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方法論記事

エンリッチメントビーズと限定消化を組み合わせた宿主細胞タンパク質分析(英語)

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DOI:

10.3791/65544

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2024年1月19日

 ,  , 
1Analytical Chemistry, Regeneron Pharmaceuticals Inc.

この記事について

サマリー

医薬品(DP)から宿主細胞タンパク質(HCP)を濃縮し、プロテオーム濃縮ビーズを使用してペプチドを検出するためのプロトコルが示されています。この分析法は、自社製のモノクローナル抗体(mAb)原薬(DS)を使用して実証されており、これは、性能の観点からさまざまな分析法を評価および比較するための十分に特性評価された標準物質です。

要約

宿主細胞タンパク質(HCP)は、少量であっても治療用タンパク質に悪影響を与える可能性のある不純物です。医薬品に関連する潜在的なリスクを評価するために、存在量の少ない医療従事者を特定する方法が開発されています。高感度の HCP 検出法を開発するための重要なアプローチは、液体クロマトグラフィー質量分析法(LC-MS)を利用して、分析前にモノクローナル抗体(mAb)を除去すると同時に HCP を濃縮することです。

このプロトコルは市販のプロテオーム濃縮のビードを使用して宿主のセル蛋白質を富ませるための詳しい指示を提供する。これらのビーズには、さまざまなタンパク質に特異的な親和性を持つヘキサペプチドリガンドの多様なライブラリが含まれています。このプロトコルには、ナノLC-MS/MSを使用した限定的な消化とその後のペプチド検出も組み込まれています。これらの技術を採用することで、存在量の少ない HCP を 7,000 倍以上濃縮することができ、検出限界は 0.002 ppm という驚異的な数値になります。重要なことに、このプロトコルでは、NIST mAb を使用して 850 の HCP を高い信頼性で検出できます。さらに、ユーザーフレンドリーになるように設計されており、その実装を支援するためのビデオデモンストレーションが含まれています。これらのステップを踏むことで、研究者は医療従事者を効果的に濃縮して検出し、医薬品のリスク評価の感度と精度を高めることができます。

概要

宿主細胞タンパク質(HCP)は、宿主生物の細胞培養から放出され、モノクローナル抗体(mAb)と共精製される不純物です1,2,3,4。微量レベルのHCPは、医薬品の品質に悪影響を与える可能性があります5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、したがって、サブppmからppmレベルのHCPを検出するには、高感度のHCP分析法が望まれています。

直交的な方法を適用して、少量のHCPを検出できます。酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)は、一般的にHCP全体の定量に使用され、対応する抗体が利用可能であれば、個々のHCPを検出して定量することもできます16。しかし、HCP特異的抗体の産生には時間と労力がかかります。対照的に、質量分析(LC-MS)と組み合わせた液体クロマトグラフィーは、モノクローナル抗体医薬品中の個々のHCPに関する包括的な情報を提供することができ、HCPの同定に広く適用されています4,7,9,10,12,13,14,15,17,18,19,20, 21、22、23、24、25、26、27。

LC-MS/MS で HCP を検出するために、限定消化20、ろ過17、プロテイン A 欠失21、免疫沈降 (IP)、ProteoMiner 濃縮 (PM)18 など、いくつかの方法が開発されています。ほとんどの分析法は、LC-MS/MS 分析の前にモノクローナル抗体の量を減らし、HCP を濃縮することで、モノクローナル抗体ペプチドと HCP ペプチドの間のダイナミックレンジを狭めることを目的としています。このプロトコルは、ProteoMiner技術と限られた消化(PMLD)を組み合わせたプロテオミクスサンプル濃縮法を提示します28。ProteoMiner エンリッチメントの原理では、コンビナトリアルペプチドリガンドの多様なライブラリーを含む市販のプロテオームエンリッチメントビーズを使用します。これらのリガンドは、抗体医薬品上のタンパク質に特異的に結合し、過剰な分子を除去しながら、少量の宿主細胞タンパク質(HCP)をそれぞれのアフィニティーリガンドに濃縮します。一方、限られた消化の原則には、低濃度のトリプシンを使用することが含まれます。この濃度は、少量のHCPを消化するには十分ですが、すべての抗体医薬品を消化するには十分ではありません。このアプローチにより、溶液から消化されたHCPペプチドを回収し、濃縮することができます。

濾過法と比較して、PMLD技術は、検出されたHCPのサイズによって制限されない17。プロテインA欠失法は、抗体に結合したHCPの検出に特異的であるが21、免疫沈降は、抗HCP抗体が産生された特定の細胞株(チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株など)由来の事前定義されたHCPに限定される4。対照的に、PMLDは、さまざまな細胞株の医薬品と共精製された任意の薬物モジュールおよび宿主細胞タンパク質からのHCPを検出するために適用できます。さらに、PMLDは、前述の方法17、18、20、21、24と比較して、より優れた感度を示します。

このアプローチにより、HCP 濃度を 7000 倍に濃縮し、検出限界を 0.002 ppm28 に下げることができます。実験装置を 図1に示します。

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プロトコル

プロトコルで使用される略語は、 補足表1にリストされています。

1. 溶液および緩衝液の調製

注:すべての試薬の商品詳細は、 材料表に記載されています。

  1. ガラスバイアル中の9 mLの脱イオン水に1 mLの1 M Tris-HCl、pH 8.0を加えて0.1 M Tris-HCl、pH 8.0の溶液を調製し、ボルテックスでよく混合します。4°Cで最長3ヶ月間保存してください。
  2. 10 mg の SDC を 0.1 M Tris-HCl(pH 8.0)1 mL に溶解して、24 mM デオキシコール酸ナトリウム(SDC)を調製します。
  3. 7 mg の SLS を 0.1 M Tris-HCl、pH 8.0 の 1 mL に溶解して、24 mM ラウロイルサルコシン酸ナトリウム(SLS)を調製します。
  4. 24 mM SDC と 24 mM SLS を 1:1 (v/v) の比率で混合して溶出バッファーを調製します。
  5. 20 μg のトリプシンに 400 μL の脱イオン水を加えて、50 ng/μL のトリプシン溶液を調製します。
  6. 7.7 mg の DTT に 308 μL の 0.1 M Tris-HCl、pH 8.0 を加えて、25 mg/mL のジチオスレイトール(DTT)を調製します。
  7. 0.2 M ヨードアセトアミド(IAM)を 1.2 mL の 0.1 M Tris-HCl(pH 8.0)を 56 mg の IAM に添加して調製します。
  8. 9 mLの脱イオン水に1 mLのトリフルオロ酢酸(TFA)を加えて、10% TFAを調製します。4秒間ボルテックスし、スピンダウンします。4°Cで最長3ヶ月間保存してください。
  9. 99 mLの脱イオン水に1 mLの10% TFAを加えて、バッファーAを調製します。
  10. 1 mL の 10% TFA と 49 mL の脱イオン水を 50 mL のアセトニトリル(ACN)に添加して、バッファー B を調製します。
  11. 37 mgのL-ヒスチジンと54.8 mgのL-ヒスチジン一塩酸塩一水和物を50 mLの水に加えて、10 mMヒスチジン緩衝液を調製します。

2. モノクローナル抗体(mAb)溶液の調製

  1. 濃度が 50 mg/mL を超える医薬品の場合、モノクローナル抗体(mAb)( 材料表を参照)を 2 mL の微量遠心チューブで脱イオン水で希釈すると、総容量が 300 μL、最終 pH が ~6 になります。必要に応じて、酢酸またはトリスHClを使用してpHを調整します。
  2. 濃度が 50 mg/mL 未満の医薬品の場合は、ステップ 2.2.1 から 2.2.5 に従ってバッファー交換を行ってください。
    1. 各サンプル 20 mg を 10k 遠心フィルター装置( 材料表を参照)に移し、約 100 μL の容量が残るまで 14,000 x g で 25 分間(室温、室温)遠心分離します。
    2. 350 μL の 10 mM ヒスチジン( 材料表を参照)、pH 6.0 バッファーをフィルターに加え、ボルテックスし、14,000 x g で 14,000 x g で 25 分間室温で遠心分離します。
    3. フィルターをひっくり返してサンプル採取チューブに入れ、1000 x g で5分間遠心分離して、コレクションチューブ内の全容量を回収します。フィルターを 200 μL、10 mM ヒスチジンバッファーで洗浄し、ピペットで上下に動かして、残っているタンパク質サンプルを回収します。溶液全体を同じコレクションチューブに移し、ボルテックスし、スピンダウンします。
    4. NanoDropでサンプル濃度を測定します。エンリッチメントビーズでインキュベーションする前にヒスチジンバッファーを添加して、各タンパク質サンプルの濃度を 50 mg/mL に調整します。
    5. 300 μL のサンプルを 2 mL の微量遠心チューブに移します。

3. プロテオーム濃縮ビーズの調製

  1. 市販のタンパク質濃縮キットから入手した各スピンカラムから上部キャップと下部キャップを取り外します( 材料表を参照)。キャップは後で使用するため、廃棄しないでください。
  2. スピンカラムを取り出し、キャップのない2 mL微量遠心チューブに入れます。保存溶液を排除するために、室温で1,000 x g 、室温で30〜60秒間セットアップを遠心分離します。このステップで集めた材料を廃棄します。
  3. 市販の濃縮ビーズ( 材料表を参照)に200 μLの洗浄バッファーを加え、ピペットで数回上下させます。スピンカラムを2 mLの微量遠心チューブに入れ、室温で1,000 x g で30〜60秒間遠心分離してバッファーを除去します。収集した材料を廃棄します。
    注:洗浄バッファーは、市販のタンパク質濃縮キットに含まれています。
  4. 手順 3.3 を 2 回繰り返します。
  5. ボトムキャップを元に戻し、200μLの水を加えてから、トップキャップを元に戻します。

4. 蛋白質の濃縮

  1. スラリーをピペットで上下させ(ステップ3.5から)、ステップ2で調製したサンプルに40μLのスラリーを移します。チューブをインキュベートし、室温で2時間回転させます。
  2. 16 Gのニードルを使用してフリット付きのチップを作成し( 材料表を参照)、適切なフリットサイズを取得し、200 μLチップの先端に挿入します。
  3. ステップ4.2で調製したチップにビーズを入れたサンプルを移します。2 mLの微量遠心チューブで200 x g のチップを室温で3分間遠心分離し、溶液を除去します。
  4. チップに200 μLの洗浄バッファーを添加してビーズを洗浄し、2 mLの微量遠心チューブで200 x g のRTで2分間チップを遠心分離し、洗浄液を除去します。この手順を 2 回繰り返します。
  5. チップに200 μLの水を加えてビーズを洗浄し、2 mLの微量遠心チューブで200 x g のチップを室温で2分間遠心分離して水分を除去します。
  6. チップに10 μLの溶出バッファーを添加してビーズからタンパク質を溶出し(ステップ1.4)、チップにスラリーを10回ピペットで移し、ビーズが溶出バッファーに浸されていることを確認します。
  7. 新しい0.5 mL微量遠心チューブでチップを200 x g で30秒間室温で遠心分離し、溶離液を回収します。ステップ 4.6-4.7 を 2 回繰り返し、すべての溶出を 1 本の 0.5 mL 微量遠心チューブに混ぜ合わせます。
  8. 1.5 μLのトリプシン溶液(ステップ1.5)を溶離液に添加し、28°Cで一晩消化します。 1.5 μL の 25 mg/mL DTT を加え(ステップ 1.6)、サンプルを 90 °C で 20 分間加熱します。
  9. 1.5 μL の 0.25 M IAM を加え(ステップ 1.7)、室温で暗所で 20 分間インキュベートします。 3.5 μL の 10% TFA (ステップ 1.8) を加え、2 分間ボルテックスし、pH が ~2-3 であることを確認します。
  10. 室温で 14,400 × g で 10 分間遠心分離し、SDC および SLS を沈殿させます。脱塩のために上清を回収します。
  11. 以下の手順で脱塩を行ってください。
    1. 50 μL のバッファー B を GC 脱塩チップに添加します( ステップ 1.10)。1000 x g のホルダーでチップを室温で3分間遠心分離します。
    2. チップにバッファー A 50 μL を添加します(ステップ 1.9)。1000 x g のホルダーでチップを室温で3分間遠心分離します。
    3. 酸性化したサンプルをチップに加えます。RTで500 x g のホルダーで6分間チップを遠心分離します。
    4. チップにバッファー A 50 μL を添加してチップを洗浄します。チップをホルダーで500 x g で3分間遠心分離し、RTで回収した材料を廃棄します。一度繰り返します。
    5. GC脱塩チップにバッファーBを50 μL添加して、チップからペプチドを溶出します。新しいチューブでチップを 500 x g で 3 分間遠心分離し、材料を回収します。この手順を一度繰り返し、溶離液を混ぜ合わせます。
    6. 溶離液を真空濃縮装置で乾燥させます( 材料表を参照)。
  12. 乾燥溶離液を30 μLの0.1%ギ酸(FA)溶液に再懸濁します。
  13. 分光光度計で214 nmのペプチド混合物のUVを測定します( 材料表を参照)。ペプチド混合物の濃度は、0.1〜0.5 mg / mLの範囲である必要があります。.
  14. 各分解サンプル 10 μL を LC サンプルバイアルに移し、分解した各サンプル 1 μg をナノ LC-MS/MS に注入します( 材料表を参照)。ステップ 5 に従って解析を実行します。残りの消化サンプルは、-80°Cの冷凍庫で保管してください。

5. ナノLC-MS/MS分析

  1. ペプチド混合物を質量分析計に結合したナノLCシステムに注入します。ペプチド混合物(~1 μg)を 表 1A のグラジエントで C18 トラップカラムにロードして脱塩し、次に C18 分析カラムに 40 °C でロードして分離します。
    注:移動相 A バッファーは 0.1% FA の超純水溶液で構成され、移動相 B のバッファーは 0.1% FA の 80% ACN 溶液で構成されていました。
  2. ペプチドを分離し、 表 1B に示すグラジエントで 250 nL/分の流速で溶出します。
    注:質量分析計は、サイクルタイム 3 秒のデータ依存モード(DDA)で操作しました。イオンは、フル MS スキャンごとに 30% の正規化された衝突エネルギーを持つ高エネルギーの衝突解離(HCD)によってフラグメンテーションを受けました。スキャンは 60,000 の解像度で実行され、自動ゲイン制御 (AGC) ターゲットは 3e6、最大注入時間は 20 ミリ秒、m/z の範囲は 380-1600 でした。MS/MS イベントは 15,000 の分解能で実施し、AGC ターゲットは 1e5、最大注入時間は 60 ms、m/z の範囲は 200 〜 2000 でした。除外期間は 45 秒に設定されました。イオン源の特性を 表 1C に示し、特定の質量分析パラメータを 表 2A-F に示します。

6. データ解析

  1. NISTmAb 質量分析の生ファイルを UniProt mus+musculus データベース29 に対して検索します。さらに、組換えタンパク質スパイクインモノクローナル抗体 DS 質量分析の生ファイルを UniProt Cricetulus Griseus データベース30 で検索します。
    注:これらの検索は、Proteome Discoverer ソフトウェア( 材料表を参照)で、Sequest HT および Mascot 検索エンジンを使用して実施しました。使用されたデータベースには、冗長なエントリがありませんでした。
  2. 質量分析検索では、質量許容誤差を 10 ppm に適用し、フラグメント質量許容誤差を 0.02 Da に設定します。
    注:検索基準には、システイン残基の静的カルバミドメチル化(+57.0214 Da)およびメチオニン残基の酸化のさまざまな修飾(+15.9949 Da)が含まれていました。さらに、脱アミノ化の可変修飾(+0.984 Da)を適用しました。
  3. トリプシン消化を使用してデータベース検索を実行し、最大2回の切断の欠落を許容します。タンパク質とペプチドの両方の偽発見率を 0.01 に設定します。
    注:宿主細胞タンパク質(HCP)を確実に同定するために、少なくとも2つの固有のペプチドの最小要件を適用しました。 表 3 に、Proteome Discoverer ソフトウェアで分析した NIST mAb に関連する同定された HCP の代表的な要約を示します。

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結果

このプロトコルは、モノクローナル抗体(mAb)サンプル中の宿主細胞タンパク質(HCP)を分析するために、限られた消化力(PMLD)と結合されたタンパク質濃縮と呼ばれるサンプル調製ワークフローを示しました。 図1 は、PMLDのステップバイステップの手順を示しています。研究者らは、直接消化( 図2の上部パネル)とPMLD( 図2の下部パネル)を用いたHCP分析の結果を比較しました。トータルイオンクロマトグラム(TIC)プロファイルは、PMLD が主要なモノクローナル抗体ペプチドを有意に減少または排除し、モノクローナル抗体ペプチドに匹敵する一部の HCP ペプチドの観察を可能にしたことを示しました。ナノLC(表1)およびMS/MS(表2)分析の詳細なパラメータが記載されています。さらに、 表 3 に、アクセッション番号、HCP 名、種、カバー率、PSM、固有のペプ...

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ディスカッション

市販のタンパク質濃縮ビーズには、容量の小さいものと容量の大きいものの2種類があります( 材料表を参照)。どちらのバージョンの濃縮ビーズにも、パッケージに 10 個のプレップが含まれています。メーカーの説明書では、小容量キットの各調製物を使用して、10 mgの総タンパク質を濃縮できることが示唆されています。ただし、DS からの宿主細胞タンパク質(HCP)濃縮の最適な性能を得るには、各調製が 5 つの DS サンプルに適しています。したがって、各キットを使用して、50 個のサンプルから HCP を濃縮できます。大容量キットの各調製では、25 個の DS サンプルから HCP を濃縮するのに適しており、合計 250 個のサンプルから HCP を検出できます。

ステップ 3.1 では、トップキャップまたはボトムキャップはプロトコル全体で再利用されるため、廃棄しないようにアドバイスしています。ビーズがトップキャップに沈殿した場合は、ボトムプラグを取り外し、トップキャップをカラムに付けたまま遠心分離した後、ビーズを交換してください。ボトムキャップをプラグとして...

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開示事項

著者は競合する金銭的利害関係を持っていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
16 G、メタルハブニードル、2インチ、ポイントスタイル 3Hamilton91016
Acclaim PepMap 100 C18 トラップカラム (20 cm × 0.075 mm)Thermo Fisher164535
AcetonitrileFisher-ScientificA955
アセトニトリル、0.1% ギ酸 (v/v)、Optima LC/MS グレード Fisher-ScientificLS120-4
Amicon Ultra-0.5 遠心フィルターユニットミリポアシグマUFC5010
C18 分析カラム (0.075 mm × 1.7 μm ×30 cm、100 Å)CoAnn TechnologiesHEB07503001718I
Centrifuge 5424Eppendorf5405000646
Dithiothreitol (DTT) Thermo FisherA39255
Frit for SPE cartridges、9.5 mm、3 mL、100個入りAgilent12131020
GL-Tip GCGL Sciences Inc  7820-11201
社内 mAbリジェネロン濃度 200 mg/mL
ヨードアセトアミド (30 x 9.3 mg)サーモフィッシャーA39271
イソプロパノールフィッシャー サイエンティフィック149320025
L-ヒスチジンSigma AldrichH6034
L-ヒスチジン モノハイドロライド 1 ハイドレートSigma Aldrich53370
メタノールフィッシャーサイエンティフィックA456-4 
Milli-QMillpore30035
NanoDrop 2000Thermo ScientificND-2000
Orbitrap Exploris 480Thermo FisherBRE725539
Protein LoBind チューブ 0.5 mLEppendorf (VWR)22431064
Protein LoBind チューブ 2.0 mLEppendorf (VWR)22431102
Proteome Discovererソフトウェア 2.4Thermo Scientific
ProteoMiner Protein Enrichment 大容量キットBio-Rad1633007
ProteoMiner Protein Enrichment Small-Capacity KitBio-Rad1633006
Dadium deoxycholate (SDC)Sigma AldrichD6750
Sodium lauroyl sarcosinate (SLS) Sigma AldrichL5777
SpeedVacLabconco7970010
Thermomixer REppendorf22670107
Trifluoracetic acid (TFA)Fisher-Scientific28904
Trypsin (Sequencing Grade Modified) (5 x 20 ug)PromegaV5111
チューブ リボルバー ローテーターサーモフィッシャー88881001
UltiMate 3000 RSLC ナノシステムサーモフィッシャーULTIM3000RSLCNANO
UltraPure 1 M Tris-HCl pH 8.0サーモフィッシャー15568-025
ボルテックス ジーニー 2VWR102091-234
0.1% ギ酸 (v/v)、Optima LC/MS グレード 水 フィッシャー・サイエンティフィックLS118-4 
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参考文献

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  30. Uniprot2. , https://www.uniprot.org/uniprotkb (2023).

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