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方法論記事

マウス膵臓の生体内イメージングのための安定化ウィンドウ

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DOI:

10.3791/65498

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2023年10月6日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 2Department of Pathology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 3Integrated Imaging Program for Cancer Research, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 4Department of Anatomy and Structural Biology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 5Breast Center, Peking University People's Hospital, 6Department of Microbiology & Immunology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 7Montefiore Einstein Cancer Center, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 8Cancer Dormancy and Tumor Microenvironment Institute, Albert Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 9Gruss-Lipper Biophotonics Center, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center, 10Department of Cell Biology, Einstein College of Medicine / Montefiore Medical Center

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

マウス膵臓の細胞内分解能イメージングのための安定化された留置光学窓の外科的移植のプロトコルを提示し、健康な膵臓と病気の膵臓の連続的および縦断的研究を可能にします。

要約

膵臓の生理学と病態生理学は複雑です。膵炎や膵臓腺癌(PDAC)などの膵臓の疾患は、罹患率と死亡率が高い。生体内イメージング(IVI)は、健康な状態と病気の状態の両方の組織の高解像度イメージングを可能にする強力な技術であり、細胞動態のリアルタイム観察を可能にします。マウス膵臓のIVIは、臓器の深い内臓とコンプライアンスの性質により、損傷や運動アーチファクトが非常に起こりやすいため、重大な課題を提示します。

ここで説明するのは、マウスPancreas(SWIP)のIntravitalイメージングのためのStabilized Wインドウの移植プロセスです。SWIPは、正常な健康な状態、健康な膵臓からセルレインによって誘発される急性膵炎への転換中、および膵臓腫瘍などの悪性状態におけるマウス膵臓のIVIを可能にします。SWIPは、遺伝子標識細胞または蛍光色素の投与と組み合わせて、単一細胞および細胞内動態(単一細胞および集団移動を含む)の測定、および数日間にわたる同じ関心領域の連続イメージングを可能にします。

PDACにおけるがん関連死亡率の主な原因は圧倒的な転移性負担であるため、腫瘍細胞の移動を捕捉する能力は特に重要です。PDACにおける転移の生理学的動態を理解することは、満たされていない重要なニーズであり、患者の予後を改善するために重要です。全体として、SWIPはイメージングの安定性を向上させ、健康な膵臓および悪性膵臓疾患におけるIVIの適用を拡大します。

概要

良性および悪性の膵臓疾患は生命を脅かす可能性があり、その病態生理学の理解にはかなりのギャップがあります。膵炎(膵臓の炎症)は、米国における消化器疾患関連の入院および再入院の第3大原因であり、かなりの罹患率、死亡率、および社会経済的負担に関連しています1。膵管腺がん(PDAC)は、がん関連死因の第3位2にランクされており、膵臓悪性腫瘍の大半を占めており3 、5年生存率はわずか11%2と低いことを示しています。PDACにおけるがん関連死亡率の主な原因は、圧倒的な転移性負担です。残念ながら、ほとんどの患者は転移性疾患を呈します。したがって、PDACにおける転移の動態を理解することは、がん研究の分野における重要なアンメットニーズです。

炎症と膵臓の転移カスケードを支えるメカニズムは十分に理解されていません。この知識のギャップの主な原因は、 in vivoで膵臓の細胞動態を観察できないことです。これらの細胞動態を直接観察することで、膵臓疾患患者の診断と治療を活用し、改善するための重要な標的を明らかにすることが期待されます。

生体内イメージング(IVI)は、研究者が生きている動物の生物学的プロセスをリアルタイムで視覚化して研究できるようにする顕微鏡技術です。IVIは、生体内および生体プロセスの天然環境内の細胞 内 および微小環境のダイナミクスを高解像度で直接可視化することができます。したがって、IVIは、健康および病理学的プロセスの in vivo 観察を可能にします。

MRI、PET、CTなどの現代の全身画像モダリティは、臓器全体の優れたビューを提供し、臨床症状の発症前でも病状を明らかにすることができます4。しかし、単一細胞の分解能を達成したり、膵炎や悪性腫瘍などの疾患の初期段階を明らかにしたりすることはできません。

これまでの研究では、皮膚5,6、乳房7、肺8、肝臓9、脳10、膵臓腫瘍11の良性および悪性疾患を単細胞分解能IVIで観察し、疾患の進行メカニズムに関する洞察を得ています12。しかし、マウスの膵臓は、主に内臓の奥深くに位置し、コンプライアンスが高いため、IVIを使用して単一細胞の解像度を達成する上で大きな障害となっています。さらに、腸間膜内の枝分かれしたびまん性に分布する器官であり、脾臓、小腸、胃に接続しているため、アクセスが困難です。組織はまた、隣接する蠕動運動と呼吸によって引き起こされる動きに対して非常に敏感です。膵臓の動きを最小限に抑えることは、数ミクロンの動きでさえ画像をぼやけさせ、歪ませ、個々の細胞の動態を追跡することを不可能にするため、単一細胞分解能顕微鏡検査に不可欠です13。

IVIを実施するには、腹部イメージングウィンドウ(AIW)を外科的に埋め込む必要があります9,11。AIWを外科的に移植するには、金属製の窓枠を腹壁に縫合します。その後、シアノアクリレート接着剤を使用して目的の臓器をフレームに取り付けます。これは一部の硬い内臓(肝臓、脾臓、硬い腫瘍など)には十分であるが、健康なマウスの膵臓を画像化する試みは、組織の準拠したテクスチャと複雑な構造のために最適ではない側方向および軸方向の安定性によって損なわれる14。この制限に対処するために、Parkらは、健康な膵臓用に特別に設計されたイメージングウィンドウを開発しました14。この膵臓イメージングウィンドウ(PIW)は、カバーガラスのすぐ下の窓枠内に水平な金属製の棚を組み込み、組織を安定させ、カバーガラスとの接触を維持することで、腸の動きと呼吸の影響を最小限に抑えます。PIWは横方向の安定性を高めているが、この窓は依然として軸方向のドリフトを示し、さらに金属製の棚とカバーガラス15の間の狭い隙間のために大きな固形腫瘍のイメージングを妨げることがわかった。

これらの制限に対処するために、私たちは、健康な膵臓と病気の膵臓の両方の安定した長期イメージングを達成できる埋め込み型イメージングウィンドウである、マウスPancreas(SWIP)のIntravitalイメージング用のStabilized Windowを開発しました(図1)15。ここでは、SWIPを埋め込むために使用される外科的処置の包括的なプロトコルを提供します。主な目的は転移に関与する動的メカニズムを研究することでしたが、この方法は、膵臓の生物学と病理学のさまざまな側面を探求するためにも利用できます。

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プロトコル

このプロトコルに記載されているすべての手順は、アルバートアインシュタイン医科大学の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)による事前承認を含む、脊椎動物の使用に関するガイドラインと規制に従って実行されています。

1.窓の不動態化

注:ステンレス鋼の不動態化処理は、金属の汚染物質を洗浄し、薄い酸化物層を形成して、チタン16の生体適合性を超えて、軟部組織との金属の生体適合性を大幅に向上させます。

  1. 光学窓枠を1%(w / v)の酵素活性洗剤溶液で洗浄することにより、不動態化プロセスを開始します。
  2. フレームをガラス瓶内の5%(w / v)水酸化ナトリウム溶液に70°Cで30分間浸します。
  3. フレームを取り出し、脱イオン水ですすいでください。
  4. フレームを7%(w/v)クエン酸溶液、55°C、10分間、新しいガラス瓶に浸します。
  5. フレームを取り外し、脱イオン水で再度すすいでください。
  6. 手順1.2を繰り返し、最後にもう一度窓枠を脱イオン水ですすいでください。

2.腫瘍移植または窓手術の準備

注:膵臓腫瘍の研究では、腫瘍細胞を移植し、明白な腫瘍に成長させる必要があります。in vivoで腫瘍細胞を可視化するには、Dendra2などの蛍光タンパク質を発現するように遺伝子改変された細胞を使用することが推奨されます。明るい蛍光タンパク質標識を使用すると、組織の自家蛍光に関する潜在的な問題を軽減できます。使用される可能性のある他の潜在的な蛍光タンパク質、色素、および遺伝的にコードされた蛍光マウスモデルは、他の場所で議論されています17,18。術野の汚染を防ぐために、フードまたは層流キャビネットで外科的処置を行い、準備、手術、および回復に別々の領域が使用されるようにします。

  1. 手術の前に、すべての手術器具をオートクレーブで滅菌し、必要に応じて、その後の処置にはホットビーズ滅菌器を使用してください。手術がチップのみの技術を採用していることを確認してください。
  2. 加熱された手術パッドとビーズ滅菌器のスイッチを入れ、適切な動作温度に達するのを待ちます。加熱パッドの温度は、火傷の可能性を避けるために表面温度計で監視する必要があります。温度を適切に制御できない場合は、加熱パッドの上に滅菌布を置きます。
    注:腫瘍や窓の移植などの短時間(≤20分)中の体温は、加熱された手術用パッドを使用している間は最小限に抑えられます。ただし、長時間のタイムラプスイメージングなど、長時間の麻酔では、体温を維持するためにマウスを加熱チャンバーに入れる必要があります。
  3. 麻酔チャンバー内で5%イソフルランでマウスを麻酔します。
  4. 重要なステップ:マウスが意識を失ったら、麻酔を2%に下げます。麻酔レベルとマウスのバイタルを注意深く監視します(例:パルスオキシメータを使用)19。
  5. 角膜の乾燥を防ぐために、マウスの両目に目の潤滑剤を少量垂らします。
  6. 手術前に、左上腹部に脱毛クリームをたっぷりと塗って脱毛します。20秒後、湿らせたティッシュペーパーを使用して、髪と脱毛クリームをしっかりと拭き取ります。手術部位からすべての髪の毛が取り除かれるまで、必要に応じてこのプロセスを繰り返します。
  7. 術前の鎮痛を確実にするために、90 μL の PBS で希釈した 10 μL のブプレノルフィン (0.1 mg/kg) を皮下注射します。

3.膵臓腫瘍移植

  1. 腫瘍細胞のアリコートを所望の濃度で調製します(腫瘍細胞の倍加時間に基づく)。細胞懸濁液をインスリン注射器に入れ、氷上に保管します。このプロトコルに従うには、Erstadらから適合した同所性注入プロトコルに従って、最大50μLのPBSに懸濁した106 同系KPC腫瘍細胞20 を使用します21
    注:この濃度で注射されたこの細胞株は、10〜14日までに触知可能な、または適切に大きな腫瘍を日常的に産生しました。この細胞株と他の膵臓細胞株のサブクローンは、適切なサイズの腫瘍を産生するために、適切な濃度とタイムラインについて評価する必要があります)。
  2. 消毒石鹸を使用して手を洗ってください。
  3. 新しい手術の前に、新しい滅菌手袋を着用してください。
  4. マウスを滅菌手術用フードに移し、部分的な右外側褥瘡の位置に置きます。
  5. 手足を紙テープで固定します。
    注意: 手順全体を通して、機器の適切な使用が重要です。鉗子、カストロビエホはさみ、バキュームピックアップツールの保持方法の例を図2A-Cに示します。
  6. 腹部を消毒剤で滅菌します(図2D)。
  7. つま先のつまみテストを実行して、動物が完全に麻酔されていることを確認します。
  8. 鉗子とカストロビエホハサミを使用して、皮膚に10〜15mmの左肋骨下切開を行います(図2E)。
  9. 必要に応じて、綿棒または焼灼ペンを使用して止血を制御します。
  10. 鉗子とカストロビエホハサミで下にある筋肉を慎重に分割して腹膜に入ります(図2F)。
  11. 滅菌綿棒を使用して、膵臓と脾臓を非外傷的に外在化します。
  12. 膵臓を広げて、ひだがないようにします(図2G)。
  13. 膵臓の体または尾部(血管から離れた場所)の目的の腫瘍注射部位を特定します。
  14. 重要なステップ:膵臓を慎重に配置した後、鉗子を使用して組織に張力を与え、インスリン注射器の先端を斜角を上に向けて、膵臓の目的の部位に4〜5 mmの深さまで挿入します(図2H)。
  15. 腫瘍細胞溶液をゆっくりと注入します。注入が成功したことを確認する小さな気泡を探します(図2I)。
  16. 腫瘍細胞注入気泡を乱すことなく、膵臓を慎重に腹部に戻します(図2J)。
  17. 吸収性の5-0ポリジオキサノン縫合糸を使用して、最初に筋肉層を閉じ、次に中断縫合糸で皮膚を閉じます(図2K-N)。
  18. 切開部をシアノアクリレート接着剤で覆い(図2O)、マウスを加熱ランプの下の清潔なケージに戻して回復させます。感染を防ぐために飲料水に抗生物質を投与します。マウスを監視し、手術から完全に回復するまで待ちます。
    注:抗生物質は、IACUCプロトコルの要求に応じて投与されます。すべての動物は個別に飼育されています。
  19. 腫瘍が腹壁を通して触知できるようになるまで、腫瘍を10〜14日間発生させます。

4.膵臓の窓の手術

  1. 動物のイメージングの準備ができたら、窓埋め込み手術を開始します。まず、消毒石鹸で手を洗います。
  2. 新しい手術の前には、必ず新しい滅菌手袋を着用してください。
  3. 加熱された手術用スタンドで、マウスを右外側褥瘡の位置に置き、左腹部を露出させます。
  4. マウスの前肢と後肢を、紙テープを使用して頭蓋および尾側で加熱された手術ステージに固定します。脾臓(皮膚の下)が術野内に見えることを確認します(図3A)。
  5. 無菌状態を維持するために、フード内のすべての手術器具を開梱してください。
  6. マウスの皮膚を消毒剤をたっぷりと塗って手術部位を消毒します。
  7. つま先のつまみテストを実行して、動物が完全に麻酔されていることを確認します。
  8. 重要なステップ:鉗子で腹部の左上象限の皮膚を持ち上げ、カストロビエホハサミを使用して皮膚と筋肉組織に~10mmの円形切開を行います(図3B、C)。
  9. 必要に応じて、綿棒または焼灼ペンを使用して出血を制御し、止血を維持します。.
  10. 脾臓に付着している膵臓の位置を特定し、膵臓が切開部内に横たわっている方向を特定して、支持するクロスステッチを配置する場所を決定します。
  11. 5-0シルク縫合糸を使用して、最初のステッチを筋肉層の目的の場所に置きます。この端を3〜5ノットで結びます。(図3D、E)
  12. 切開部を直接縫い続けます。~5cmの尾を切り取って残します(図3F)。
  13. ステップ4.11と4.12を最初のステッチに垂直に繰り返します(図3G、H)。
  14. 重要なステップ:膵臓をゆっくりと持ち上げてクロスステッチの上に配置します(図3I、J)。操作中に膵臓を傷つけないように注意してください。
  15. 重要なステップ:5-0シルク縫合糸を使用して、穴から~1mmのところに、円周方向に、皮膚と筋肉層を織り交ぜて巾着紐ステッチを行います(図3K)。
  16. 円形の切り込みの端が窓の溝内に収まるように窓枠を配置します(図3L)。
  17. 5-0シルクをしっかりと縛って、埋め込まれた窓を固定します。
  18. 100 μLの液状シアノアクリレート接着剤を1 mLシリンジにロードします。
  19. ~10秒間、圧縮空気の繊細な流れを当てて組織を乾燥させます。
  20. 鉗子で窓枠の外縁をつかみ、ゆっくりと持ち上げて、膵臓が窓枠の下面から確実に分離されるようにします。
  21. 重要なステップ:窓のくぼみに沿って液体シアノアクリレート接着剤の薄層を塗布します(図3M)。膵臓組織に接着剤が付着しないように注意してください。
  22. バキュームピックアップを使用して、5mmのカバーガラスを持ち上げます。
  23. カバーガラスを光学窓枠の中央のくぼみの内側に慎重に置きます。シアノアクリレート系接着剤を硬化させながら、軽い圧力で保持します(~25秒)。
  24. 鉗子を使用してカバーガラスをバキュームピックアップから分離します。
  25. クロスステッチ縫合糸を締めて、膵臓をカバーガラスにぴったりと固定します(図3N、O)。注:クロスステッチは膵臓の損傷や虚血を引き起こす可能性があるため、締めすぎないでください。
  26. 縫合糸の端を切ります。
  27. マウスからテープをはがします。
  28. イソフルラン気化器のスイッチを切ります。
  29. マウスを清潔なケージに移すか、生体内顕微鏡に直接移動させます。
  30. 窓の手術後に動物を個別に収容し、完全に回復するまで監視します。
  31. 次に、以前に説明したように、22,23,24 長時間のイメージングセッションでは、マウスを加熱チャンバーに入れて体温を維持し、IACUC規格に従って支持体液を提供します。

5.膵炎誘発のためのセルレイン治療

  1. 膵炎の発症を調べるには、SWIPの移植後に健康なマウスにセルレインを投与します。セルレイン投与の前に、マウスを14〜18時間絶食させ、 自由自在の水 を与えてください。
  2. 50 μg/kg のセルレインを 100 μL の滅菌 1x DPBS に 1 時間間隔で腹腔内に注入し、最大 8 回の注射を行います。同等の量の1x DPBSを腹腔内に注射し、対照マウスに投与します。
  3. イメージング後、IACUC規格に従って、最初の注射から24時間後に子宮頸部脱臼によりマウスを犠牲にします。
  4. 前述したように2レーザー多光子顕微鏡でイメージングを行う22,23,24。長時間のイメージングセッションでは、マウスを加熱チャンバーに入れて体温を維持し、IACUC規格に従ってサポート液を提供します。

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結果

図1は、Du et al.15から引用したもので、マウスの膵臓のタイムラプスIVI動画の静止画を示しています。初期の整定期間(イメージングの最初の1時間、図1A)内にいくつかの組織の動きが観察されます。しかし、このセトリング期間(>75分)後もイメージングを継続すると、横方向および軸方向の安定性の向上が観察されました(図1B)。SWIPの安定性を以前のAIWおよびPIWイメージングウィンドウと比較すると、すべてのウィンドウがセトリングに初期期間を必要とすることがわかります。しかし、SWIPは全体的に最も低いレベルのドリフトを示し、長時間のイメージングに最適です(図1C-K)。画像は、特注の多光子顕微鏡24で880nmを照射し、フレーム間1.7分、2μmステップサイズで11スライス、...

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ディスカッション

ここで説明するSWIPプロトコルは、クロスステッチバスケット技術を利用して、膵臓組織を安定化するための改良された方法を提供します。初期の腹部画像窓(AIW)は、腹部の内臓の生体内画像(IVI)を可能にしたが、膵臓などの軟部組織の動きを適切に制限していなかった。これに対応して、Parkらは、水平の金属棚を組み込んで、ガラスカバーガラスとの接触を維持しながら膵臓組織の安定性を向上させることができる膵臓イメージングウィンドウ(PIW)を開発しました。このアプローチでは横方向の安定性は向上しますが、固形膵臓腫瘍のサイズが棚とカバーガラスの間の狭いスペースを超えるため、イメージングが制限されます。SWIPは、クロスステッチバスケットで膵臓を安定させ、軸方向と横方向の両方の動きを制限すると同時に、大きな(≤10mm)固形腫瘍にも対応できるようにすることで、この問題に対処します。

SWIPとAIWやPIWなどの以前のイメージングウィンドウとの直接比較は、以前に実施されました15。これは、Du et al.15

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開示事項

著者には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

Evelyn Lipper Charitable Foundation、Gruss-Lipper Biophotonics Center、Integrated Imaging Program for Cancer Research、NIH T-32 Fellowship (CA200561)、および国防総省の膵臓がん研究プログラム (PCARP) 助成金PA210223P1。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
酵素活性洗剤の1%(w / v)溶液アルコノックス株式会社NA手動および超音波洗浄用のプロテアーゼ酵素を含む濃縮陰イオン洗剤
水酸化ナトリウムの5%(w / v)溶液シグマ-アルドリッチS8045パッシベーション試薬
5 mmカバーガラス電子顕微鏡科学72296-05丸型ガラスカバースリップ 
Sigma-Aldrichの7%(w / v)溶液251275不動態化試薬
28G 1 mL BD インスリン注射器BD329410細胞注射用注射器
バイトリル 100 (エンロフロキサシン)バイエル (サンタクルーズバイオテクノロジー)sc-362890Rx抗生物質
ベンチマウントヒートランプMcMaster-Carr3349K51ヒートランプ
ブプレノルフィン 0.3 mg/mLコベラス 北米059122ブプレノルフィン鎮痛剤
Castroviejo湾曲はさみ世界精密機器WP2220組織切断用はさみ
C57BL / 6Jマウスジャクソン研究所000664 C57BL/6Jマウス
クロルヘキシジン溶液Durvet7-45801-10258-3クロルヘキシジン消毒液
圧縮空気キャニスターファルコンDPSJB-12組織乾燥用圧縮空気
シアノアクリレート - ゲル スーパーグルーステープルズ234790-6スキン グルー
シアノ アクリレート - 液体 スーパーグルーステープルLOC1647358カバースリップ グルー
DPBS 1xCorning21-031-CVDPBS for cerulein/cell injections
Gemini Cautery KitHarvard Apparatus726067Cautery Pen
Germinator 500CellPoint ScientificGER 5287-120Vビーズ滅菌器
Graefeマイクロ解剖鉗子;鋸歯 状;わずかなカーブ;0.8 mmの先端幅;4インチレングスロボズサージカルRS-5135 Graefeマイクロ解剖鉗子
イメージング顕微鏡NANAEntenberg et al. 2011 [27]
イメージングソフトウェアNAEntenberg et al. 2011 [27]
Isoethesia (isoflurane)Henry Schein, Animal Health50033Isoflurane Anesthesia
Kim WipesFisher Scientific06-666-A キムワイプ
実験室用テープフィッシャーサイエンティフィック159015R実験用テープ
マウス解剖キットワールド精密機器MOUSEKIT手術器具
マウス 足 パルスオキシメータ センサーケント サイエンティフィック コーポMSTAT センサー-MSEパルスオキシメータ
マウス Surgisuiteケント サイエンティフィックSURGI-M04加熱プラットフォーム
ネア 脱毛ローションアマゾンB001RVMR7K脱毛ローション
酸素TechAirOX TM酸素
PERMA-HAND ブラック 編組シルク縫合糸、ETHICON サイズ 5-0VWR95056-872シルク縫合糸
リン酸緩衝生理食塩水 1xLife Technologies10010-023PBS
PhysioSuite SystemKent ScientificPhysioSuite加熱プラットフォームコントローラー
PuralubeHenry Schein Animal Health008897Eye Lubricant
Puritan Nonsterile Cotton-Tiped Swabs フィッシャーサイエンティフィック867WCNOGLUE綿棒
シャープ精密バリアチップ、P-100、100µLデンビルサイエンティフィック株式会社P1125100 &マイクロ;Lピペットチップ
テトラメチルローダミンイソチオシアネート–デキストランSigma-AldrichT1287-500MG血管ラベル
ウィンドウ固定プレートNANA 顕微鏡ステージ上のウィンドウ配置用のカスタムメイドプレートです。プレートはステンレス鋼のシムストックで0.008で作られています。プレートの寸法については、Entenberg et al., 2018 [8]を参照してください。
ウィンドウフレームNANA窓は、5mmのカバースリップを受け入れる中央の開口部を備えたスチールフレームで構成されています。フレームの周囲に1.75mmの溝があり、腹膜筋と皮膚の層が接着するスペースを確保しています。Entenberg et al., 2018 [8]をご参照ください。
クエン酸 

参考文献

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