単一の腫瘍の抗原を目標とするキメラ抗原の受容器(CAR)を表現するJurkatのセルによって量的な腫瘍の細胞の殺害を評価するプロトコル。このプロトコルは末梢血得られたT細胞の確認の前にCARの蝶番の構造の急速な最適化のためのスクリーニングのプラットホームとして使用することができる。
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方法論記事
蛍光イメージングを用いたキメラ抗原受容体を発現するJurkatの迅速 in vitro 細胞毒性評価
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
キメラ抗原受容体(CAR)T細胞は、腫瘍学の最前線にあります。CARは、ターゲティングドメイン(通常は一本鎖可変フラグメント、scFv)と、それに付随する鎖内リンカー、それに続くヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、および共刺激ドメインで構成されています。鎖内リンカーおよびヒンジドメインの修飾は、CARを介した死滅に有意な影響を与える可能性があります。CARコンストラクトの各部分にはさまざまなオプションがあるため、多数の順列があります。CAR-T細胞の製造は時間と費用のかかるプロセスであり、多くのコンストラクトの作成とテストには多大な時間と材料の投資が必要です。このプロトコルは、Jurkatセル(CAR-J)のヒンジ最適化CARコンストラクトを迅速に評価するためのプラットフォームを記述しています。Jurkat細胞は、レンチウイルスの取り込み量が多い不死化T細胞株であり、効率的なCAR形質導入を可能にします。ここでは、蛍光イメージャーを用いてCAR-Jを迅速に評価し、PBMC由来T細胞の細胞溶解を確認するためのプラットフォームを紹介します。
概要
CAR-T細胞療法は、米国国立がん研究所が報告したように、2017年以降にFDAが承認した6つのCAR-T製品から明らかなように、血液悪性腫瘍において大きな有望性を示しています1。固形腫瘍を標的とする臨床試験には、多数のCAR-T細胞があります。新しいCAR標的を設計し、CARコンストラクトを最適化することは、CAR-T細胞の有効性に不可欠です。腫瘍関連抗原(TAA)を正確に標的とし、正常組織における低レベルのTAA発現を回避するには、各アプリケーションに最適なCARコンストラクトを選択することが不可欠です2。
CARコンストラクトは、主に5つのコンパートメントで構成されています:(1)腫瘍抗原を標的とする細胞外一本鎖可変フラグメント(scFv)ドメイン;(2)ヒンジドメイン;(3)膜貫通ドメイン;(4)細胞内細胞質T細胞共刺激ドメイン;(5)シグナル伝達ドメイン。これらのドメインのそれぞれを修飾することは、その標的細胞3と係合するCAR-T細胞の精度に影響を及ぼす。したがって、これらのCARコンストラクトの細胞毒性と交差反応性をin vitroで評価することは、in vivo実験に向けて進むための適切なコンストラクトを選択するために重要です。T細胞による細胞溶解を評価する現在の方法には、....
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プロトコル
注:すべての細胞培養作業は、白衣、手袋を着用し、標準的な無菌技術に従って、バイオセーフティキャビネットで行われます。
1. ジュルカト語を表現するCARの生成(CAR-J)
- Jurkat細胞を購入し、ATCCからE6-1のクローンを作る。T-75フラスコで1 x 106細胞を解凍し、T-75フラスコで培養します。10% FBSを添加したRoswell Park Memorial Institute(RPMI)培地をインキュベーター、37°C、5% CO2のインキュベーターで使用し、0.6 x 106細胞/mLの懸濁液に維持します。
- プレート:1 x 105 Jurkat 細胞/ウェル、組織培養処理、24ウェルプレート、レンチウイルス効率を高める4 μg/mLのポリブレンを含む500 μLのRPMI増殖培地にプレート。レーザーベースの蛍光検出ベンチトップセルアナライザーを使用して細胞をカウントします。ウェルの数は、評価するコンストラクトの数によって異なります。この例では、4 つのコンストラクトと形質変換されていないコントロールを使用します。CAR構成の設計を 表1に示します。
- 各CARコンストラクトのレンチウイルス/ウェルを10 μL添加します。CARコンストラクト....
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結果
CAR-J1 の E:T 比は 1:8 から 8:1 の範囲で 72 時間で評価され、TNBC MDA-MB-231 細胞の EGFR を標的としました。Jurkat細胞をポリブレンを含むCARレンチウイルスで形質導入し、ステップ2で説明したようにCAR-J細胞を作製しました。CAR-J1の細胞毒性は、E:T比が高いほど有意に増加し、1:8比で死滅に差はありませんでした(図1)。4:1 E:T で 72 時間にわたって 50% 以上の死滅が観察されました。このE:Tは、複数のCARコンストラクトの迅速な細胞毒性評価のために、所要時間を48時間に短縮して、その後の実験に使用しました。ヒンジドメインを修飾したCARコンストラクトを標的とするEGFRを設計しました(表1)。使用される4つの異なるヒンジは、ここで説明するように、長いIgG、IgG培地、短いIgG、およびCD8aです13。これらの3つのコンストラクトはJurkat細胞に発現し、CAR陽性は、ここで説明するように、フローサイトメトリー(
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ディスカッション
本研究では、Jurkat細胞におけるCAR発現によって誘導される標的特異的な細胞溶解活性を効率的に評価するための迅速な方法を提案しました。すべてのCARコンストラクトは、同じscFvを持っていますが、ヒンジドメインと膜貫通ドメインが異なり、CAR-T細胞の効力に影響を与えることが示されています13。これらのCAR-Jによる非特異的死滅のさらなる評価は、抗原ノックアウト(KO)細胞で培養することによって行われました。これは、死滅が腫瘍抗原特異的であり、CAR-Jによる基礎活性化によるものではないことを示しています。E:T比の範囲の細胞毒性の可能性は、特定の時点で腫瘍細胞を排除するために必要なエフェクター細胞の数が最も少ないことを特定することで簡単に決定できます。また、同一または異なるがん種および正常細胞由来の複数の細胞株を用いて、これらのコンストラクトの特異性を評価することができる。CAR-Jプラットフォームによって同定された最も強力な候補は、PBMC由来のCD3 T細胞にCARを発現させ、同様の殺傷アッセイを実施し、抗原陽性および陰性の腫瘍細胞への曝露時の枯渇と活性化を評価することで、さら.......
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開示事項
著者は何も開示していません。
謝辞
MDA-MB-231は、シェーン・ステックライン博士からの親切な贈り物でした。著者らは、この研究を実施するためにカンザス大学がんセンターから資金提供を受けていることを認めている。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 15 mLコニカルチューブ(滅菌) | Midwest Scientific | #C15B | 50 |
| mLコニカルチューブ(滅菌) | Thermo Scientific | 339652 | 同様のものが機能します |
| ブラック/クリア96ウェルプレート | ファルコン | 353219 | セリゴには互換性のあるプレートのリストがあります |
| セリゴ4チャンネルイメージング サイトメンター | Nexcelcom バイオサイエンス | 200-BFFL-5C | 類似品 |
| 動作します セリゴソフトウェア | Nexcelcom Bioscience | バージョン 5.3.0.0 | 類似物が機能します |
| 細胞培養インキュベーター | Thermo Scientific | HeraCell 160i | 任意の類似物が機能します |
| 細胞培養処理フラスコ (T75、さまざまなサイズ、滅菌) | TPP | 90076 | 任意の類似物が機能します |
| CFSE | とんぼ | 13-0850-U500 | 任意の類似品が機能します |
| Cytek Museセル | アナライザーCytek | 0500-3115 | 任意の類似のものが動作します |
| DMEM | Gibco | 11995-040 | 任意の類似のものが動作します |
| FBS | Geminiバイオ製品 | 900-108 | 任意の類似のものが |
| 動作します Flow Cytometer | Cytek、BDなど | Aurora、LSR IIなど | 任意の類似のものが |
| 動作します FlowJo Sortware | Becton Dickinson &会社情報 | バージョン10.7.1 | 類似のものは動作します |
| Fluorobrite DMEM | Gibco | A18967-01 | 同様のものは動作します |
| GraphPadソフトウェア | GraphPad | バージョン9.3.1 (471) | 類似のものは動作します |
| Multichanel | Pipette Thermo Scientific | Finnpipette F2 | 同様のものは動作します |
| PBS | Gibco | 10010-031 | 同様のものが動作します |
| PenStrep | Gibco | 15070-063 | ピ |
| ペットチップ (滅菌、ろ過、1 mL、さまざまなサイズ) | Pr1ma | PR-1250RK-FL など | ピ |
| ペッター | Thermo Scientific | Finnpipette F2 | 類似 |
| ヨウ化プロピジウム | Invitrogen | P1304MP | 同様のものが動作します |
| RPMI | Corning | 10-041-cv | 同様のものが動作します |
| Serological Pipette Aid | Drummond Scientific | 4-000-105 | 同様のものが機能します |
| Serological Pipettes (滅菌済み、さまざまなサイズ) | Pr1ma | PR-SERO-25、など | 任意の類似のものが動作します |
| ピルビン酸ナトリウム | コーニング | 25-000-CI | 任意の類似のものが動作します |
| 滅菌リザーバー | 中西部科学 | RESE-2000 | 任意の類似のものが動作します |
| テーブルトップ遠心分離機 | エッペンドルフ | 5810R | 任意の類似のものが動作します |
参考文献
- Mitra, A. From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049(2023).
- Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614, 635-648 (2023).<....
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再版と許可
