方法論記事

アイソフォーム特異的レチノイン酸受容体による生きた神経細胞ミトコンドリアの恒常性調節の最適化された自動解析(英語)

DOI：

10.3791/65452

⸱

2023年7月28日

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1Neuroscience and Signalling Laboratory, Institute of Biomedicine (iBiMED), Department of Medical Sciences, University of Aveiro

この記事について

サマリー

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ミトコンドリアネットワークは非常に複雑で、解析が非常に困難です。新しいMATLABツールは、タイムラプス画像でライブ共焦点画像化されたミトコンドリアを解析しますが、出力量が大きく、個別の手動操作が必要です。この問題に対処するために、ルーチン最適化が開発され、迅速なファイル分析が可能になりました。

要約

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ミトコンドリアネットワークが複雑なため、生細胞のセグメント化、追跡、解析が非常に困難です。MATLAB ツールを使用すると、タイムラプス ファイル内のミトコンドリアを解析できるため、画像処理のプロセスが大幅に簡素化され、高速化されます。それにもかかわらず、既存のツールは大量の出力を生成するため、個々の手作業による注意が必要であり、基本的な実験セットアップでは数千のファイルが出力され、それぞれが広範で時間のかかる処理を必要とします。

これらの問題に対処するために、MATLAB コードとライブ スクリプト形式の両方でルーチン最適化が開発され、迅速なファイル解析が可能になり、ドキュメントの読み取りとデータ処理が大幅に削減されました。100ファイル/分の速度で、最適化により全体的に迅速な分析が可能になります。最適化では、個々のミトコンドリアのフレーム固有のデータを時間枠全体で平均化し、既存のツールからの出力と一致する定義された方法でデータを分析することにより、結果出力を達成します。色素テトラメチルローダミンメチルエステルを使用してライブ共焦点イメージングを行い、神経細胞をレチノイン酸受容体(RAR)アゴニストで処理することにより、ルーチンの最適化を検証しました。結果は文献と一致しており、アイソフォーム特異的RAR調節に応答するミトコンドリアネットワークの挙動をさらに特徴付けることができました。

この新しい方法論により、ニューロン全体のミトコンドリアネットワークの迅速で検証済みの特性評価が可能になりましたが、神経科学分野に適用するために不可欠な機能である軸索と細胞体ミトコンドリアの分化も可能になりました。また、速効性治療を用いた実験にも適用でき、治療前後で同じ細胞のイメージングが可能で、神経科学の分野を超越しています。

概要

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細胞ミトコンドリアはあらゆる生理状態の中心に位置しており、がんやアルツハイマー病など幅広い疾患の薬理学的治療法を特定するためには、ミトコンドリアの恒常性(ミトスタシス)と挙動を完全に理解することが最も重要です1,2。

ミトコンドリアは、エネルギー恒常性、ATP生成、カルシウム緩衝、ROS調節において重要な細胞の役割を担っており、分子シャペロンはエネルギー依存性であるため、タンパク質の恒常性を維持するためには有糸分裂が不可欠です3。これらには、細胞のニーズを効率的に満たすために、一定かつ動的なネットワークの変調と適応が必要であり、ミトコンドリアの輸送はさまざまなシグナル伝達経路によって制御されています。以前の研究では、そのような経路の1つであるレチノイン酸受容体(RAR)4,5が説明されています。レチノイン酸(RA)は、RAR活性化を介して軸索および神経突起の成長を促進します。マウスの初代皮質ニューロンでは、RAR-βの活性化により、神経突起におけるミトコンドリアの成長、速度、および可動性が促進される6。

ミトコンドリアネットワークの適応性と動態を考慮すると、エネルギー恒常性を調べるだけでなく、プロテオスタシス、細胞の健康、増殖、シグナル伝達を調べるためにも、有糸分裂を「リアルタイム」で評価する可能性が不可欠です。有糸分裂を評価するために一般的に使用される方法は、蛍光色素またはマーカーを使用してミトコンドリアを強調した後の共焦点顕微鏡検査、および温度および/またはCO2調節を可能にする特定の顕微鏡検査セットアップに依存しています7。このタイプの実験セットアップでは、一度に1つの実験の複製を実行する必要があります。さまざまな処理の実験の繰り返しに加えて、ほとんどの実験では、一連の焦点面(zスタック)を一連の時点で記録して、技術的な複製(プレートごとに複数の位置を画像化)を行う必要があることを考慮する必要があります。したがって、1 つのコントロールと 2 つの処理を 3 回繰り返し、プレートごとに 5 つのイメージング位置、15 のタイムポイントを使用する実験計画では、225 スタックが処理されます。古典的には、生きたミトコンドリアのビデオは、キモグラフをプロットして分析され、個別に分析される8が、コンピュータツールに頼る場合でも、大量の手入力を必要とする時間のかかるプロセスであった。

最近、生細胞の2Dおよび3Dタイムラプスファイルにおけるミトコンドリアの自動セグメンテーションと追跡を可能にするアルゴリズムが 記述されました9。他の定量化手法も利用可能であり、すべてに限界があります10。自動化されたオープンソースアプリケーションであるMitometerは、タイムラプスやミトコンドリアダイナミクス分析に特に適しています。このアプリケーションには、他の既存のMATLABベースのツールに比べて、最大13の異なるパラメータを使用して個々のTIFスタックを自動処理できるという一連の利点があり、核周辺ミトコンドリアと遠隔核ミトコンドリアを区別するため、神経科学にとって特に興味深いものです。

ただし、上記のような実験では、これら 13 個のパラメーターを 225 個のスタックに適用すると、2,925 個の個別の出力ファイルが作成されます。これらには4つの個別のコンピューター入力が必要であり、すべての出力ファイルをダウンロードするには合計で10,000を超える手動入力が必要です。大規模な実験計画では、各ファイルの解析とデータ統合に不必要に非常に時間がかかります。ここでは、迅速なファイル分析を可能にし、ドキュメントの読み取りとデータ処理を大幅に削減し、既存のツールからの出力と一貫性のある定義された方法でデータを分析できるルーチン最適化を紹介します。

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プロトコル

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注:このプロトコルには、細胞培養とライブ共焦点顕微鏡検査で生きたミトコンドリア(図1)の画像を得るウェットラボステップと、得られた画像(図2)を分析するインシリコステップの2つの主要なステップがあります。3Dライブ画像化されたミトコンドリアの自動データ解析には、Lefebvreらが提供するMATLABアプリケーションMitometerを使用しました9。ルーチン最適化は MATLAB で記述されます。ソフトウェア、更新バージョン、および処理 ImageJ マクロは、https://github.com/JoseJoaoMV/Routine_Optimization_Mitometer_APP_MATLAB の GitHub からオンラインで無料で入手できます。

1. ライブ顕微鏡

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図1:実験プロトコル。SH-SY5Y細胞を分化させ、レチノイドで処理した。 (A)TMRMを用いて、共焦点顕微鏡を用いて処理細胞内の健康なミトコンドリアをライブイメージングし、5視野のタイムラプスZスタックを撮影した。(B)マイトメーターアプリケーション MATLAB は、ミトコンドリア画像を自動的にセグメント化して解析します。このソフトウェアは、分析に加えて、核の近接性に応じてミトコンドリアを自動的に識別します。青い点はミトコンドリアの初期位置です。赤い点は最終位置です。スケールバー = 30 μm。略語:TMRM =テトラメチルローダミン、メチルエステル。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

  1. 細胞培養
    1. SH-SY5Y細胞を5%CO2 および95%空気の加湿雰囲気中で37°Cでインキュベートし、MEM(Minimal Essential Medium)およびF12(Ham's F12 Nutrient Mix)培地を等量ずつ培養し、10%ウシ胎児血清(FBS)を添加します。
    2. SH-SY5Y細胞をガラス底の細胞皿に15×104 細胞/mLの密度で播種します。
    3. 1% FBS含有培地中で10 μMの オールトランス レチノイン酸で5日間処理し、続いて10 ƞg/mLの脳由来神経栄養因子(BDNF)で2日間処理して細胞を分化させます。
  2. 細胞処理
    1. 細胞を滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、10-7


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結果

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.txtフォーマットの出力ファイルの分析を強化および高速化するために、マイトメータ.txt出力ファイルと一致するデータを読み取るルーチン最適化がコード化され、列はフレームを表し、線は識別されたミトコンドリアを表します。ルーチン最適化では、識別された各ミトコンドリアのフレームを平均化し、視野ごとにすべてのミトコンドリアの結果を平均化することにより、パラメーターごとに単一の値でデータを生成します。開発されたルーチンは、1 から番号が付けられたフォルダーからファイルを読み取ります。ライブ スクリプト ルーチンの最適化は、1 つのスプレッドシート ファイルを表形式で出力します。この出力では、列は分析されたパラメータを表します(例:「 長軸の長さ」;"Intensity")と線は分析変数の視野を表します(例 :「コントロール」)。

以前に発表された結果では、RARβ 活性化後に初代ニューロン培養の細胞体内のミトコンドリア膜電位が低下し、軸索ミトコンドリアの動きが増加することが説明されています6

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ディスカッション

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生細胞イメージングでは、本格的なコンピューティング処理を必要とする大きなファイルが生成されますが、最新のツールでさえ、処理に大量の手動入力が必要です。このルーチン最適化は、マイトメーターでのミトコンドリア分析のプロセスを簡素化することに重点を置いていますが、これは、このツールがユーザー入力とデータ出力のバランスが非常に良いためです。ミトコンドリア画像解析のためのさまざまなツール間の包括的な比較は、以前にレビューされています10。他のパイプラインは、ミトコンドリアネットワークとクラスター質量の解析、または膜電位変動の解析に重点を置いていますが、ここで紹介するこの新しい方法論は、全細胞ミトコンドリアネットワークの迅速かつ検証済みの特性評価を可能にし、神経科学分野に適用するために不可欠な機能である軸索と細胞体ミトコンドリアの区別も可能にします。

MATLAB アプリケーションマイトメーター9 は、画像系列のミトコンドリアを解析します: 拡散背景は、系列のすべての時間枠と z 平面から減算され、...

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開示事項

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著者は、宣言すべき利益相反を持っていません。

謝辞

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画像取得は、PPBI(Portuguese Platform of BioImaging)のノードであるiBiMEDのLiM施設で行われました:POCI-01-0145-FEDER-022122。この研究は、FCT (EXPL/BTM-SAL/0902/2021) LCF (CI21-00276)、Fundação para a Ciência e Tecnologia of the Ministério da Educação e Ciência (2020.02006.CEECIND) からの DT への助成金、ATG-The Gabba Alumni Association から VP への助成金、およびアヴェイロ大学生物医学研究所 (Institute for Biomedicine-iBiMED) の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
AM580シグマ・アルドリッチA8843
BDNF サーモフィッシャーRP8642
BMS493トクリス・バイオサイエンス 3409
CD2314トクリス・バイオサイエンス3824
Ch55トクリス・バイオサイエンス 2020
Foetal Bovine SerumThermo-Fisher10270106
GraphPad Prism v4.0GraphPad Software, La Jollan/a
Ham's F12 Nutrient MixThermo-Fisher21765029
MATLAB R2022a MathWorksn/a
Minimal EssentialMedium Thermo-Fisher31095
Nunc Glass Bottom DishesThermo-Fisher150680
Phosphate Buffer 生理食塩水Thermo-Fisher28372
レチノイン酸Sigma-Aldrich R2625
TMRM サーモフィッシャーT668
ツァイス LSM 510カール ツァイスn/a生細胞イメージング培養チャンバーと 63x 油浸対物レンズを装備 

参考文献

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  1. Trigo, D., Avelar, C., Fernandes, M., Sa, J., da Cruz, E. S. O. Mitochondria, energy, and metabolism in neuronal health and disease. FEBS Letters. 596 (9), 1095-1110 (2022).
  2. Zong, W. X., Rabinowitz, J. D., White, E. Mitochondria and cancer. Molecular Cell. 61 (5), 667-676 (2016).
  3. Clare, D. K., Saibil, H. R. ATP-driven molecular chaperone machines. Biopolymers. 99 (11), 846-859 (2013).
  4. Tourniaire, F., et al. All-trans retinoic acid induces oxidative phosphorylation and mitochondria biogenesis in adipocytes. Journal of Lipid Research. 56 (6), 1100-1109 (2015).
  5. Psarra, A. M., Sekeris, C. E. Nuclear receptors and other nuclear transcription factors in mitochondria: regulatory molecules in a new environment. Biochimica et Biophysica Acta. 1783 (1), 1-11 (2008).
  6. Trigo, D., Goncalves, M. B., Corcoran, J. P. T. The regulation of mitochondrial dynamics in neurite outgrowth by retinoic acid receptor beta signaling. FASEB Journal. 33 (6), 7225-7235 (2019).
  7. Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Current Protocols in Cell Biology. Chapter 4 (Unit 4), 1-21 (2010).
  8. Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biology. 11 (12), e1001754(2013).
  9. Lefebvre, A., Ma, D., Kessenbrock, K., Lawson, D. A., Digman, M. A. Automated segmentation and tracking of mitochondria in live-cell time-lapse images. Nature Methods. 18 (9), 1091-1102 (2021).
  10. Chu, C. -H., Tseng, W. -W., Hsu, C. -M., Wei, A. -C. Image analysis of the mitochondrial network morphology with applications in cancer research. Frontiers in Physics. 10, 855775(2022).
  11. Creed, S., McKenzie, M. Measurement of mitochondrial membrane potential with the fluorescent dye tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM). Methods in Molecular Biology. 1928, 69-76 (2019).
  12. Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, 9-21 (2013).
  13. Sahin, M., Oncu, G., Yilmaz, M. A., Ozkan, D., Saybasili, H. Transformation of SH-SY5Y cell line into neuron-like cells: Investigation of electrophysiological and biomechanical changes. Neuroscience Letters. 745, 135628(2021).
  14. Trigo, D., et al. Mitochondria dysfunction and impaired response to oxidative stress promotes proteostasis disruption in aged human cells. Mitochondrion. 69, 1-9 (2022).

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