糸状シアノバクテリアのタイムラプス顕微鏡分析のための垂直固定化法

サマリー

我々は、XY平面における糸状シアノバクテリアの可視化のための簡単でアクセスしやすい方法を提示する。低融点のアガロースマトリックスを使用し、垂直方向で分裂に関与するタンパク質の画像を取得できるようにしました。したがって、この方法論は、任意の糸状生物および異なる種類のタンパク質に適用することができる。

要約

細菌細胞分裂の主なイベントは、タンパク質FtsZが重要な要素である分離プロセスです。FtsZは重合し、細胞の中央にリング状の構造(Zリング)を形成し、他の分裂タンパク質の足場として機能します。細菌モデル である大腸 菌と 枯草菌 の超解像顕微鏡では、Zリングが不連続であることが示され、ライブセルイメージング研究では、FtsZがトレッドミルと呼ばれるメカニズムによってリングに沿って移動することが示されました。 in vivoでのFtsZのダイナミクスを研究するには、XY平面内のリングの完全な構造をイメージングするために、垂直位置での特別な細胞配置が必要です。 Anabaena sp. PCC7120などの多細胞シアノバクテリアにおけるFtsZイメージングの場合、細胞のサイズとフィラメントの長さのために、フィラメントを垂直位置に維持することは困難です。本稿では、低融点アガロースとシリンジを用いて Anabaena sp. PCC 7120フィラメントを垂直固定化し、FtsZ-sfGFP融合タンパク質を発現する変異体でZリングを記録する方法について説明します。この方法は、共焦点顕微鏡を使用して分裂部位のタンパク質動態を登録するための迅速かつ安価な方法です。

概要

細菌の細胞分裂は、母細胞が2つの娘細胞を生成するプロセスであり、ほとんどの場合、二元分裂として知られるメカニズムによるものです。分離プロセスにおける最も初期のイベントの1つは、細胞¹の中央でのFtsZの局在化です。チューブリン²と構造的に相同なこのタンパク質は、ほとんどの細菌に保存され、広く分布しており、その重合はZリング³として知られる収縮構造を生成します。このリングは、他の分裂タンパク質の足場として機能し、一緒になってディビソームと呼ばれる分子機構を形成します。いくつかの研究は、Zリングが非常に動的であり、FtsZプロトフィラメントがトレッドミルによって動くことを示しています^4,5,6。タイムラプス実験でZリングを研究するには、より良い分解能と迅速なサンプリングのために、分割サイトをXY平面に記録することをお勧めします。これを達成するためには、マイクロホールセルトラップや複雑なマイクロ流体デバイス⁷のナノファブリケーションを一般的に含む垂直細胞固定化法を開発する必要がある。

シアノバクテリアは、その細胞形態によってグラム陰性に分類される光合成微生物です。しかし、系統発生的にはグラム^{陽性菌に近い}8。これらの生物は、グラム陽性菌とグラム陰性菌に共通する細胞分裂遺伝子を持っていますが、それらの分割体には固有の要素も含まれています⁹。Anabaena sp. PCC 7120(以下、Anabaena sp.)は、1つの分裂面を持つ糸状藍藻であり、多細胞藍藻の細胞分裂研究のモデルである。この菌株では、細胞¹⁰の途中におけるFtsZの位置を決定することができた。それにもかかわらず、このモデルにおけるFtsZのin vivoダイナミクスを示す研究はありません。私たちの研究室では、三親交配と相同組換えにより、完全な内因性ftsZ遺伝子に置き換わるsfGFPに融合したFtsZタンパク質を発現するアナバエナ属の完全分離変異体を取得しました。我々は、糸状藍藻の分裂タンパク質を可視化するためのタイムラプス実験のために、変異株フィラメントの垂直配向を支持する迅速かつ簡便な細胞固定化法を開発しました。この方法は、高価で開発が困難なマイクロ流体デバイスを必要としません。一例として、このプロトコルを使用して、共焦点顕微鏡によってFtsZ-sfGFP変異体のZリングを視覚化しました。

プロトコル

1. 細胞モデルの考察と選択

注:シアノバクテリアは、光合成色素の存在により強い自家蛍光を発します。このシグナルはスペクトルの赤色部分にあり、したがって、シアノバクテリアにおけるイメージングに適した蛍光タンパク質は、赤色発光からかけ離れたものである。たとえば、GFP、YFP、金星、ターコイズ、BFPなどです。

1. 対象の糸状シアノバクテリア株に存在する二種成分を選択する。実験のためには、蛍光タンパク質に融合した選択されたディビソーム成分を発現する糸状シアノバクテリア変異体を構築する必要がある。このプロトコルでは、FstZ-sfGFPを発現する アナバエナ 属変異体を例に挙げる。この菌株は、 大腸菌¹¹との三親交配によって得られた。
2. 使用する変異体の分離レベルを確認します。実施例において、単析は、標的遺伝子のPCR増幅により決定した。このプロトコルで使用されるFtsZ-sfGFP変異体は、野生型 ftsZ遺伝子を欠く完全に分離された株です。

2.成長条件

1. 固定期の10 mL培養( アナバエナ 種については25°Cで常時光で約14日間増殖)を使用し、抗生物質を添加したBG11培地90 mL(FtsZ-sfGFP変異体の場合はスペクチノマイシンおよびストレプトマイシン10 μl ^ml-1 )を加えて、変異体の新しい継代培養を行います。
2. 指数関数的段階に達するまで、新しい細胞培養物を一定の光と最適な温度で増殖させます。 アナバエナ 属のFtsZ-sfGFP変異体は、サンプル調製前に25°Cで7日間増殖させます。

3. アガロースマトリックスでのサンプル調製

1. ホモジナイズした増殖培養物を2mL取ります。
2. 2,500 x g で室温で10分間遠心分離します。
3. その間に、50 mLフラスコ中で、3%低融点アガロース30 mLをBG11液体培地中で加熱する。中程度の電力レベルに設定されたマイクロ波を使用し、完全に溶解するまで15秒ごとに溶液をチェックします。37°Cまで冷却するために取っておきます。
   注:汚染を避けるために、アガロースの溶液をオートクレーブします。
4. 遠心分離が完了したら、1.9 mLの上清を廃棄し、少なくとも3回上下にピペッティングして残りの容量の細胞を再懸濁します。
5. 再懸濁した細胞を900 μLの3%アガロース溶液と少なくとも3回ピペッティングして混合します。
   注:アガロース溶液は液体でなければなりませんが、細胞の損傷を避けるために熱すぎてはいけません。次のステップは、アガロース溶液が粘稠度=のようなゲルを形成する前に、迅速に実行する必要があります。
6. 1 mLシリンジでアガロースマトリックスを慎重に吸引します。サンプルがシリンジで吸引されている間は、気泡の発生を避けることが重要です。
   注意: この手順の前に、シリンジの先端が狭い入口穴をなくすために切断されていることを確認してください。
7. シリンジを室温で2時間水平位置に置いて、サンプルとアガロースの混合物を固化させます。
8. プランジャーを使用してアガロースマトリックスを慎重に取り外し、清潔で平らな面に置きます。
9. 固化したサンプルを0.5〜1 mmの厚さ範囲でスライスにカットし、マトリックスの完全性を維持します。
   注意: より良い結果を得るには、メスまたは薄いかみそりの刃を使用してアガロースマトリックスを切断します。
10. スライスをカバーガラスに並べて置きます。カバーガラス上のディスクの数は、その寸法によって異なります。
    注:タイムラプス顕微鏡では、顕微鏡分析用に作られた細胞チャンバー(アトフルーまたはチャムライド磁気チャンバーなど)を使用することをお勧めします。これらのチャンバーは、脱水を回避するサンプルの取得を可能にします。この例では、サンプルはAttofluorチャンバーを使用して丸みを帯びたカバーガラス(25 mm)で準備されます。
11. 脱水を防ぐために、チャンバーに入れたサンプルに2 mLの溶融3%アガロース溶液を加えます。
12. アガロース溶液が完全に固化してゲルを形成するまで待ちます。

4. 画像取得

1. パラメータを標準化して、変異株中の目的の蛍光タンパク質を共焦点顕微鏡で可視化します。顕微鏡が自家蛍光と選択した蛍光マーカーの両方を検出できることを確認してください。
2. 最大倍率で明視野コンフォメーションでサンプルを視覚化し、 図1に示すように垂直方向のフィラメントを検索します。
3. Z平面に沿った自家蛍光シグナルを使用した初期スキャンで、目的の分割部位を見つけます。
4. 蛍光タンパク質マーカーのパラメータを使用して、分裂部位における目的のタンパク質のシグナルを可視化します。
5. 生体モデルと目的のタンパク質に応じてタイムラプス実験を行います。例えば、この場合、50秒で10秒のタイムラプス実験を行い、 アナバエナ 属のZリングに沿ったFtsZのダイナミクスを記録しました(図2)。

結果

垂直固定化法を用いた アナバエナ 属のZリングの可視化
細菌のZリング成分の動態を調べるためには、垂直方向の細胞で画像を取得する必要があります。この位置では、Z環とディビソームの主要タンパク質を可視化し、タイムラプス顕微鏡でタンパク質の動態をモニタリングすることができます。細菌の古典的なサンプル調製は、糸状シアノバクテリアには機能しません。 Anabaena sp.の場合、フィラメントはZリングを視覚化できない位置に配向しています。さらに、長期間にわたって単一細胞内の細胞分裂タンパク質を正しく可視化するためにフィラメントを固定化しておくことはできません。そこで、 アナバエナ 属のFtsZ-sfGFP変異体のZ環を可視化するために、LMPアガロースとサンプルの水平インキュベーションを用いたプロトコルを開発し、標準化しました。このプロトコルにより、以前に使用された手順と比較して、より高い割合の垂直配向フィラメントを得ることができます(図1)。したがって、カバーガラスと直接接触した変異株の細...

ディスカッション

ディビソームタンパク質の動態の研究は間違いなく挑戦です。特に糸状藍藻では、細胞を垂直に配向させる水平面内のZリングを可視化することが課題の一つである。ここで説明した方法では、XY平面内のZリングを配置してさまざまな分析を実行できます。これは、Zリングの完全な可視化を可能にする糸状シアノバクテリアの最初の簡単な方法です。

このプロトコルはシンプルで高速ですが、低融点アガロースは細胞溶液と混合するのに十分な流動性を得るために適切な温度になければならないため、アガロースマトリックスのサンプル調製ステップでは特別な注意を払う必要があります。同時に、アガロース溶液は細胞の損傷を引き起こす可能性があるため、温かすぎてはいけません。考慮すべきもう一つの重要なステップは、慎重に行わないとマトリックスが崩壊してサンプルを損傷する可能性があるため、ディスクの切断です。

この方法を使用すると、垂直位置のフィラメントの割合は、従来のプロトコルよりも高くなります。しかしながら、統計分析を確実にするために、できるだけ多くのディスク、すなわち垂直位置にあ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1mlシリンジ	青島アグナメディカルテクノロジー株式会社	-	1mlの針が付いた使い捨ての医療用プラスチック注射器は、一般的に液体または注射液をポンプで送るために使用され、この実験ではサンプルを吸引して重合させるために使用されます。
Attofluor Cell Chamber	ThermoFischer Scientific	A7816	Attofluor Cell Cameraは、直立顕微鏡または倒立顕微鏡で生細胞サンプルを見るために設計された、耐久性と実用的なカバースリップホルダーです。
Axygen MaxyGene II サーマルサイクラー 96ウェルブロック	CORNING	THERM-1001	新しいMaxyGene II サーマルサイクラーは、速度と高度な機能を向上させ、Axygenブランドの製品に期待されるプレミアムなパフォーマンスを提供します。独自の柔軟なプログラミング。迅速な実行時間。従来のグラディエントサイクラーよりもワークフローが改善されました。最大5°Cまでの上昇率。C/秒調整可能な加熱蓋は、ストリップ、チューブ、マイクロプレートを収納できます。
フィッシャーブランドカバーグラス:サークルサー	モフィッシャーサイエンティフィ	12-546-2P	最高級の光学ホウケイ酸ガラス製で、均一な厚さとサイズです。円形。耐腐食性.
低融点アガロー	プロメガ	V3841	ガロース、低融点、分析グレードは、ゲル電気泳動後に無傷のDNA断片の回収を必要とするアプリケーションに最適です。
Zeiss Airyscan ZeissのLSM 880顕微鏡		-	Zeiss Airyscan LSM 880顕微鏡は、解像度制限(横方向解像度~120nm、軸方向解像度~350nm)で画像を取得できるレーザー走査型焦点顕微鏡です。検出器は高感度で、超解像画像を高速に取得することが可能です。
マイクロセントífuga Fresco 17	ThermoFischer Scientific	75002402	機能付きの標準微量遠心分離機で、最大17,000 gのルーチンサンプル調製プロセスをスピードアップします。これらの微量遠心分離機は、使いやすくコンパクトな設計のラボ用機器で、生産性、汎用性、安全性、利便性を提供します。
ニコンタイムラプス顕微鏡	ニコン	-	ニコンC2レーザー走査型共焦点顕微鏡は、インキュベーションチャンバーによりサンプルを8時間以上最適な状態に保つことができるため、長期のタイムラプスに理想的な顕微鏡です。
薄いカミソリの刃Schick Super Chromium	Farmazon	SKU: 401146	細いカミソリの刃でアガロースマトリックスを切断し、マトリックスの完全性を維持しながらサンプルを含むディスクを得ることができます。