方法論記事

ヒト骨肉腫細胞における長鎖ノンコーディングRNA局在化のためのRNA蛍光 in situ ハイブリダイゼーション

DOI：

10.3791/65545

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2023年6月16日

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1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Key Laboratory of Theory and Therapy of Muscles and Bones, Ministry of Education

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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本プロトコルは、ヒト骨肉腫細胞のlncRNAを局在化させるRNA蛍光 in situ ハイブリダイゼーションの方法を記述する。

要約

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がん細胞の増殖、上皮間葉転換(EMT)、遊走、浸潤、オートファジーの調節など、がんにおける長鎖ノンコーディングRNA(lncRNA)の重要な役割が研究されています。細胞内のlncRNAの局在検出は、その機能に関する洞察を提供することができます。lncRNA特異的なアンチセンス鎖配列を設計し、その後に蛍光色素で標識することにより、RNA蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)を適用してlncRNAの細胞局在を検出することができます。顕微鏡法の開発とともに、RNA FISH技術により、発現不良のlncRNAの可視化も可能になりました。この方法では、lncRNAの局在を単独で検出できるだけでなく、ダブルカラーまたはマルチカラーの免疫蛍光法を使用して、他のRNA、DNA、またはタンパク質の共局在を検出することもできます。ここでは、ヒト骨肉腫細胞(143B)におけるlncRNA小核小体RNA宿主遺伝子6(SNHG6)を例に、RNA FISH実験、特にlncRNA FISH実験を行いたい研究者の参考となるように、RNA FISHの詳細な実験操作手順と注意点を記載した。

概要

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ヒトゲノムの理解は、近年の全ゲノム技術の進歩によって大きく拡大しています。ヒトゲノムの約93%はRNAに転写できますが、タンパク質に翻訳できるRNAはわずか2%です。タンパク質翻訳機能を持たないRNAの残りの98%は、ノンコーディングRNA(ncRNA)1と呼ばれます。200以上のヌクレオチド2を含む長鎖ncRNA(lncRNA)は、分化、周期制御、アポトーシス、遊走、浸潤など、細胞の多くの生理学的・病理学的プロセスに関与していることから、ノンコーディングRNA(ncRNA)のクラスとしてますます注目を集めています3,4,5。.LncRNAは、クロマチン構造や核内遺伝子発現の調節、mRNAスプライシングプロセスの制御、転写後修飾など、さまざまなメカニズムを通じてその役割を果たしています6。LncRNAは、転写レベルと転写後レベルの両方で悪性腫瘍の発生、発生、および転移を調節します。核内では染色体構造への結合を介してRNAの転写に作用することで転写制御が実現され、細胞質内では内因性競合RNA(ceRNA)機構を介して標的遺伝子を制御することで転写後制御が実現される5,7,8。CeRNAは、lncRNAがスポンジとしてmiRNAを吸着し、miRNAを介した関連標的遺伝子の分解を阻害するという、RNA相互作用の新しいメカニズムを明らかにしました9。したがって、lncRNAの細胞内局在に関する情報は、特定のlncRNAが細胞質または核に存在するかどうか、それらの生物学的機能を特定するために重要です。

現在、lncRNAの局在は、主に核/細胞質分離アッセイとRNA FISHの2つの方法で検出されています。前者では、細胞質画分と核分画のRNAをそれぞれ抽出し、特定のlncRNAプライマーでPCR増幅を行い、細胞質と核のlncRNAの比率を検出します。この方法の利点は時間効率ですが、欠点は、実際のlncRNAの局在が細胞質と核内のlncRNAの相対的な割合によって直接反映されないことです。RNA FISHは、lncRNA特異的なアンチセンス鎖配列を設計し、それに続く蛍光色素で標識することにより、細胞内のlncRNA局在を検出することができます10。RNA FISH法は、蛍光色素標識マルチオリゴプローブセット11、LNAプローブ12、分岐DNA(bDNA)プローブ13など、プローブ技術および検出法の進歩により改良されてきました。RNA FISHは、lncRNAの局在を検出するだけでなく、ダブルカラーまたはマルチカラーの免疫蛍光法を使用して、他のRNA、DNA、またはタンパク質の共局在を検出することもできます14。

本研究では、骨肉腫細胞(143B)におけるlncRNA低核小体RNA宿主遺伝子6(SNHG6)の詳細な細胞内局在検出プロトコルをRNA FISHに例に含めた。SNHG6は、成熟したスプライシング型の600〜730ヌクレオチドlncRNAであり、結腸直腸癌、胃癌、卵巣明細胞癌、骨肉腫、肝細胞癌など、さまざまなヒト癌における新規癌遺伝子として同定されています15,16,17,18。研究により、SNHG6が増殖、EMT、オートファジーなどのがん細胞の生物学的挙動に関与していることが確認されており、SNHG6の細胞質局在が示されており、miRNAに結合(スポンジ化)することで標的遺伝子に影響を与える可能性があります15,16,17。RNA FISHによるSNHG6細胞内局在のこの詳細な検出プロトコルを本明細書に提示する。

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プロトコル

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このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、および機器の詳細については、 材料表 を参照してください。 図1 は、RNA FISHの全体的なプロトコルを示しています。表 1 にはすべての溶液の組成が含まれ、 表2 にはこのプロトコルで使用されるプライマー配列が含まれています。

1. プローブの準備

  1. 例えば、GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)から、目的の標的lncRNAのFASTA配列を同定し、取得する。ウェブサイトの指示に従って、ISHプローブをオンラインで設計し19、設計アルゴリズムの提案を確認して、Cy3ラベルで注文するプローブをリストします。
  2. ハイブリダイゼーションバッファーを事前に37°Cで2時間インキュベートします。
  3. 4光学密度(OD)プローブを160 μLのジエチルピロカーボネート(DEPC)処理ddH2Oに、光から1 mg/mLの濃度で溶解します。
    注:光学濃度(OD)は、DNAおよびRNAの測定単位を表します。通常、1 OD 単位 = 33 μg/mL の DNA。
  4. 各ウェルについて200μLのプローブ混合物(1.2μL〜10μLのプローブ、70μLのハイブリダイゼーションバッファー、DEPC処理ddH2O〜200μLで容量を構成します)を調製し、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、および6μg/mLのシリーズをセットアップします。
    注:プローブの濃度は、事前に実験的に調査する必要があります。プローブ濃度が高いとlncRNAが非特異的に結合し、プローブ濃度が低いとlncRNAの感度が低下したり、検出に失敗したりします。
  5. プローブミックスを73°Cで5分間変性させます。
    注:Cy3標識DNAプローブが二本鎖の場合は、プローブを95°Cで5分間一本鎖DNAに変性させた後、氷上で2分間急速に冷却します。

2. 細胞調製

  1. 12ウェル細胞培養プレート内の滅菌ガラスカバーガラス上にウェルあたり50,000個の143B細胞を播種し、DMEM中で24時間(37°C、5%CO2)インキュベートします。
    注:ここで播種する特定の細胞数は細胞サイズによって異なり、播種した細胞が24時間インキュベートした後に50%の合流に達するのに適しています。滅菌ガラスカバーガラスは丸型で、12ウェルプレートに適しています。
  2. 培地を取り出し、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2 x 5分間洗浄します。
    注:DEPC処理されたddH2OのPBSを1x 調製します。以下のすべての手順を RNase フリーの条件で実行します。
  3. 1x PBSを除去し、各ウェルに200 μLの100%エタノールを加えて、室温で15分間固定します。
  4. エタノールを除去し、各ウェルに 200 μL の 0.1% Triton X-100(1x PBS 中)を加え、室温で 15 分間インキュベートします。
    注:時間はTriton X-100透過処理で厳密に制御する必要があり、長すぎることはできません。
  5. 0.1% Triton X-100を除去し、1x PBSで5分×2回洗浄します。
    注:ここでプロトコルを一時停止する必要がある場合は、PBS を 70% エタノール(100% エタノールを RNase フリー ddH2O で希釈)に交換し、サンプルを 4 °C で最大 3 か月間保存します。
  6. 1x PBSを除去し、2x生理食塩水クエン酸ナトリウム(SSC)バッファー200 μL(RNaseフリーddH2Oで20x SSCを希釈)を各ウェルに加え、37°Cで30分間インキュベートします。
  7. 2x SSCバッファーを除去し、各ウェルに200 μLの70%エタノールを加え、室温で3分間インキュベートします。
  8. 70%エタノールを廃棄し、200μLの85%エタノール(100%エタノールをRNaseフリーddH2Oで希釈)を各ウェルに加え、室温で3分間インキュベートします。
  9. 85%エタノールを廃棄し、各ウェルに100%エタノール200μLを加え、室温で3分間インキュベートします。
  10. 100%エタノールを吸収して廃棄します。井戸を乾かします。

3. 蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)

  1. 200μLのプローブ混合物(ステップ1.5と同様に変性)を各ウェルに加え、37°Cで一晩(16〜18時間)インキュベートします。
    注:ハイブリダイゼーション温度とプローブ濃度の間には強い正の相関関係があります。したがって、バックグラウンドを最適化するには、ハイブリダイゼーション温度とプローブ濃度の両方を下げる必要があります。
  2. 翌日、37°Cからサンプルを取り出し、プローブ混合物を廃棄します。200 μL の 0.4x SSC/0.3% Tween-20 バッファーを各ウェル(65 °C に予熱)に加え、室温で 2 分間洗浄します。
  3. 0.4x SSC/0.3% Tween-20 バッファーを除去し、2x SSC/0.1% Tween-20 バッファー 200 μL を各ウェルに加え、室温で 2 分間洗浄します。
  4. 2x SSC/0.1% Tween-20バッファーを除去し、200 μLの4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)染色溶液(1 μg/mL)を加え、光を避けて20分間染色します。
  5. DAPI色素溶液を廃棄し、1x PBSで室温で2分間洗浄します。
  6. ガムを含む封入剤50 μLをスライドに加え、ガラスカバーガラスをスライドの上に置いて固定します。
    注意: カバーガラスは、必ずセル側を下にしてスライドに置いてください。
  7. 蛍光顕微鏡で観察します。
    注意: 蛍光顕微鏡またはレーザー共焦点顕微鏡を使用してください。後者は、より高い感度と明瞭なイメージングを生成します。

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結果

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ヒト骨肉腫細胞におけるSNHG6 FISHの代表的な画像を示します(図2)。ネガティブコントロールは、ネガティブCtrlプローブで処理されます。ポジティブコントロールはU6プローブ 20で処理する。SNHG6プローブとU6プローブは、赤色蛍光を発するCy3で標識されています。DAPIは、青色蛍光を発するDNAを染色する染料です。この結果は、SNHG6が主に細胞質に局在していることを示しており、この情報はSNHG6のさらなる研究のための重要な方向性を提供する可能性があります。

非常に高い濃度のプローブを使用すると、蛍光顕微鏡で背景色を見ることができます。 図3 は、RNA FISHに高濃度のSNHG6プローブを使用した場合の代表的な画像です。白い矢印は非特異的染色を表します。

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ディスカッション

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このRNA FISHプロトコルは、セル内のlncRNAの局在を検出するだけでなく、他のRNA、DNA、または細胞内のタンパク質の共局在を検出することもでき、パラフィン包埋組織におけるlncRNAの位置を検出するために使用できます。しかし、そのような場合の特定のプロトコルは、パラフィン包埋組織を脱ワックスする必要があるため、異なる21。この実験手順は、48ウェルまたは96ウェルプレートに適用できますが、384ウェルプレートは小さすぎてここでは使用できません。

この分析法のいくつかの重要なステップには、RNaseフリー環境、プローブ濃度、ハイブリダイゼーション温度、ネガティブコントロールとポジティブコントロールの設定などが含まれます。まず、RNaseはヌクレオチド間の結合を破壊し、一般的にlncRNAの分解につながるため、RNaseフリーの状態は非常に重要です。第二に、一般的に推奨されるプローブ濃度は5〜50μg/mLの範囲です。プローブ濃度が高いとlncRNAが非特異的に結合し、プローブ濃度が低いとlncRNAの感度が低下したり、検出に...

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開示事項

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著者らは、競合する金銭的利害関係はないと宣言しています。

謝辞

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この研究は、(1)中国国家重点研究開発プログラム(2020YFE0201600)からの助成金によって支援されています。(2)国立自然科学財団(81973877および82174408)。(3)病院TCM準備の産業変革の上海共同イノベーションセンター。(4)上海中医薬大学予算内の研究プロジェクト(2021LK047)。

    

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
自動セルカウンター上海Simo生物技術有限公司IC1000カウント細胞
細胞培養プレート-12上海YueNian Biotechnology Co.、株式会社3513、コーニングプレートにカバースリップを配置します
 細胞株 (143B)Cell Bank of Chinese Academy of SciencesCRL-8303osteosarcoma cancer cell line
Centrifuge tube (15 mL, 50 mL)Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd 430790、コーニング遠心分離機細胞
カバースリップ上海YueNianバイオテクノロジー株式会社abs7026細胞はカバースリップ
Cy3ラベル-SNHG6DNAプローブ上海GenePharma株式会社A10005SNHG6位置
DMEM培地YueNian Biotechnology Co.、LtdLM-E1141細胞培養培地
ドライバスインキュベーター海門麒麟ベルラボインスツルメンツ株式会社DKT200-2 異なる高温でのインキュベーション
エタノール100% Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10009218脱水
蛍光顕微鏡Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTDOlympus BX43 Olympus U-TV0.5XC-3 (SN:5J01719), オリンパス観察と位置決め
インキュベーターShanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LtdDHP-9051サンプルは37°Cでインキュベートされました。
実装媒体Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.E675004カバースリップをスライドに取り付け
シェイカーHaimen Kylin-Bell Lab Instruments Co.,Ltd.TS-8S洗浄サンプル
スライド上海 YueNian バイオテクノロジー Co., Ltd188105カバーガラスはスライド
Triton X-100Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.A600198透過性膜・核膜
 トリプシン(0.25%)上海YueNianバイオテクノロジー株式会社25200056、細胞
Tween-20Sangon Biotech(上海)有限公司A600560洗剤
検出上海ます に置かれます。のGibcoトリプシン治療

参考文献

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RNA FISH RNA lncRNA SNHG6 DAPI

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