの分離と処理が必要です。snRNA-seqとsnATAC-seqの結合を成功させるための重要な要素は、クリーンで無傷の核懸濁液です。効率的な核分離のためのプロトコルは、各組織の種類と状態(新鮮または凍結)に適合させる必要があります。ここでは、凍結マウス胚性心臓細胞からの核の単離のために最適化されたプロトコルが記載されている。胚性心臓領域の解離と心臓細胞の解離から核の分離までのすべてのステップを 図1にまとめます。出発物質については、効率的な核単離のために、1 x 105-1 x 106 細胞の細胞数と細胞生存率>70%が推奨されます。 図2に示すように、融解後に死細胞を選別して除去するためにこのプロトコルで実行される追加のステップにより、有意に高い細胞生存率を有するよりクリーンな細胞懸濁液を得ることができ、出発サンプルの品質が向上しました。核の分離に加えて.......
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ディスカッション
snRNA-seqとsnATAC-seqを組み合わせた研究による発達中の心臓の細胞組成の分析は、先天性心疾患の起源のより深い理解を提供します26。いくつかの研究所は、snRNA-seq27に対する心臓組織の凍結保存の効果を研究しています。ヒト疾患のマウスモデルから得られた新鮮な微小解剖組織を用いてsnRNA-seqおよびsnATAC-seqを実施することは、異なる実験条件を比較する際にロジスティック的に困難な場合があります。開発の特定の段階では、サンプル処理によってもたらされる技術的なばらつきを減らすために、対照群と実験群を同じ実行で処理する必要があることが困難の1つです。新鮮な組織の処理が不可能な場合は、結果に基づいて、胚の心臓組織全体を急速凍結するのではなく、解離させてから凍結保存することをお勧めします。一方の方法を他方よりも選択することは、心臓組織が丸ごと凍結している場合、融解後に生存可能な単一細胞を単離することがはるかに困難であるという事実に基づいています。ただし、組織解離プロトコルが最適化されていない場合は、組織全体をスナップフリー.......
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開示事項
著者は開示するものは何もありません。
謝辞
本研究は、ERA-CVD-2019およびANR-JCJC-2020からSSの支援を受けて行われました。貴重なコメントを提供してくれたU 1251 /Marseille Medical Geneticsラボのゲノミクスおよびバイオインフォマティクスファシリティ(GBiM)と匿名のレビューアに感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 2100 バイオアナライザー 機器 | アジレント | カタログ番号なし | |
| 5M 塩化ナトリウム (NaCl) | Sigma | 59222C-500ML | |
| BSAの10% | Sigma | A1595-50ML | |
| Chromium Next GEM Chip J シングルセルキット、16 rxns | 10X Genomics | 1000230 | |
| Chromium Next GEM シングルセルマルチオーム ATAC + 遺伝子発現試薬バンドル、4 rxns (Nuclei Buffer 20Xを含む) | 10X Genomics | 1000285 | |
| Countess cell counting chamber slides | Invitrogen | C10283 | |
| Countess III FL | Thermofisher | カタログ番号なし | |
| ジギトニン (5%) | サーモフィッシャー | BN2006 | |
| DMSO | Sigma | D2650-5x5ML | |
| DNA LoBind チューブ | Eppendorf | 22431021 | |
| D-PBS | Thermofisher | 14190094 | 滅菌済みでRNaseフリー |
| のデュアルインデックスキット TT Set A 96 rxns | 10X Genomics | 1000215 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | フィッシャーサイエンティフィック | ||
| Falcon 50 mL コニカル遠心チューブ | フィッシャーサイエンティフィック | ||
| HI-FBS | サーモフィッシャー | A3840001 | 熱不活性化 |
| 高感度 DNA キット | Agilent | 5067-4626 | |
| Igepal CA-630 | Sigma | I8896-50ML | |
| LIVE/DEAD 生存能力/細胞毒性キット | サーモフィッシャー | L3224 | |
| MACS 死細胞除去キット: 死細胞ロモバル MicroBeads, Binding Buffer 20X | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| MACS SmartStrainers(30 & マイクロ;m) | Miltenyi Biotec | 130-098-458 | |
| マグネシウム(MgCl2) | Sigma | M1028-100ML | |
| Milieu McCoy 5A | サーモフィッシャー | 16600082 | |
| MS カラム | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| NovaSeq 6000 S2 | Illumina | カタログ番号なし | |
| ペニシリン ストレプトマイシン (ペン/連鎖球菌) | サーモフィッシャー | 15070063 | |
| PluriStrainer Mini 40µm | PluriSelect | V-PM15-2021-12 | |
| 岩石阻害剤 | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | |
| シングルインデックスキット N Set A, 96 rxn | 10X Genomics | 1000212 | |
| Standard 90mm Petri dish Sterilin | Thermofisher | 101R20 | |
| 滅菌二重蒸留水 | Thermofisher | R0582 | |
| Trizma Hydrochlorideソリューション(HCl) | Sigma | T2194-100ML | |
| トリパンブルーステイン(0.4%) | Invitrogen | T10282 | |
| プシン0.05% - EDTA 1X | サーモフィッシャー | 25300054 | |
| Tween20 | シグマ | P9416-50ML | |
| ワイドオリフィスフィルター付きピペットチップ200 μl | Labcon | 1152-965-008-9 | |
| ZEISS SteREO Discovery.V8 | ZEISS | カタログ番号なし |
参考文献
- vander Bom, T., et al. The changing epidemiology of congenital heart disease. Nature Reviews. Cardiology. 8 (1), 50-60 (2011).
- Bouma, B. J., Mulder, B. J. Changing landscape of congenital heart disease. Circulation Research. 120 (6), 908-922 (2017).
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