ヒト新生児腸管内腸内細菌叢と腸内細菌叢異常体を組み込んだ壊死性腸炎のマイクロ流体モデル

Summary

このプロトコルは病気の病因に機構の調査に使用することができる壊死性腸炎(NEC)の 生体外の モデルを記述する。ヒト新生児の腸、内皮細胞、および重度のNECの新生児の腸内細菌叢に由来する腸内エンテロイドをシードしたマイクロ流体チップを特徴としています。

Abstract

壊死性腸炎(NEC)は、重篤で致命的な可能性のある腸疾患であり、その複雑な病因のために研究が困難であり、完全には理解されていません。NECの病態生理には、腸管タイトジャンクションの破壊、腸管バリア透過性の増加、上皮細胞死、微生物嚥下障害、および調節不全炎症が含まれます。NECを研究するための従来のツールには、動物モデル、細胞株、ヒトまたはマウスの腸管オルガノイドが含まれます。これらのモデルシステムを用いた研究は、疾患の病態生理学に関するこの分野の理解を深めてきましたが、ヒトNECの複雑さを再現する能力は限られています。現在、マイクロ流体技術を用いたNECの改良型in vitro モデル「NEC-on-a-chip」が開発されています。NEC-on-a-chipモデルは、早産児由来の腸管エンテロイドを播種し、ヒト内皮細胞と重症NEC乳児のマイクロバイオームを共培養したマイクロ流体デバイスで構成されています。このモデルは、NECの病態生理機構を研究するための貴重なツールであり、新生児腸疾患の創薬試験のための新しいリソースです。本稿では、NEC-on-a-chipモデルについて詳細に説明する。

Introduction

壊死性腸炎(NEC)は早産児に影響を及ぼし、体重が1500g^<生まれた乳児の発生率は最大10%です1。NECの病態生理は複雑で、腸管上皮の損傷、腸管タイトジャンクションの破壊、腸管バリア透過性の増加、免疫調節不全、上皮細胞死などが含まれます^2,3。NECの発症機序の解明は未だに不完全であり、何十年にもわたる研究にもかかわらず、有効な標的療法は未だに存在しません。

NECの研究を進める上での大きな障壁は、ヒトの乳児から分離された一次腸組織が限られていることとサイズが小さいことです。NECの乳児から切除された腸組織は、しばしば壊死し、重度の損傷を受けるため、疾患発症に先行するメカニズムの研究は複雑です。例えば、NECの乳児の小腸には免疫細胞が氾濫し、腸管幹細胞の減少、上皮細胞の増殖の減少、上皮細胞のアポトーシスの増加も観察されます^4,5,6,7。これにより、これらのサンプルから腸管上皮細胞を培養したり、この敵対的な炎症環境で分解される可能性のあるRNAやタンパク質を単離することが困難になります。さらに、外科的NECの乳児ではすでに疾患プロセスが進行しているため、疾患を誘発する要因のメカニズム研究は実行不可能です。これらの制限により、NECのメカニズム研究は動物モデルに依存しています。

NECの動物モデルは、マウス、ラット、子豚、ウサギ、ヒヒについて確立されています5,8,9,11。動物モデルの強みは、細菌叢様マイクロバイオーム、低酸素症の繰り返し、母乳育児の欠如など、ヒトのNEC発症に関連する要因によってNEC様腸疾患が誘発されることである5,8,10,11。さらに、実験中に観察された炎症反応と病理学的変化^NECパラレルヒト疾患^5,9,12。これらのモデルはヒトNECの特徴の多くを模倣しているが、動物とヒトにおけるNECの病態生理には本質的な違いがある。例えば、正期産のマウスモデルNECは、正期産のマウスに誘導され、腸管の発達は不完全であるが、NECの病態生理は、この臨床の文脈では本質的に異なっている。出生時のマウスの腸内遺伝子発現は、生存前のヒト胎児に類似しており、妊娠22〜24週の早産児の14日目まで近似しない(P14)¹³。これは、P10以降のマウスでは腸の損傷を一般的に誘発できないため、マウスNECモデルを混乱させます。さらに、近交系マウスはヒト新生児の免疫学的多様性¹⁴と微生物学的多様性^{を欠いており15}、これも交絡因子として機能している。したがって、NECの研究への一次ヒトサンプルの組み込みを増やすことで、この分野の研究の臨床的関連性が向上します。

NECのin vitroでのメカニズムの研究は、従来、大腸腺癌(Caco2)細胞やヒト結腸腺癌(HT-29)細胞などの成人腸癌細胞に由来する単型細胞株を利用してきました¹⁶。これらのモデルは簡便であるが、成体がん細胞からの増殖、非分極構造、および培養の反復継代に関連する表現型の変化により、生理学的関連性が限られている。腸管内エンテロイドは、腸組織の陰窩から成長し、すべての腸上皮サブタイプに分化し、3次元(3D)の絨毛様構造を形成することができるため、これらのモデルを改良します17,18,19,20。最近、腸管内エンテロイドは、小腸オンチップモデルを開発し、より生理学的に関連性のあるin vitroモデルシステムを提供するために、マイクロ流体技術と組み合わされている²¹。

最初の臓器チップマイクロ流体デバイスは、2000年代初頭に導入されました^22,23,24。最初の臓器チップモデルは、ヒトの呼吸肺チップ²⁵であった。これに続いて、腸21、肝臓²⁶、腎臓²⁷、骨髄28、血液脳関門²⁹、心臓³⁰など、多数の単一臓器モデルが続いた。これらのOrgan-on-a-chipモデルは、急性放射線症候群³¹、慢性閉塞性肺疾患³²、神経変性疾患³³などの急性疾患、慢性疾患、希少疾患の研究に用いられている。これらのチップ上の細胞の分極された性質と、多孔質膜で隔てられた2つの細胞区画の存在により、灌流、化学濃度勾配、免疫細胞走化性などの複雑な生理学的プロセスのモデリングが可能になります^34,35。したがって、これらのマイクロ流体システムは、ヒト疾患の病態生理学とメカニズムを研究するための新しいツールを提供します。

小腸オンチップモデルは、2018年にKaserdraらによって記述され、小児(10〜14歳)の小腸生検標本をエンテロイドに分化させ、マイクロ流体デバイスで培養しました²¹。血管内皮細胞、連続培地の流れ、および伸張/弛緩もこのモデルに組み込まれました。彼らは、腸上皮サブタイプの分化、3D絨毛様軸の形成、粘液産生、および小腸の遺伝子発現パターンを観察しました²¹。このマイクロ流体モデルは、新生児の腸管エンテロイド、内皮細胞、および^NEC36を持つ新生児のマイクロバイオームを組み込んだNEC-on-a-chipシステムの開発により、新生児疾患に適用されました。NEC-on-a-chipは、炎症性遺伝子発現、特殊な上皮細胞の喪失、腸管バリア機能の低下など、ヒトNECの重要な特徴の多くを再現している³⁶。このように、このモデルは、機構研究や創薬など、NECの研究において多くの応用が期待されています。この原稿では、NEC-on-a-chipモデルの性能に関する詳細なプロトコルを提供します。

Protocol

エンテロイドは、NECまたは非炎症性病因を有する他の腸疾患の手術時に得られた未熟児(妊娠22〜36週で出生)の小腸サンプルに由来する。すべての検体の収集と処理は、セントルイスのワシントン大学(IRBプロトコル番号201706182および201804040)およびノースカロライナ大学チャペルヒル校(IRBプロトコル番号21-3134)の治験審査委員会からのインフォームドコンセントと承認の後に行われました。

1. ヒト新生児小腸からの陰窩の単離とメッキによるエンテロイドの樹立

1. 培地調製
   1. 表 1 の説明に従って、必要なすべてのメディアを準備します。すべての培地の調製に無菌技術が使用されていることを確認してください。0.2μmのフィルターで培地をろ過滅菌し、使用するまで4°Cで保存してください。
2. 腸組織の洗浄とミンチ
   1. 細胞培養マトリックスハイドロゲルを氷上に置き、解凍します。手術室からヒトの腸組織を採取する。直ちにサンプルを5 mLの氷冷組織洗浄培地に置き、内因性プロテアーゼを不活性化します。
   2. トリミングされたP1000ピペットチップを取り付けた10 mLシリンジを使用して、氷冷したダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(D-PBS)で腸内容物を洗い流します。腸組織を5 mLの氷冷D-PBSを含む35 mmの皿に移します。
   3. 腸組織を縦に切って内腔を露出させ、細いハサミで細かく切ります。組織培養皿内のD-PBSで穏やかに撹拌することにより、腸組織をすすぎます。
   4. 組織片を清潔な35mmの皿に移します。細かいハサミでティッシュを細かく刻みます。最適なサイズは、個あたり0.5cm2です。腸組織は、トリミングされた1 mLのピペットチップを通過する必要があります。
3. 腸組織の解離
   1. 予熱したコラゲナーゼI1 mLを組織に加えます。ピペッティングで組織とコラゲナーゼを10〜15回混合し、15 mLのコニカルチューブに移します。
   2. 50rpmに設定されたシェーカーでチューブを水平に固定します。室温で20分間振とうします。
   3. インキュベーション後、シェーカーからチューブを取り出し、ピペッティングで10〜15回溶液を再懸濁します。オプション:位相差顕微鏡を用いて単一の陰窩の存在を確認するために、少量のアリコートを取り除きます。
4. 腸陰窩の分離
   1. 氷上で70 μmのストレーナーを通して50 mLのコニカルチューブに陰窩をろ過します。ストレーナーを9 mLの氷冷ティッシュ洗浄剤で洗浄します。濾液を15 mLのコニカルチューブに移します。
   2. 4°Cで10分間、300 x g で遠心分離し、上清を静かに除去します。チューブ内には約200μLの培地が残ります。ペレットを5 mLの氷冷組織洗浄培地に再懸濁します。
   3. 4°Cで10分間、300 x g で遠心分離します。 ペレットを1 mLの組織洗浄培地に再懸濁し、1.5 mLの微量遠心チューブに移します。
   4. 300 x g で4°Cで5分間遠心分離し、陰窩をペレット化します。ピペットを使用して上清をできるだけ注意深く完全に吸引します。チューブを氷の上に置きます。
5. 腸陰窩のメッキ
   1. ペレットを細胞培養マトリックスハイドロゲル(48ウェル組織培養プレートの20 μL/ウェル)に再懸濁し、事前に冷却したピペットチップを使用して、チューブを氷上に残したまま陰窩の均質な懸濁液を作ります。ピペッティング時に気泡を作らないでください。使用する準備ができるまで、チューブを氷上に置いてください。
      注:細胞培養マトリックスハイドロゲルは、8°Cを超える温度で重合します。 長さ0.5cm〜1cmの腸組織片から単離された陰窩は、通常、48ウェル組織培養プレートの10ウェルに播種されます。
   2. 陰窩/細胞培養マトリックスハイドロゲル懸濁液を、予熱した48ウェル組織培養プレートに播種します。マトリックスの凝固を助けるためにプレートを温めます。懸濁液を井戸の中央に置きます。めっきの際は気泡を避けてください。
   3. プレートを37°Cで20分間インキュベートし、マトリックスを重合させます。培地を添加する前に、細胞培養マトリックスヒドロゲルが完全に重合することが不可欠です。
   4. マトリックスが重合したら、予熱した50% L-WRN馴化培地300 μLを各ウェルに加えます。37°C、5%CO₂でインキュベートします。
   5. 2〜3日ごとにメディアを交換してください。温かい50%L-WRNコンディショニング培地と交換してください。7〜10日ごとに通過します。通過エントロイドは、50%〜90%のコンフルエントであり、芽の形成を示します。
      メモ:メディアが黄色くなった場合は、より頻繁に交換する必要があります。通過の頻度は、特定の患者の細胞のエンテロイド密度と増殖速度に依存します。エンテロイドは、その中心が外観が暗くなると継代する必要があります。
6. エンテロイドの継代
   1. ウェルから培地を静かに吸引します。500 μLの温かいD-PBSでウェルを慎重に洗浄します。マトリックスを乱さないように注意してください。
   2. 各ウェルに250 μLのコールドセル回収溶液を添加します。新しいピペットチップで各ウェルの底を引っ掻き、細胞培養マトリックスハイドロゲルを破壊します。プレートを氷上で30分間インキュベートします。
   3. 激しいピペッティング(P200ピペットで25~50回)でエンテロイドを解離し、500μLの組織洗浄培地を加えます。
   4. 腸内懸濁液を15 mLのチューブに移し、さらに5 mLの冷組織洗浄剤を加えます。ピペットで静かに動かし、均質な溶液を形成します。
   5. 400 x g で4°Cで5分間遠心分離し、エンテロイドをペレット化します。チューブを氷の上に置き、上澄みをできるだけ完全に吸引します。チューブ内には約30〜60μLが残ります。
      注:ピペッティングでエンテロイドを分解することが困難な場合は、0.25%トリプシン-EDTAまたは酵素解離試薬を使用してこのプロセスを容易にすることができます。
   6. エンテロイドをP200ピペットで洗浄液の残量に再懸濁します。ピペッティング中の気泡の発生を避けてください。
   7. 48ウェルプレートの新しいウェルあたり20 μLの細胞培養マトリックスヒドロゲルを腸内懸濁液に加えます。エンテロイドを密度に応じて1:3、1:4、または1:5に分割します。
   8. 予め温めた48ウェルプレートに懸濁液を加えます。プレートを37°Cで20分間インキュベートし、マトリックスを固化させます。
   9. 重合後、予熱した50% L-WRN馴化培地300 μLを各ウェルに加えます。37°C、5%CO₂でインキュベートします。

2. 新生児腸チップモデル

注:マイクロ流体チップの取り扱いおよびこの装置の使用に関する詳細な手順については、製造元の十二指腸腸チップ培養プロトコル³⁷を参照してください。

1. 培地調製
   1. 表 2 の説明に従って、必要なすべてのメディアを準備します。無菌技術が使用されていることを確認してください。0.2μmのフィルターで培地をろ過滅菌し、使用するまで4°Cで保存してください。
2. 日(-3):ヒト腸微小血管内皮細胞(HIMEC)の融解と拡大
   1. HIMECのバイアルを解凍し、メーカーの推奨に従ってプレートします。
   2. 25cm2のフラスコにゼラチンベースのコーティング液を2分間コーティングします。余分な溶液を取り除きます。HIMEC(約0.5-1 x 10⁶細胞)を6 mLのHIMEC培地に再懸濁してフラスコに加えます。37°C、5%CO₂でインキュベートします。
   3. HIMECメディアは48時間ごとに交換してください。100%コンフルエントになってから48〜72時間以内にチップの内皮(下)チャネルにHIMECを添加します。
3. 日(-1):エンテロイドを添加する前にチップを活性化してコーティングします
   1. チップ活性化試薬1(CR-1)粉末を再構成してCR-1溶液を作製する。このステップでは、CR-1粉末およびチップ活性化試薬2(CR-2)溶液が室温であることを確認してください。
      注意: 次の手順で調製したCR-1粉末とCR-1溶液は、常に光から保護してください。これらの手順では、ボンネット内のライトをオフにする必要があります。
      1. チップとチップキャリアをチップクレードルに入れ、細胞培養フード内の組織培養皿に入れます。キャリア³⁷へのチップ配置の適切な技術については、メーカーのプロトコルを参照してください。
      2. CR-1粉末のバイアルに1mLのCR-2溶液を加え、次に溶液をCR-1粉末バイアルからアルミホイルで包まれた15mLチューブに直接移し替えて光から保護します。溶液をピペットと混合しないでください。目標は、気泡の形成を回避することです。
      3. さらに 1 mL の CR-2 溶液を CR-1 バイアルに加え、15 mL チューブに移します。合計 4 回のすすぎと、CR-1 バイアルを通して合計 4 mL の CR-2 をすすぎます。キャップをバイアルに追加し、最後のすすぎのために反転させて、残留粉末を取り除きます。
      4. CR-1 を含む 15 mL チューブに 6 mL の CR-2 を追加し、最終容量を 10 mL(0.5 mg/mL)にします。気泡を発生させずにこの溶液をピペットで混合します。次のステップに進む前に、CR-1が完全に溶解していることを確認してください。
   2. チップへのCR-1溶液の添加
      注:これらのソリューションを追加するときは、チャネルに気泡が発生しないようにすることが重要です。このステップでは、CR-1溶液を光から保護したままにする必要があります。
      1. 200 μLのピペットチップを使用して、20 μLのCR-1溶液をボトムチャンネルインレットに添加し、溶液がボトムチャンネル出口から出始めるまで添加します。50 μL の CR-1 溶液を上部チャネルの入口から、溶液が上部のチャネル出口から出始めるまで添加します。穏やかな吸引により、チップの表面から余分なCR-1溶液を取り除きます。
         注意: 溶液は、常に上部チャネルの前に下部チャネルに追加する必要があります。気泡が見られる場合は、両方のチャネルをCR-1溶液で洗い流し、2.3.2.1を繰り返します。
      2. チップが入った組織培養皿の蓋が所定の位置にある場合は、このステップのために蓋を取り外します。チップをUVライトの下に15分間置きます。上部と下部のチャネルからCR-1を取り外します。
      3. 手順 2.3.2.1 から 2.3.2.2 を繰り返して、合計 2 つの UV アクティベーション手順を実行します。このステップの後、チップは光に敏感ではなくなります。
      4. 上部と下部のチャネルからCR-1を取り外します。両方のチャンネルを100 μLのCR-2溶液で洗浄します。上部と下部のチャネルからCR-2溶液を取り除きます。
      5. 両方のチャンネルを100 μLの滅菌済みD-PBSで洗浄します。洗浄を2回繰り返します。両方のチャンネルに100 μLのD-PBSを添加します。チップの表面から余分なものを取り除きますが、チャネルは満杯のままにします。
   3. チャネルを細胞外マトリックスでコーティングします。
      1. このステップの直前に、フィブロネクチン、IVコラーゲン、および細胞培養マトリックスハイドロゲルを氷上で解凍し、このセクションの残りの部分ではこれらの溶液を氷上に保持します。
      2. チップの上部と下部のチャネル用に、次の細胞外マトリックス(ECM)溶液を調製します。
         トップチャンネル:1チップあたり200 μg/mLのIV型コラーゲンと100 μg/mLの細胞培養マトリックスハイドロゲル(D-PBS)。
         ボトムチャンネル:1チップあたり200 μg/mLのIV型コラーゲン100 μLとD-PBS中のフィブロネクチン30 μg/mL。
      3. 上下のチャンネルからD-PBSを完全に除去します。50 μL の ECM を下部チャネルの入口に、出口に液滴が現れるまで添加します。上のチャンネルについても繰り返します。各チャネルに適切なECMソリューションを使用し、最初に下部のチャネルにソリューションを追加してください。
      4. チップクレードルリザーバーにD-PBSを添加し、組織培養プレートの蓋を取り付けます。チップを加湿した37°C、5%_CO2 インキュベーターに一晩置きます。
4. 日(0):HIMECとエンテロイドでチップを播種
   1. 媒体の真空平衡化
      1. 実験を完了するために、必要な量のHIMEC培地とチップエキスパンション培地を滅菌済みの50 mLコニカルチューブに加えます。培地をウォーターバス中で37°Cに少なくとも1時間平衡化します。
      2. 真空ろ過装置を、温めた培地を含む50 mLチューブに接続します。チューブは、50 mLコニカルチューブの底に予熱した培地を向ける必要があります。-70kPa以上で10秒間真空にします。
      3. チューブをひっくり返して、メディアがフィルターを通過するようにします。5分間掃除機をかけ続けます。真空ろ過が完了したら、真空ろ過装置を取り外し、培地を含む50 mLチューブを37°Cのインキュベーターに入れます。
   2. チップの洗浄
      1. 予熱したHIMEC培地100 μLで洗い流して内皮チャネルを洗浄します。
         予熱したチップ膨張培地100 μLで洗い流して上皮チャネルを洗浄します。チップの表面に広がったメディアをすべて取り除きます。
      2. 洗浄ステップを繰り返します。メディアは、これらのフラッシュ後もチャネルと入口ポートと出口ポートに残す必要があります。チップの入った培養皿の蓋を元に戻し、使用できる状態になるまでインキュベーターに戻します。
   3. HIMECの収穫
      1. HIMECを含む25cm2フラスコから培地を吸引します。単分子膜をD-PBSでやさしく洗浄します。予熱した0.05%トリプシン-EDTA2 mLをフラスコに加え、単層の上で穏やかにすすいでください。
      2. フラスコを37°Cで2〜5分間インキュベートします。トリプシンを10 mLのHIMEC培地で中和します。細胞を培地に再懸濁し、15 mLチューブに移します。
      3. セル 150 x g で 4 °C で 5 分間スピンします。 細胞を200 μLのHIMEC培地に再懸濁します。
      4. 10 μLの細胞を取り除き、チューブを氷上に置きます。血球計算盤または自動セルカウンターを使用して細胞をカウントします。HIMECの所望濃度は、6 x 10 6〜8 x 10⁶細胞/mLである。
   4. HIMECをチップにシード
      1. インキュベーターからチップを取り出し、フードに入れます。チップの表面に漏れた可能性のあるメディアを吸引します。
      2. チップの上皮(上部)チャネルを、予熱した100 μLのチップエキスパンション培地で洗い流します。チップの内皮(下)チャネルを100 μLの予熱したHIMEC培地で洗い流します。
      3. HIMECを静かに再懸濁して、均一な分布を得ます。内皮(下)チャネルから培地を完全に除去します。10 μLのHIMEC(~36,000細胞/チップ)を内皮(下)チャネルに添加します。
         注:10 μLのHIMECを使用したときに気泡を形成せずにHIMECチャネルを満たすことが困難な場合は、添加するセルの量を増やしてください。チップあたりのセル数は同じにする必要があります。
      4. オルガノイド増殖培地がいっぱいでない場合は、上皮(上)チャネルにさらに追加します。HIMECの播種密度を確認します。それらが均一に分布しておらず、チップ表面の80%〜90%を覆わない場合は、チャネルをフラッシュしてシードを繰り返します。
      5. チップを細胞培養ディッシュのチップクレードルに反転させます。チップクレードルのリザーバーにD-PBSを追加します。蓋を細胞培養皿に戻し、インキュベーターに入れます。
      6. チップを37°Cで2〜3時間反転させて、HIMECがチップメンブレンに付着できるようにします。インキュベーションが完了したら、チップ/チップクレードルを直立位置に戻します。
      7. 内皮(下)チャネルを100 μLの温かいHIMEC培地で静かに洗浄します。メディアをチャネルに残します。上皮(上部)チャネルを100 μLのオルガノイド増殖培地で静かに洗浄します。メディアをチャネルに残します。
      8. チップを37°Cのインキュベーターに戻し、次のステップを完了します。
   5. エンテロイドの採取とチップ上での播種
      注:チップは、10〜14日前に分割され、50%〜75%のコンフルエントであり、継代7および20で播種されています。0日目のエンテロイドの出現については、 図2 を参照してください。エンテロイドが播種の準備が整うのに必要な時間は、特定の患者の細胞の増殖速度によって異なります。
      1. ウェルから培地を静かに吸引します。細胞培養マトリックスハイドロゲルを含むウェルを500 μLの温かいD-PBSで慎重に洗浄します。細胞培養マトリックスハイドロゲルを乱さないように注意してください。
      2. 各ウェルに250 μLのコールドセル回収溶液を添加します。新しいピペットチップで各ウェルの底を引っ掻き、細胞培養マトリックスハイドロゲルを破壊します。ウェルの内容物を氷上の冷たい15 mLチューブに加えます。
      3. チューブを氷上で45分間インキュベートし、3〜5分ごとにチューブを反転させます。このステップでは、腸内解離培地を調製します。この培地を37°Cのウォーターバスに入れ、インキュベーションステップに10分間残します。
      4. 300 x g で4°Cで5分間遠心分離し、エンテロイドをペレット化します。上澄みを取り除きます。
      5. 採取したプレート1枚あたり2 mLの腸内解離培地をペレットに加え、37°Cの水浴に60秒から120秒入れます。インキュベーション中にチューブを静かに渦巻きさせます。断片化されたエンテロイドを達成するのに十分な時間インキュベートしますが、単一細胞懸濁液に解離しません。
      6. インキュベーション後、各15 mLチューブに10 mLの冷組織洗浄培地を加えます。300 x g で4°Cで5分間遠心分離し、エンテロイドをペレット化します。上澄みを完全に吸引する。
      7. ペレットを200 μLのチップ膨張培地に再懸濁します。激しいピペッティング(P200ピペットで25~50回)でエンテロイドを解離します。
      8. 細胞を滅菌済みの1.5 mL微量遠心チューブに入れます。ピペットで静かに動かし、均質な溶液を形成します。目標は、10〜30個の細胞の小さなクラスターに断片化されたエンテロイドをチップに播種することです。
      9. 10 μLの細胞懸濁液を除去してカウントします。残りの細胞懸濁液を氷上に置く。チップエキスパンションメディアの容量を調整して、6 x 10⁶ cells/mL の濃度にします。
         注:エンテロイドを遠心分離し、必要な密度を達成するために、少量の培地に再懸濁する必要がある場合があります。
      10. マイクロ流体チップをフードに入れ、チップの上皮(上部)チャネルから培地を吸引します。チップの上部チャネルに 30 μL の再懸濁細胞(~180,000 細胞/チップ)をロードします。単層を形成するために、チップの上皮チャネルを完全かつ均一にカバーします。これが達成されない場合は、チップを通してエンテロイドをすすぎ、再シードします。
          注:複数のチップを装填する際に均一な懸濁液を得ることが困難な場合は、個々の 1.5 mL 微量遠心チューブでエンテロイドを 40 μL のアリコートに分離できます。これにより、ローディングの進行に伴うエンテロイド数とフラグメントサイズのばらつきが最小限に抑えられます。
      11. チップを細胞培養ディッシュのチップクレードルに戻します(チップが取り除かれている場合)。チップクレードルのリザーバーにD-PBSを追加します。蓋を細胞培養皿に戻し、チップを37°C、5%_CO2 で一晩置きます。
5. (1日目):ポッドの準備とチップへのフロー導入
   1. チップを組織培養フードに入れます。上皮チャネルを100 μLのチップ拡張培地で2回静かに洗い流します。100 μLのHIMEC培地で内皮チャネルを2回静かに洗い流します。チップ表面から余分なメディアを取り除きます。
   2. プライムポッドとメーカーのプロトコル³⁷に従って調整します。適切な培地2 mLをインレットリザーバーに加えます。適切な培地300 μLをアウトレットリザーバーに加えます。流量は30μL/hです。ストレッチはまだ開始されません。
6. (2日目):単層発生のモニタリングと培地の交換
   1. 培養モジュールを一時停止し、ポッドをフードに入れます。
   2. チップとポッドに気泡がないか調べます。位相差顕微鏡を使用して上皮単層を調べます。チップ全体の一貫した位置で画像をキャプチャして、進行状況を監視します。チップがポッドに残っている間を画像化します。
   3. 上部チャネルインレットリザーバーから培地を取り出し、2 mL のチップ分化培地と交換します。1 mLのHIMEC培地を下部チャネルインレットリザーバーに加えます。リザーバーの底がメディアの薄い層で覆われたままになるように、入口リザーバーに十分なメディアを残します。
   4. ポッドを培養モジュールに戻し、30 μL/h でフローを再開します。
7. (3日目):単分子膜の発達をモニタリングし、ストレッチを開始し、培地を追加する
   1. 手順 2.6.1.1 を繰り返します。および 2.6.1.2.上部チャネルインレットリザーバーにチップ分化培地を1 mL添加し、下部チャネルインレットリザーバーにHIMEC培地1 mLを添加します。
      メモ: 両方のチャネルのコンセントリザーバーが容量の50〜75%に達し始めたら、メディアを取り外します。
   2. ポッドを培養モジュールに戻します。30 μL/h でフローを再開し、2% のひずみと 0.2 Hz の周波数で伸長を開始します。
8. (4日目):単層の発達をモニタリングし、伸縮性を高め、培地を追加
   1. 手順 2.6.1.1 を繰り返します。および 2.6.1.2.上部チャネルインレットリザーバーにチップ分化培地を1 mL添加し、下部チャネルインレットリザーバーにHIMEC培地1 mLを添加します。
      メモ: 両方のチャネルのコンセントリザーバーが容量の50〜75%に達し始めたら、メディアを取り外します。
   2. ポッドを培養モジュールに戻します。30 μL/h でフローを再開し、伸張を 10% ひずみ、周波数 0.2 Hz まで上げます。
9. (5)日目から7日目:単層膜の発達をモニタリングし、培地を追加する
   1. 手順 2.6.1.1 を繰り返します。および 2.6.1.2.上部チャネルインレットリザーバーにチップ分化培地を1 mL添加し、下部チャネルインレットリザーバーにHIMEC培地1 mLを添加します。
   2. ポッドを培養モジュールに戻し、フローとストレッチを再開します。絨毛のような軸が可視化されたら、NEC-on-a-chipモデルに進みます。

3. NEC-on-a-chipモデル

1. 腸内細菌培養
   注:このステップでは、このプロトコルを開始する前に準備されたNEC患者からの腸内細菌の事前滴定凍結ストックが必要です。これらの実験には、以前に報告された重度の外科的NECの1人の患者からの多微生物腸内細菌スラリーが使用された³⁸。
   1. 腸内細菌の50%グリセロールストックを作り、さらに使用するまで-80°Cの冷凍庫で保管します。
   2. 腸内細菌のアリコートを解凍し、10 μLを3 mLのLuria-Bertani(LB)培地に接種します。37°Cでインキュベートし、150rpmで一晩振とうします。
   3. 同日に、予熱した抗生物質フリーのチップ分化培地100 μL(上のチャンネル)または予め温めた抗生物質を含まないHIMEC培地100 μL(下のチャンネル)でチャンネルを穏やかに洗浄します。培地を完全に吸引し、合計3回の洗浄でフラッシュを繰り返します。
   4. 3回目の洗浄を吸引した後、チャンネル内のメディアを交換し、そのままにしておきます。
   5. 上部および下部のチャネルインレットリザーバーを滅菌D-PBSで洗浄し、適切な抗生物質を含まない培地3 mLで満たします。2.5.2 のようにポッドをプライムし、調整します。
   6. チップを培養モジュールに戻し、延伸と流動を再開します。
   7. 翌朝、1 mLの細菌培養液を一晩採取し、25 mLの新鮮なLB培地に接種します。
   8. 1cmのキュベットで測定したOD₆₀₀ が0.6±0.02に達するまで、この新しい培養液を37°Cのシェーカーに戻します。細菌培養液を抗生物質不使用のチップ増殖培地で 7 x 10⁸ コロニー形成単位/mL に希釈します。
   9. この培養液のアリコートを保存して、接種菌³⁹の濃度を確認する。上皮の反応によっては細菌の濃度を調整する必要があるかもしれません。
   10. 上皮(上)チャネルから培地を取り除きます。抗生物質を含まないチップエキスパンション培地で希釈した細菌培養液30 μLをチップの上部チャネルに加えます。HIMEC(内皮)チャネルがバクテリアで二次汚染されないように十分に注意してください。チップの表面から余分なメディアを取り除きます。
   11. チップを30分間静的条件下に置いて、新生児上皮の頂端側への細菌の付着を促進します。インキュベーション後、上部チャネルを100 μLの抗生物質を含まない膨張培地で洗い流し、付着していない細菌を除去します。チップを培養モジュールに戻し、伸張と流動を再開します。
   12. 24時間ごとに培養モジュールからポッドを取り出し、100 μLの抗生物質を含まないチップ増殖培地を上皮チャネルからゆっくりと洗い流します。これは、細菌の異常増殖を防ぐのに役立ちます。

4. 腸管透過性試験

注:これは、プロトコル中のどのステップでも実行できます。チップの播種時に開始された場合、腸透過性アッセイを使用して単層コンフルエンスを連続的に評価できます。腸内細菌の添加時に開始された場合、このアッセイは、腸上皮単層の完全性に対する腸内細菌の影響を決定するために使用できます。

1. 上皮(上部)チャネルのインレットリザーバーから培地を取り除きます。透過性色素(50 μg/mL)を含む適切な培地をインレットリザーバーに添加します。NEC-on-a-chipモデルには抗生物質不使用のチップ識別培地を使用します。
2. 24時間ごとに上皮チャネルと内皮チャネルから廃液を収集します。Lanik et ^al.36 に従って、マイクロプレートリーダーを使用して透過性染料の濃度を定量化します。

5. 免疫組織化学

1. チップの下部チャネルと上部チャネルを200 μLのD-PBSで静かに洗浄します。チャンネルからD-PBSを完全に吸引します。
2. 両方のチャネルを4%パラホルムアルデヒドで洗い流し、チャネルに溶液を残して細胞を固定します。チップ表面から余分なものを吸引します。室温で30分間インキュベートします。
3. 両方のチャンネルを 200 μL の D-PBS で洗浄します。D-PBSは下チャンネルに残し、トップチャンネルから完全に取り外します。
4. 100 μLの0.1%界面活性剤溶液で上部チャネルを洗い流し、チャネルに溶液を残して上皮層を透過処理します。チップ表面から余分なものを吸引し、室温で45分間インキュベートします。
5. 両方のチャンネルを 200 μL の D-PBS で洗浄します。D-PBSは下チャンネルに残し、トップチャンネルから完全に取り外します。
6. 10%ロバ血清(または適切なブロッキング剤)を上部チャンネルに室温で1時間添加します。両方のチャンネルを 200 μL の D-PBS で洗浄します。D-PBSは下チャンネルに残し、トップチャンネルから完全に取り外します。
7. 一次抗体を5%ロバ血清で希釈し、チップのトップチャネルに添加します(以前に試験された抗体と濃度はLanik et ^al.36で入手可能です)。4°Cで一晩インキュベートします。
8. 200 μLのD-PBSで両方のチャンネルを3回洗浄します。D-PBSは下チャンネルに残し、トップチャンネルから完全に取り外します。
9. 希釈蛍光標識二次抗体は、D-PBSおよびHoechst 33342またはDAPI(核染色)中の5%ロバ血清中で1:200に希釈しました。二次抗体をチップのトップチャネルに添加します。光から保護して室温で1時間インキュベートします。
10. 200 μLのD-PBSで両方のチャンネルを3回洗浄します。最終洗浄後、D-PBSで満たされたチャンネルを残します。チップをD-PBSの入ったイメージングディッシュに入れ、共焦点顕微鏡で画像を取得します。
    注:固定チップは、染色済みまたは未染色で、PBSで4°Cで最大1週間保存できます。この期間中、チャネルが枯渇しないようにしてください。

6. RNAの単離、cDNAの調製、定量的リアルタイムPCR

1. チップの下部チャネルと上部チャネルを200 μLのD-PBSで静かに洗浄します。チャンネルからD-PBSを完全に吸引します。
2. メーカーの指示に従って、RNA抽出試薬を使用して細胞からトータルRNAを抽出します。上皮からのみRNAを単離するには、トップチャネルのみから注入します。
3. ナノボリューム分光光度計を使用してRNA濃度を定量します。1 μgのトータルRNAを逆転写します。定量的リアルタイムPCRを実施します。このモデルで以前に使用されたプライマーは、Lanik et al. ³⁶で入手可能である。

Results

エンテロイドをマイクロ流体デバイス(図1)に播種し、上記のように培養した。播種前の細胞培養マトリックスハイドロゲルにおけるエンテロイドの増殖、およびその後の播種後の腸上皮細胞単層の拡張を明視野顕微鏡でモニターしました(図2)。合流した腸管上皮細胞単層が形成され、その後、成熟した3D絨毛様構造に発達しました(図2)。エンテロイド由来の新生児腸上皮とHIMECを播種したこのマイクロ流体デバイスは、新生児腸チップモデル³⁶として知られています。

NEC-on-a-chipモデルは、新生児NEC中に存在する微生物嚥下障害を再現するために開発されました。このモデルには、重度のNECの新生児由来の細菌叢異常微生物叢を新生児腸チップモデルに追加することが含まれます。この細菌叢異常微生物叢を追加することで、腫瘍壊死因子α(TNFα;

Discussion

このNEC-on-a-chipシステムは、NECの病態生理学をモデル化するために使用できる強力な新しいツールです。このプラットフォームは、連続的な管腔の流れとストレッチを備えた共培養システムを組み込むことにより、以前のモデルよりも in vivo 腸環境によく似た複雑な微小環境を提供します。これらの条件は、成熟した上皮サブタイプとタイトジャンクションからなる高度に分極された上皮によって裏打ちされた3D絨毛様構造の発達を促進します(図2)³⁶。さらに、頂端上皮表面は、患者由来の微生物叢や新しい治療法などの実験刺激への曝露のために簡単にアクセスできます。最後に、このモデルは、関連する患者集団に由来するエンテロイドを利用して、さまざまな炎症性および非炎症性の腸疾患、および正常な腸上皮発生のメカニズムを研究するためにも使用できます。このモデルでは、新生児の腸サンプルの入手可能性とサイズが限られていることを考えると、単一の患者サンプルからのデータ取得を最大化することができます。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
[Leu15]-Gastrin I human	Sigma-Aldrich	G9145
A 83-01	Sigma-Aldrich	SML0788
Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12	Gibco	12634010
B-27 Supplement, serum free (50x)	Gibco	17504044
Basic Bio-kit	Emulate	N/A
BioTek Synergy 2 マルチモード マイクロプレート リーダー	Agilent	7131000
ブランドメタクリレート (PMMA) キュベット、セミマイクロ	BrandTech	759085D
細胞回収ソリューション	コーニング	354270
CFX Opus リアルタイム PCR システム	バイオ・ラッド	12011319
チップ クレードル	エミュレート	N/A
チップ-S1 ストレッチャブル チップ	エミュレート	N/A
CHIR99021	Sigma-Aldrich	SML1046
Clear TC処理マルチプルウェルプレート、  48ウェル	Corning	3548
コラーゲン ヒト胎盤由来	Sigma-Aldrich	C5533
コラゲナーゼ、I型、粉末	Gibco	17018029
Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit	Cell Biologics	H-1168
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mL	Fisher Scientific	05-539-12
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mL	Fisher Scientific	05-539-8
Countess Cell Counting Chamber Slides	Invitrogen	C10283
Countess II 全自動セルカウンター	Invitrogen
DAPT	Sigma-Aldrich	D5942
Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, アニオン性, リジン固定性	Invitrogen	D7132	透過性染料
ジメチルスルホキシド(DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
使い捨てPESフィルターユニット、0.2um aPES膜	ッシャーサイエンティフィック	FB12566504
DMEM / F-12	ギブコ	11320033
ロバ血清	シグマアルドリッチ	D9663
ダルベッコ&プライム;sモディファイドイーグル&プライム;sミディアム - 高グルコース	Sigma-Aldrich	D5796
Dulbecco′リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)	Gibco	14190-136
EDTA, 0.5 m,  pH 8.0	Corning	46-034-CI
ER-1 表面活性化試薬	エミュレート	ER-1	チップ活性化試薬 1
ER-2 表面活性化試薬	ER-2	チップ活性化試薬2
ブロネクチンヒトタンパク質、血漿	Gibco	33016015
Fisherbrandをエミュレート 透明な蓋付きペトリ皿、100mm	ッシャーサイエンティフィック	FB0875713
ゼラチンベースのコーティング溶液	Cell Biologics	6950
Genie Temp-Shaker 300	Scientific Industries, Inc.	SI-G300
ゲンタマイシン	Gibco	15750060
HEPES、液体1M溶液(238.3 mg / mL)	Corning	25-060-CI
Hoechst 33342、三塩酸塩、三水和物	Invitrogen	H3570
ヒトコラーゲンI型	Sigma-Aldrich	CC050
ヒト初代小腸微小血管内皮細胞	細胞生物学的製剤	H-6054
倒立顕微鏡	Fisher Scientific	03-000-013
Isotemp General Purpose Deluxe Water Baths	Fisher Scientific	FSGPD10
L-グルタミン	Gibco	25030-081
ルリアブロス (LB) 寒天、Miller	Supelco	L3027
L-WRN 細胞	American Type Culture Collection	CRL-3276
マトリゲル成長因子還元基底膜マトリックス、LDEVフリー	Corning	356231	Cell Culture Matrix
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502048
N-アセチル-L-システイン	Sigma-Aldrich	1009005
NAILSTAR UV LAMP	NailStar	NS-01-US
NanoDrop OneC 微量UV-Vis分光光度計	Thermo Scientific	840-274200
ニコチンアミド	Sigma-Aldrich	72340
Orb-HM1 ハブモジュール	エミュレート	N/A
パラホルムアルデヒド	ThermoFisher	047392.9L
ペニシリン-ストレプトマイシン	Gibco	15140122
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)	Gibco	10010023
Pipet-Lite マルチピペット L8-200XLS+	レイニン	17013805
ピペットチップ TR LTS 1000µL S 768A/8	レイニン	17014966
ポッド ポータブル モジュール	エミュレート	N/A
プレミアム グレード ウシ胎児血清 (FBS)(熱不活性化)	Avantor Seradigm	1500-500
QuantiTect 逆転写キット	QIAGEN	205313
組換えマウス上皮成長因子 (EGF)	PeproTech	315-09
SB 431542	Tocris	1614
Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated	コーニング	431111
SsoAdvanced Universal SYBR グリーン スーパーミックス	バイオ・ラッド	1725271
Steriflip-GV 滅菌遠心分離チューブトップフィルターユニット	ミリポア	SE1M179M6
滅菌細胞ストレーナー、70um	フィッシャー・サイエンティフィック	22-363-548
滅菌シリンジ、10mL	フィッシャー・サイエンティフィック	14-955-453
ストレート、ファイン、シャープポイントはさみ	ミルテックス 機器	MH5-300
Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD 遠心分離機	Thermo Scientific	75016052
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	界面活性剤
TRIzol 試薬	Invitrogen	15596026	RNA 抽出試薬
Trypan Blue Solution、0.4% (w/v) in PBS、pH 7.5 ± 0.5	Corning	25-900-CI
TrypLE Express Enzyme (1X)、フェノールレッドなし	Gibco	12604013	酵素解離試薬
トリプシン-EDTA溶液	Sigma-Aldrich	T4174
VIOS 160i CO2 インキュベーター、165 L	Thermo Scientific	13-998-252
Y-27632	Tocris	1254
Zoë-CM1 培養モジュール	エミュレート	N/A