ここでは、腫瘍スフェロイドの迅速、堅牢、低コストな作製とそれに続くハイドロゲルカプセル化を可能にするプロトコルを紹介します。特殊な機器を必要としないため、広く適用できます。特に、スフェロイドとマトリックスの相互作用を探索したり、 in vitro 組織生理学や病理学モデルを構築したりするのに有用です。
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方法論記事
スフェロイド-マトリックス相互作用研究のためのポリエチレングリコールハイドロゲルにおける腫瘍スフェロイドの作製とカプセル化
この記事について
サマリー
要約
スフェロイドの3次元(3D)カプセル化は、最適な細胞増殖のために腫瘍微小環境を適切に再現するために重要です。 ここでは、腫瘍の細胞外微小環境を模倣するために、スフェロイドカプセル化用の in vitro 3D神経膠芽腫モデルを設計しました。 まず、ポリジメチルシロキサンを用いて四角錐型のマイクロウェルモールドを作製した。次に、これらのマイクロウェルモールドを使用して、50〜500μmのサイズを厳密に制御した腫瘍スフェロイドを製造しました。 スフェロイドが形成されると、スフェロイドを回収し、ポリエチレングリコール(PEG)ベースのハイドロゲルにカプセル化しました。PEGハイドロゲルは、硬さ、分解性、細胞接着性などのハイドロゲル特性を独立して調整できるため、スフェロイドカプセル化のための汎用性の高いプラットフォームです。 ここでは、代表的な軟質(~8 kPa)ハイドロゲルを使用して、膠芽腫スフェロイドをカプセル化しました。 最後に、共焦点顕微鏡で高品質の画像を得るために、スフェロイドを染色して画像化する方法が開発されました。 スフェロイドコアが緻密で周辺が比較的まばらなため、イメージングが困難な場合がありますが、透明化溶液と共焦点光学セクショニングを使用することで、これらのイメージングの困難さを軽減することができます。 要約すると、均一なスフェロイドを作製し、それらをPEGハイドロゲルにカプセル化し、カプセル化されたスフェロイドに対して共焦点顕微鏡法を実行して、スフェロイドの成長とさまざまな細胞とマトリックスの相互作用を研究する方法を示します。
概要
腫瘍スフェロイドは、がんの病因、病理学、および薬物反応性を研究する上で有用なin vitroツールとして浮上しています1。従来、スフェロイドは、細胞表面の接着よりも細胞間の接着が好まれる低接着プレートやバイオリアクターなどの条件で培養されてきました2。しかし、腫瘍の微小環境をより忠実に再現するために、in vitroスフェロイドモデルは細胞間相互作用と細胞マトリックス相互作用の両方を捉える必要があることが現在認識されています。このため、複数のグループが、スフェロイドをカプセル化できるハイドロゲルなどの足場を設計するようになりました3,4。このようなハイドロゲルベースのスフェロイドモデルは、生存率、増殖、幹細胞性、治療反応性など、さまざまな細胞挙動における細胞間および細胞マトリックス相互作用の解明を可能にします3。
ここでは、ポリエチレングリコール(PEG)ヒドロゲルに神経膠芽腫スフェロイドをカプセル化するためのプロトコルについて説明します。ヒドロゲルへの膠芽腫細胞スフェロイドのカプセル化に関する複数の文献報告があります。例えば、スフェロイドは、U87細胞をRGDS接着性リガンドで装飾....
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プロトコル
1. 溶液の準備
- ポリジメチルシロキサン(PDMS)前駆体溶液の調製
- ネガティブPDMS前駆体溶液(接着剤前駆体溶液にも使用)を調製します。ヘラを使ってエラストマーを計量ボートにすくい入れ、計量します。硬化剤をエラストマーベースに1:10の比率で添加します。プラスチック製の計量ボートのスパチュラを使用して、PDMSと硬化剤を穏やかに完全に混合します。
注:このPDMS前駆体溶液を6ウェル四角錐型マイクロウェルプレートに流し込み、ネガティブモールドを形成します。これは、接着剤前駆体溶液に使用されるのと同じ溶液です。 - ポジティブPDMS前駆体溶液を調製します。エラストマーベースをヘラを使って計量ボートにすくい入れ、計量します。硬化剤をエラストマーベースに1:9の比率で添加します。プラスチック製の計量ボートのスパチュラを使用して、PDMSと硬化剤を穏やかに完全に混合します。
注:このPDMS前駆体溶液は、後でネガ型に流し込まれ、ポジ型を形成します。
- ネガティブPDMS前駆体溶液(接着剤前駆体溶液にも使用)を調製します。ヘラを使ってエラストマーを計量ボートにすくい入れ、計量します。硬化剤をエラストマーベースに1:10の比率で添加します。プラスチック製の計量ボートのスパチュラを使用して、PDMSと硬化剤を穏やかに完全に混合します。
- pH 8の0.3 Mトリエタノールアミン(TEA)緩衝液の調製
- 1 mL の TEA と 9 mL の 1x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を 50 mL のコニカル液にピペットで移動し、0.75 M TEA 溶液を調製します。1 N HClまたは1 N NaOHを使用して溶液をpH 8に滴定します。次に、最終容量が 25 mL ....
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結果
化学療法効果を研究するためのスフェロイドベースの薬物スクリーニングプラットフォームは、天然組織を複製する生体材料にスフェロイドをカプセル化する際に腫瘍微小環境を調節することに重点が置かれているため、ますます求められています。ここでは、多細胞腫瘍スフェロイドの調製と、その後の3Dハイドロゲルへのカプセル化とイメージングの方法を開発しました。スフェロイドはマイクロウェルモールド(図3A、B)で調製され、球形と厳密に制御された多分散性を持つスフェロイドが得られます。例えば、マイクロウェルあたり 3,300 個の細胞を持つスフェロイドの場合、平均スフェロイドサイズは ~250 μm で、真円度は >0.8 で、1 は完全な球体です(図 3C、D)。回転楕円体直径の分散係数(%CV)は 19.3%、真円度の %CV は 4.5% でした。スフェロイドの直径は、 表 1 に示すように、マイクロウェルあたりの細胞数に依存してい.......
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ディスカッション
ハイドロゲルベースの多細胞腫瘍スフェロイドモデルは、がん治療の発見を前進させるためにますます開発されています11,13,29。これらは、制御された方法で腫瘍微小環境の主要なパラメータをエミュレートし、その複雑さにもかかわらず、in vivoモデルよりもシンプルで安価に使用でき、多くがハイスループットスクリーニング技術と互換性があるため、有益です。ハイドロゲル生体材料は、腫瘍の細胞外マトリックスをエミュレートし、細胞-マトリックス相互作用を促進するように調整することができ、スフェロイド(解離細胞とは対照的に)は天然腫瘍の細胞間相互作用をエミュレートします。合成ヒドロゲルは、ここで実証されているように、ヒドロゲルが所望の構造支持体および物理的および機械的特性を提供するのに対し、接着性リガンドまたは分解性配列を使用して生化学的材料特性を独立して調整できるため、特に有利です。また、合成ハイドロゲルは、バッチ間のばらつきが小さく、材料特性の範囲が広く、体内のほと.......
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開示事項
著者は何も開示していません。
謝辞
この研究は、セントルイス大学からSilviya P Zustiak博士に提供されたスタートアップ資金と、セントルイス大学のHenry and Amelia Nasrallah Center for NeuroscienceからSilviya P Zustiak博士に授与されたシード助成金によって資金提供されました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 70%エタノール | フィッシャーサイエンティフィック | LC22210-4 | |
| 15 mL コニカル | FALCON | 352097 | |
| 24-Well Plate Ultra Low Attachment plates | Fisher Scientific | 07-200-602 | |
| 35 mm Petri Dish | Amazon | 706011 | |
| 4-arm poly(ethylene glycol)-acrylate (4-arm PEG-Ac; 10 kDa) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-10K-5g | |
| 50 mL Conicals | Fisher Scinetific | ||
| 6ウェルAggreWell 400 | StemCell Technologies、バンクーバー、カナダ | 34421 | 正方形のピラミッド型マイクロウェル |
| 抗付着リンス液 | StemCell Technologies、バンクーバー、カナダ | 猫 #: 07010 | |
| アスパラギン酸-アルギニン-システイン-グリシン-バリン-プロリン-メチオニン-セリン-メチオニン-アルギニン-グリシン-システイン-アルギニン-アスパラギン酸 (DRCG-VPMSMR-GCRD) ペプチド | ジェニックバイオ、上海、中国 | n/a | カスタム合成 |
| ケミカルヒュームフード | KEWAUNEE | 99151 | |
| Corning Matrigel 基底膜マトリックス、LDEV Free | コーニング356234 | 基底膜マトリックス | |
| 洗剤 - Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | 非イオン性界面活性剤 |
| ジメチルスルホキシド(DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| ディスポーザブルピペット (1 mL, 2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL) | Fisher Scinetific | 1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F | |
| ウシ胎児血清 | HyClone | SH30073-03 | |
| ホルムアルデヒド 37% 溶液 | Sigma Aldrich | F1635 | |
| ガラスプレート | スランピーズ | GBS4100SFSL | |
| ガラストランスファーピペット | Fisher Scinetific | 5 3/4": 1367820A, 9":136786B | |
| グリシン-アルギニン-システイン-アスパラギン酸-アルギニン-グリシン-アスパラギン酸-セリン (GRCD-RGDS) ペプチド | Genic Bio, Shanghai, China | n/a | カスタム合成 |
| 血球計算盤 | Bright-Line | 383684 | |
| 疎水性溶液 - シランをはじく | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
| インキュベーター | NUAIRE | NU-8500 | |
| 倒立顕微鏡 (Axiovert 25) | Zeiss | 663526 | |
| Invitrogen DiOC16(3) (3,3'-ジヘキサデシロキサカルボシアニン過塩素酸塩) | Fisher Scientific | D1125 | |
| ライカコンフォーカル SP8 | ライカマイクロシステムズ(株) | ||
| 光蛍光顕微鏡 (Axiovert 200M) | Zeiss | 3820005619 | |
| Micro Centrifuge tubes | Fisher Scientific | 2 mL: 02681258 | |
| 顕微鏡ソフトウェア | Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | |
| Nestin Alexa Fluor 594 | サンタクルス | バイオテクノロジーsc-23927 | |
| パラフィルム | パラフィルム | PM992 | |
| PBS (1x), pH 7.4 | HyClone | SH30256.01 | |
| ペニシリン ストレプトマイシン | MP Biomedicals | 1670046 | |
| Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
| ピペットチップ(1–200 µL、101–1000 &マイクロ;L) | Fisher Scinetific | 2707509 | |
| プラスチック標準使い捨てトランスファーピペット | Fisher Scientific | 13-711-9D | |
| プラスチック計量ボート (100 mL) | Amazon | mdo-azoc-1030 | |
| ポリ(エチレングリコール)-ジチオール (PEG-diSH; 3.4 kDa) | Laysan Bio | SH-PEG-SH-3400-5g | |
| ポリジメヒルシロキサン (PDMS) [Slygard 182 エラストマーキット] | Elsworth Adhesives | 3097358-1004 | ポリジメチルシロキサン |
| パウダーフリー検査用手袋 | Quest | 92897 | |
| ヨウ化プロピジウム、1 mg/mL 水性ゾルン。 | フィッシャーサイエンティフィック | ||
| RPMI-1640 ミディアム (1x) | HyClone | SH30027-02 | |
| シリコンスペーサー - シリコンシート、厚さ0.5 mm/13 cm x 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0.5 | |
| SOX2 Alexa Fluor 488 | サンタクルス | バイオテクノロジーsc-365823 | |
| 組織培養フード | NUAIRE | NU-425-600 | |
| トリエタノールアミン、≥99.0% (GC) | Sigma Aldrich | 90279 | |
| U-87 MG ヒト膠芽腫細胞 | American Type Culture Collection | HTB-14 |
参考文献
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again. Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).
- Costa, E. C., de Melo-Diogo, D., Moreira, A. F., Carvalho, M. P., Correia, I. J.
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