ここでは、ガスクロマトグラフィー質量分析のために、サンゴのホロビオントからの極性および半極性代謝産物の抽出と調製、ならびに分離されたサンゴの宿主組織とSymbiodiniaceae細胞分画を紹介します。
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この記事について
サマリー
要約
ガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)ベースのアプローチは、刺胞動物と渦鞭毛藻の共生の代謝基盤と、サンゴがストレス(つまり、温度による白化)にどのように応答するかを解明するのに強力であることが証明されています。刺胞動物の宿主とそれに関連する微生物(Symbiodiniaceaeと他の原生生物、細菌、古細菌、真菌、ウイルス)で構成されるサンゴのホロビオントの定常状態代謝物プロファイリングは、サンゴの全体的な代謝状態を特徴付けるために、環境条件およびストレス条件下でうまく適用されています。
しかし、共生相互作用をめぐる疑問に答えるためには、サンゴの宿主とその藻類共生生物の代謝物プロファイルを独立して解析する必要があり、これは組織の物理的な分離と単離、それに続く独立した抽出と分析によってのみ達成できます。メタボロミクスの応用はサンゴ分野では比較的新しいものですが、研究グループの継続的な努力により、サンゴの宿主組織と藻類共生生物の分離など、サンゴの代謝物を分析するための堅牢な方法が開発されました。
このホワイトペーパーでは、GC-MS 分析のためのホロビオント分離と代謝物の抽出について、検討すべき重要な最適化ステップを含め、ステップバイステップで説明します。2つの分画(サンゴとシンビオディニア科)の複合代謝物プロファイルが全体(ホロビオント)のプロファイルと類似していることを、独立して分析すると、組織を分離することで、全体だけでは得られない2つのパートナーの代謝と相互作用に関する重要な情報も得ることができることを実証します。
概要
代謝産物は細胞プロセスの最終生成物を表し、メタボロミクス(特定の生物または生態系によって生成される一連の代謝産物の研究)は、生物の機能の直接的な尺度を提供できます1。これは、ほとんどの管理戦略の目標は特定の生態系サービス機能を維持(または回復)することであるため、生態系、共生相互作用、および回復ツールを探求するために特に重要です2。サンゴ礁は、共生相互作用を解明し、サンゴの生理学的応答をコミュニティレベルおよび生態系レベルの影響に結びつけるためのメタボロミクスの潜在的な価値を実証する水生生態系の1つです3。ハイスループットガスクロマトグラフィー質量分析(GC-MS)のアプリケーションは、幅広い代謝物クラスを高い選択性と感度で同時に迅速に分析し、スペクトルライブラリが利用可能な場合に迅速な化合物同定を提供し、サンプルあたりのコストが比較的低く、高レベルの再現性と精度を提供する能力があるため、特に高く評価されています。
サンゴは、サンゴ動物、光合成渦鞭毛藻類の内部共生生物(科:共生虫科4)、および複雑なマイクロバイオーム5,6からなるホロビオントです。全体として、ホロビオント....
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プロトコル
注:実験計画、サンプルの収集および保管については、他の場所で詳細に説明されています2,30,31。野生サンゴの採集許可は、採集と実験の前に取得する必要があります。ここでのサンプルは、バタビアサンゴ農場(ワシントン州ジェラルトン)から輸入されたMontipora mollis(緑色のカラーモルフ)のコロニーから採取されたもので、もともとはアブロロス諸島(西オーストラリア州、南緯28度52分43.3秒、東経114度00分17.0秒)沖のサンゴ礁から採取され、水産養殖ライセンスAQ1643の下で水深1mで採取されました。サンプリングに先立ち、コロニーを800Lの水槽、35PSU、青色および白色光、150μmol光子・m・2・s-1、25°C±0.5°Cで3ヶ月間保持した。サンゴの破片(~5 cm2、N = 6)を液体窒素中で急速凍結し、処理するまで-80°Cで保存しました。
1. 抽出液と装置の準備
- サンゴ組織を除去する少なくとも1日前に、抽出液と機器を準備します。
- 界面活性剤を含まない清潔なガラス器具で超純水を4°Cで予冷します。 ....
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結果
この作業中に生成されたすべてのデータは、補足情報で入手できます。
宿主と共生生物の分離
図1:サンゴの宿主組織と共生痊科細胞の分離のセットアップと検証。 (A)サンゴの骨格からサンゴ組織を除去するためのエアガンのセットアップ。ピペットチップは電気テープでエアガンに取り付けられ、チップから小さな(~5mm)セクションが切断され、チップから外れることなくより多くの空気を逃がすことができます。(B)ホロビオントと分離した宿主組織(上清)と共生虫科細胞(ペレット)の例。この値は、遠心分離ステ.......
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ディスカッション
宿主と共生生物の分離は、簡単な遠心分離によって簡単かつ迅速に達成でき、ここでの結果は、フラクションを分離することで、特定のホロビオントメンバーの寄与を示す貴重な情報が得られ、サンゴの健康の機能分析に貢献できることを示しています。成体のサンゴでは、脂質合成は主に常在する藻類共生生物40によって行われ、脂質(例えば、トリアシルグリセロールやリン脂質)41とストレス回復を促進する脂肪酸を供給する11,42。この研究で共生生物と宿主のプロファイルでより豊富に見られた13の代謝産物のうち、9つは生物学的に重要なエイコサノイドであるDHA(C22:6[ω-6])、EPA(C20:5[ω-6])、およびARA(C20:4[ω-6])を含む脂肪酸であり、これらはサンゴと共生虫科の共生における王国間ストレスシグナル伝達に関与しています9,10
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開示事項
著者には開示すべき利益相反はありません。
謝辞
J.L.M.は、UTS Chancellor's Research Fellowshipの支援を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 100% LC グレード メタノール | メルク | 439193 | LC グレード必須 |
| 2 mL 微量遠心チューブ、PP | エッペンドルフ | 30121880 | ポリプロピレンは、化学薬品、機械的ストレス、極端な温度に対する高い耐性を提供します |
| 2030 島津製作所 ガスクロマトグラフ | 島津 | 製作所 GC-2030 | |
| 710-1180 & マイクロ;m 酸洗浄ガラスビーズ | Merck | G1152 | このサイズは、Symbiodiniaceae細胞を壊すのに最適です |
| AOC-6000 Plus 多機能オートサンプラー | 島津 | 製作所AOC6000 | |
| ブラッドフォード試薬 | メルク | B6916 | 任意のタンパク質比色試薬が許容されます |
| 圧縮空気ガン | Ozito | 6270636 | 同様のデザインが許容されます。1mLのチップオーバーにフィットするフィッティングを用意することが重要です。 |
| DB-5カラム、内径0.25mmのカラムと1μ;m 膜厚 | アジレント | 122-5013 | |
| DMF | メルク | RTC000098 | |
| D-ソルビトール-6-13C および/または 13C5–15N バリン | メルク | 605514/600148 | メタノールに内部標準片のいずれかまたは両方を添加することができます。 |
| 平底 96ウェルプレート | メルク | CLS3614 | |
| ガラスシンチレーションバイアル | メルク | V7130 | 20 mL、非プラスチックシール付き |
| Immunoglogin G | メルク | 56834 | 利用できない場合は、ウシ血清アルブミンは許容されます |
| プライマー | v4 | ||
| R | v4.1.2 | ||
| 島津製作所 LabSolutions インサイト ソフトウェア | v3.6 | ||
| 水酸化ナトリウム | メルク | S5881 | ペレット 1 M 溶液 |
| 整頓 | v1.3.1 | R パッケージ | |
| TissueLyser LT | Qiagen | 85600 | または類似 |
| TQ8050NX トリプル四重極質量分析計 | 島津 | 製作所 GCMS-TQ8050 NX | |
| UV-96 ウェルプレート | グライナー | M3812 | |
| Whirl-Pakサンプルバッグ | Merck | WPB01018WA | サンプル収集バッグ;サイズ:~5cmのサンゴの破片を収納するのに十分な大きさですが、水が広がりすぎるほど大きすぎません |
参考文献
- Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: A critical review and future perspectives. Metabolomics. 5 (1), 3-21 (2008).
- Matthews, J. L., et al. The metabolic significance of symbiont community composition in the coral-algal symbiosis. Applied Environmental Metabolomics. Bea....
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再版と許可
