方法論記事

ヒト新生児腸管内腸内細菌叢と腸内細菌叢異常体を組み込んだ壊死性腸炎のマイクロ流体モデル

DOI：

10.3791/65605

⸱

2023年7月28日

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1Division of Neonatal-Perinatal Medicine, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2University of Nebraska College of Medicine, 3Department of Surgery, Washington University School of Medicine

この記事について

サマリー

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このプロトコルは病気の病因に機構の調査に使用することができる壊死性腸炎(NEC)の 生体外の モデルを記述する。ヒト新生児の腸、内皮細胞、および重度のNECの新生児の腸内細菌叢に由来する腸内エンテロイドをシードしたマイクロ流体チップを特徴としています。

要約

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壊死性腸炎(NEC)は、重篤で致命的な可能性のある腸疾患であり、その複雑な病因のために研究が困難であり、完全には理解されていません。NECの病態生理には、腸管タイトジャンクションの破壊、腸管バリア透過性の増加、上皮細胞死、微生物嚥下障害、および調節不全炎症が含まれます。NECを研究するための従来のツールには、動物モデル、細胞株、ヒトまたはマウスの腸管オルガノイドが含まれます。これらのモデルシステムを用いた研究は、疾患の病態生理学に関するこの分野の理解を深めてきましたが、ヒトNECの複雑さを再現する能力は限られています。現在、マイクロ流体技術を用いたNECの改良型in vitro モデル「NEC-on-a-chip」が開発されています。NEC-on-a-chipモデルは、早産児由来の腸管エンテロイドを播種し、ヒト内皮細胞と重症NEC乳児のマイクロバイオームを共培養したマイクロ流体デバイスで構成されています。このモデルは、NECの病態生理機構を研究するための貴重なツールであり、新生児腸疾患の創薬試験のための新しいリソースです。本稿では、NEC-on-a-chipモデルについて詳細に説明する。

概要

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壊死性腸炎(NEC)は早産児に影響を及ぼし、体重が1500g<生まれた乳児の発生率は最大10%です1。NECの病態生理は複雑で、腸管上皮の損傷、腸管タイトジャンクションの破壊、腸管バリア透過性の増加、免疫調節不全、上皮細胞死などが含まれます2,3。NECの発症機序の解明は未だに不完全であり、何十年にもわたる研究にもかかわらず、有効な標的療法は未だに存在しません。

NECの研究を進める上での大きな障壁は、ヒトの乳児から分離された一次腸組織が限られていることとサイズが小さいことです。NECの乳児から切除された腸組織は、しばしば壊死し、重度の損傷を受けるため、疾患発症に先行するメカニズムの研究は複雑です。例えば、NECの乳児の小腸には免疫細胞が氾濫し、腸管幹細胞の減少、上皮細胞の増殖の減少、上皮細胞のアポトーシスの増加も観察されます4,5,6,7。これにより、これらのサンプルから腸管上皮細胞を培養したり、この敵対的な炎症環境で分解される可能性のあるRNAやタンパク質....

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プロトコル

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エンテロイドは、NECまたは非炎症性病因を有する他の腸疾患の手術時に得られた未熟児(妊娠22〜36週で出生)の小腸サンプルに由来する。すべての検体の収集と処理は、セントルイスのワシントン大学(IRBプロトコル番号201706182および201804040)およびノースカロライナ大学チャペルヒル校(IRBプロトコル番号21-3134)の治験審査委員会からのインフォームドコンセントと承認の後に行われました。

1. ヒト新生児小腸からの陰窩の単離とメッキによるエンテロイドの樹立

  1. 培地調製
    1. 表 1 の説明に従って、必要なすべてのメディアを準備します。すべての培地の調製に無菌技術が使用されていることを確認してください。0.2μmのフィルターで培地をろ過滅菌し、使用するまで4°Cで保存してください。
  2. 腸組織の洗浄とミンチ
    1. 細胞培養マトリックスハイドロゲルを氷上に置き、解凍します。手術室からヒトの腸組織を採取する。直ちにサンプルを5 mLの氷冷組織洗浄培地に置き、内因性プロテアーゼを不活性化します。
    2. トリミングされたP1000ピペットチップを取り付けた10 mLシリンジを使用して、氷冷したダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(D-PBS)で腸内容物を洗い流します。腸組織を5 mLの氷冷D-PBSを含む35 mmの皿....

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結果

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エンテロイドをマイクロ流体デバイス(図1)に播種し、上記のように培養した。播種前の細胞培養マトリックスハイドロゲルにおけるエンテロイドの増殖、およびその後の播種後の腸上皮細胞単層の拡張を明視野顕微鏡でモニターしました(図2)。合流した腸管上皮細胞単層が形成され、その後、成熟した3D絨毛様構造に発達しました(図2)。エンテロイド由来の新生児腸上皮とHIMECを播種したこのマイクロ流体デバイスは、新生児腸チップモデル36として知られています。

NEC-on-a-chipモデルは、新生児NEC中に存在する微生物嚥下障害を再現するために開発されました。このモデルには、重度のNECの新生児由来の細菌叢異常微生物叢を新生児腸チップモデルに追加することが含まれます。この細菌叢異常微生物叢を追加することで、腫瘍壊死因子α(TNFα;

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ディスカッション

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このNEC-on-a-chipシステムは、NECの病態生理学をモデル化するために使用できる強力な新しいツールです。このプラットフォームは、連続的な管腔の流れとストレッチを備えた共培養システムを組み込むことにより、以前のモデルよりも in vivo 腸環境によく似た複雑な微小環境を提供します。これらの条件は、成熟した上皮サブタイプとタイトジャンクションからなる高度に分極された上皮によって裏打ちされた3D絨毛様構造の発達を促進します(図2)36。さらに、頂端上皮表面は、患者由来の微生物叢や新しい治療法などの実験刺激への曝露のために簡単にアクセスできます。最後に、このモデルは、関連する患者集団に由来するエンテロイドを利用して、さまざまな炎症性および非炎症性の腸疾患、および正常な腸上皮発生のメカニズムを研究するためにも使用できます。このモデルでは、新生児の腸サンプルの入手可能性とサイズが限られていることを考えると、単一の患者サンプルからのデータ取得を最大化することができます。

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開示事項

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著者は、この原稿に関連する利益相反がないことを宣言します。

謝辞

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この原稿は、ノースカロライナ大学チャペルヒル校への寄付者の寛大な支援を通じて、米国国立衛生研究所のR01DK118568(MG)、R01DK124614(MG)、およびR01HD105301(MG)、Chan Zuckerberg Initiative Grant 2022-316749(MG)、Thrasher Research Fund Early Career Award(LCF)、UNC Children's Development Early Career Investigator Grant(LCF)の支援を受けました。 ノースカロライナ大学チャペルヒル校の小児科。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
[Leu15]-Gastrin I humanSigma-AldrichG9145
A 83-01Sigma-AldrichSML0788
Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12Gibco12634010
B-27 Supplement, serum free (50x)Gibco17504044
Basic Bio-kitEmulateN/A
BioTek Synergy 2 マルチモード マイクロプレート リーダーAgilent 7131000
ブランドメタクリレート (PMMA) キュベット、セミマイクロBrandTech759085D
細胞回収ソリューションコーニング354270
CFX Opus リアルタイム PCR システムバイオ・ラッド12011319
チップ クレードルエミュレートN/A
チップ-S1 ストレッチャブル チップエミュレートN/A
CHIR99021Sigma-AldrichSML1046
Clear TC処理マルチプルウェルプレート、  48ウェル Corning3548
コラーゲン ヒト胎盤由来Sigma-AldrichC5533
コラゲナーゼ、I型、粉末Gibco17018029
Complete Human Endothelial Cell Medium with Kit Cell BiologicsH-1168
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 15 mLFisher Scientific05-539-12
Conical Polypropylene Centrifuge Tubes, 50mLFisher Scientific05-539-8
Countess Cell Counting Chamber SlidesInvitrogen C10283
Countess II 全自動セルカウンターInvitrogen 
DAPTSigma-AldrichD5942
Dextran, Cascade Blue, 3000 MW, アニオン性, リジン固定性Invitrogen D7132透過性染料 
ジメチルスルホキシド(DMSO)Sigma-AldrichD8418
使い捨てPESフィルターユニット、0.2um aPES膜ッシャーサイエンティフィックFB12566504
DMEM / F-12ギブコ11320033
ロバ血清シグマアルドリッチD9663
ダルベッコ&プライム;sモディファイドイーグル&プライム;sミディアム - 高グルコースSigma-AldrichD5796
Dulbecco′リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)Gibco14190-136
EDTA, 0.5 m,  pH 8.0Corning46-034-CI
ER-1 表面活性化試薬エミュレートER-1チップ活性化試薬 1
ER-2 表面活性化試薬 ER-2チップ活性化試薬2
ブロネクチンヒトタンパク質、血漿Gibco33016015
Fisherbrandをエミュレート 透明な蓋付きペトリ皿、100mmッシャーサイエンティフィックFB0875713
ゼラチンベースのコーティング溶液 Cell Biologics6950
Genie Temp-Shaker 300Scientific Industries, Inc.SI-G300
ゲンタマイシン Gibco15750060
HEPES、液体1M溶液(238.3 mg / mL)Corning25-060-CI
Hoechst 33342、三塩酸塩、三水和物 InvitrogenH3570
ヒトコラーゲンI型Sigma-AldrichCC050
ヒト初代小腸微小血管内皮細胞細胞生物学的製剤H-6054
倒立顕微鏡Fisher Scientific03-000-013
Isotemp General Purpose Deluxe Water BathsFisher ScientificFSGPD10
L-グルタミン Gibco25030-081
ルリアブロス (LB) 寒天、MillerSupelcoL3027
L-WRN 細胞 American Type Culture CollectionCRL-3276
マトリゲル成長因子還元基底膜マトリックス、LDEVフリー Corning356231Cell Culture Matrix
N-2 Supplement (100x)Gibco17502048
N-アセチル-L-システインSigma-Aldrich1009005
NAILSTAR UV LAMPNailStarNS-01-US
NanoDrop OneC 微量UV-Vis分光光度計Thermo Scientific840-274200
ニコチンアミドSigma-Aldrich72340
Orb-HM1 ハブモジュールエミュレートN/A
パラホルムアルデヒドThermoFisher047392.9L
ペニシリン-ストレプトマイシン Gibco15140122
リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)Gibco10010023
Pipet-Lite マルチピペット L8-200XLS+レイニン17013805
ピペットチップ TR LTS 1000µL S 768A/8レイニン17014966
ポッド ポータブル モジュールエミュレートN/A
プレミアム グレード ウシ胎児血清 (FBS)(熱不活性化) Avantor Seradigm1500-500
QuantiTect 逆転写キット QIAGEN205313
組換えマウス上皮成長因子 (EGF)PeproTech315-09
SB 431542Tocris1614
Square BioAssay Dish with Handles, not TC-treated コーニング431111
SsoAdvanced Universal SYBR グリーン スーパーミックスバイオ・ラッド1725271
Steriflip-GV 滅菌遠心分離チューブトップフィルターユニットミリポアSE1M179M6
滅菌細胞ストレーナー、70umフィッシャー・サイエンティフィック22-363-548
滅菌シリンジ、10mLフィッシャー・サイエンティフィック14-955-453
ストレート、ファイン、シャープポイントはさみミルテックス 機器MH5-300
Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD 遠心分離機Thermo Scientific75016052
Triton X-100 Sigma-AldrichT8787界面活性剤
TRIzol 試薬 Invitrogen15596026RNA 抽出試薬
Trypan Blue Solution、0.4% (w/v) in PBS、pH 7.5 ± 0.5Corning25-900-CI
TrypLE Express Enzyme (1X)、フェノールレッドなし Gibco12604013酵素解離試薬
トリプシン-EDTA溶液Sigma-AldrichT4174
VIOS 160i CO2 インキュベーター、165 LThermo Scientific13-998-252
Y-27632Tocris1254
Zoë-CM1 培養モジュールエミュレートN/A
AMQAX1000フィフィフィ (英語)

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alsaied, A., Islam, N., Thalib, L. Global incidence of Necrotizing Enterocolitis: a systematic review and Meta-analysis. BMC Pediatrics. 20 (1), 344(2020).
  2. Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. The New England Journal of Medicine. 364 (3),....

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