ここでは、トランスジェニックダイズ毛根の高効率生産のためのプロトコルを提示します。
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この記事について
サマリー
要約
大豆(グリシンマックス)は、何千もの産業用途を持つ農業における貴重な作物です。ダイズの根は、窒素や病原菌を固定するために共生する土壌微生物との相互作用の主要な場所であり、ダイズの根の遺伝学を含む研究は、その農業生産を改善するために最も重要です。ダイズ毛状根(HR)の遺伝子形質転換は、 アグロバクテリウム・リゾゲネス NCPPB2659株(K599)によって媒介され、ダイズ根の遺伝子機能を研究するための効率的なツールであり、開始から終了までわずか2か月かかります。ここでは、ダイズHRで目的の遺伝子を過剰発現およびサイレンシングする方法を概説する詳細なプロトコルを提供します。この方法論には、ダイズ種子の滅菌、K599による子葉の感染、およびRNA単離および必要に応じて代謝物分析のための遺伝子形質転換HRの選択と収穫が含まれます。このアプローチのスループットは、複数の遺伝子またはネットワークを同時に研究するのに十分であり、長期的に安定した形質転換アプローチに取り組む前に最適な工学戦略を決定することができます。
概要
大豆(グリシンマックス)は農業で最も価値のある作物の一つです。食品、動物飼料、石油など、何千もの商業的および産業的用途があり、製造用の原材料の供給源として使用されています1。窒素固定土壌微生物、すなわち根粒菌と共生関係を形成する能力は、ダイズ遺伝学研究の重要性をさらに高めます2。たとえば、大豆の根の窒素固定特性を微調整すると、炭素排出量の削減につながり、窒素肥料の要件を大幅に削減できます3。したがって、特にダイズ根生物学の側面を制御する遺伝学を理解することは、農業や産業に広く応用されています。これらの利点を考慮すると、ダイズ遺伝子の機能を解析するための信頼性の高いプロトコルを持つことが重要です。
アグロバクテリウム・ツメファシエンスは、多くの植物種の核ゲノムにトランスファーDNA(T-DNA)を統合する能力を持っているため、おそらく植物の遺伝子形質転換に最も一般的に使用されるツールです。アグロバクテリウム菌が植物に感染すると、腫瘍誘導(Ti)プラスミドが宿主染色体に移され、感染部位に腫瘍が形成されます。 アグロバクテリウムを介した形質転換は、遺伝子機能解析や作物形質改変のために何十年にもわたって広く使用されてきました4
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プロトコル
注意: すべての手順を無菌条件下で実行することをお勧めします。
1.大豆種子の殺菌
- バイオセーフティキャビネットに、16〜20個の丸いウィリアムズ82大豆種子を手付かずの状態(つまり、ひび割れや傷がない)で50mLの遠沈管に入れます。
- 30 mLの70%イソプロピルアルコールを加え、30秒間軽く振ってから、アルコールをデカントします。
- 種子を30 mLの10%漂白剤で10秒間静かに振とうし、種子を室温(RT、25°C)で5分間溶液に入れます。5分後、漂白剤を排出します。
- すすぎごとに1分間、30mLの滅菌超高純度H2Oで3回振とうを繰り返し、各すすぎの間にH2Oを廃棄します。
- 滅菌した種子を、5 mLの発芽共培養(GC)培地(オートクレーブ半強度液体ムラシゲおよびスクーグ[MS]培地と1%スクロース[pH = 5.8]で飽和させたろ紙に置き、次に2.5 mL / Lビタミンを添加します)滅菌シャーレに入れます。
- プレートを室温(25°C)の暗所に3日間置いた後、プレートを22°Cで16時間の冷白色T5蛍光灯(100 μE m-2·s-1)の下で4日間移し、種子を発芽させました。
注意: しわやひびの入った種は捨てます。最高の種子は大....
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結果
代表的な結果は、公表されたデータ19、20からのものである。形質転換K599 アグロバクテリウム 菌のコロニーPCR(cPCR)結果を 図1に示す。図 1に陽性コロニーによって示されるように、目的の遺伝子はcPCRによって検出された(図1A)。しかし、コロニーの3分の1から2分の1は VirD2 遺伝子スクリーニングに陰性であり(図1B)、Tiプラスミドの喪失を示しており、カルスや毛状の根を生成することができません。 図2 は、ダイズHRの全体的な調製手順と遺伝子発現解析を示しています。 図3 は、GFP-GmJAZ1-6の細胞内局.......
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ディスカッション
過去10年間で、大豆HR法は、窒素固定22,23、生物的および非生物的ストレス耐性24,25、および代謝物生合成経路26,27に関与する遺伝子を研究するための強力なツールとして開発されてきました。植物がどのように代謝産物を産生するかについての知識は、病原体に対する生化学的防御の媒介に関与する遺伝子ネットワークを研究するために使用できるため、農業生産および製薬業界に多くの利点があります28。
生産性とコスト効率を優先するために、このプロトコルは手順を簡素化します。例えば、ゲル化剤を含むより高価な固体培地を使用する代わりに、大豆種子は、液体成長培地で飽和された工業用グレードのペーパータオルを.......
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開示事項
著者は開示するものは何もありません。
謝辞
この研究は、カナダ自然科学工学研究評議会(NSERC)の助成金番号RGPIN-2020-06111とブラッドレースからの寛大な寄付によって資金提供されました。K599ア グロバクテリウム と予備プロトコールを提供してくれたWayne Parrott氏(ジョージア大学)と、pGWB2、pGWB6、およびpANDA35HK空ベクターを提供してくれたNakagawa & Hachiya Labs(島根大学)に感謝します。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アセトシリンゴン | マン | 23224 | |
| 漂白剤 | 21124DMSO | ||
| フィッシャーバイオ試薬 | 195679 | ||
| ゲルザン | フィトテック | HYY3251089A | |
| ハイグロマイシン | フィトテック | HHA0397050B | |
| イソプロピルアルコール | フィッシャー化学 | 206462 | |
| Kanamycin | Phytotech | SQS0378007G | |
| LBパウダー | フィッシャーバイオ試薬 | 200318 | |
| MSパウダー | ケーソンラボ | 2210001 | |
| Na2HPO4 | Fisherバイオ試薬 | 194171 | |
| NaCl | フィッシャー化学 | 192946 | |
| ペトリ皿 | ッシャーブランド | 08-757-11 | 100 mm x 25 mm |
| ホスフィノトリシン | シダーラン | P034-250MG | |
| REDExtract-N-Amp PCR キット | Sigma | R4775 | |
| ショ糖 | バイオショップ | 2D76475 | |
| チメンチン | ケーソン ラボ | 12222002 | |
| ビタミン | ケーソン ラボ | 2211010 |
参考文献
- Li, S., et al. Optimization of Agrobacterium-mediated transformation in soybean. Frontiers in Plant Science. 8, 246(2017).
- Elhady, A., Hallmann, J., Heuer, H. Symbiosis of soybean with nitrogen fixing bacteria ....
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