社会的脅威安全性テストは、心理社会的ストレス関連の表現型を明らかにします

ストレスは、身体的または心理的刺激によって引き起こされる恒常性の乱れとして^{定義されます1}。ストレスは、心的外傷後ストレス障害、うつ病、不安などの精神障害の発症の主要な危険因子としてよく知られています^2,3。特に、社会的ストレスは、ストレス関連精神疾患の発症の主要な危険因子^{と考えられています4。}社会的ストレスの中で、特に重要性を増しているのが、社会的従属ストレス^である5。マウスは、ヒトと同様に、豊富な^{社会的行動6}を持つことができるため、社会的ストレスを伴う調査に適している。実験室では、成体マウスを集団飼育すると、ランク⁷の形成を含む社会構造が確立されます。したがって、コロニーモデルは、マウスの混合性グループにおいて自然に確立された社会的階層の影響を研究するように設計されました⁸。長年にわたり、同性集団モデル、社会的不安定モデル、侵入者コロニーモデルなど、社会的従属ストレスを利用するコロニーモデルのバリエーションが開発されてきました。しかし、近年、男性の居住者-侵入者モデルとして知られる1つの特定のバリアントが文献で普及し、社会的複雑さを居住者と侵入者の2つのマウスに単純化しています。侵入者として知られる関心のある動物は、居住者または侵略者として知られる、より大きく、年をとって、引退したブリーダーのケージに入れられます。そして、居住者は対立の方法として侵入者を物理的に攻撃し、居住者が支配的であり、侵入者が従属的である社会的階層を確立します。対立が1回限りの出来事である場合、それらは「急性」(「急性社会的敗北モデル」)に分類されますが、数日間(通常は10日)にわたって繰り返される対立は「慢性的」(「慢性社会的敗北モデル」)として知られています。慢性社会的敗北(CSD)モデルでは、攻撃は断続的であり、典型的には物理的段階と呼ばれる5〜10分⁹の期間に限定される。物理的な段階に続いて、侵入者と居住者は同じケージに一晩閉じ込められ、メッシュの壁で半分に分離され、物理的な接触以外のあらゆる形態の相互作用が可能になります。感覚相として知られるこの構成は、直接的な物理的対立ではなく、脅威の継続的な出現を通じてストレスを誘発します。2018年、van der Koojiたちの研究グループは、身体的フェーズ¹⁰を標準化し、厳密に制限することで、モデルの心理社会的要素に焦点を当てるために、修正された慢性社会的社会的敗北治療を導入した。修正されたモデルでは、身体的攻撃を異なる居住者との 3 つの 10 秒エピソードに制限し、感覚相の 15 分間のエピソード間間隔で発生します。3回目の身体的エピソードの後、感覚段階は一晩続きます。このサイクルは 10 日間連続して繰り返され、エピソードごとに新しい居住者が発生します。修正された治療は、侵入者の身体的危害が最小限に抑えられ、物理的攻撃の異なる期間による結果の変動性が減少するため、慢性的な社会的敗北モデルの翻訳的妥当性を高めます。

CSDモデルはストレス関連の病気(うつ病、不安神経症、心的外傷後ストレス障害など)の研究に利用されるため、攻撃性、記憶、および無快感症の行動アッセイを含むがこれらに限定されない、行動後のアッセイが選択されます。近年、マウスにおけるCSD後の行動アッセイでは、社交性がどのように、どの程度影響を受けるかが評価されることがよくあります⁹。社交性は、同種を社会的に避けるのではなく、社会的に相互作用するマウスの生来の好みとして定義されます。社交性はストレス効果の影響を受けやすいため、社会的回避の発達のみを評価するアッセイが確立されました。ストレス誘発性社会的回避は、ヒトにおける社会不安やうつ病の主な行動症状の1つであるため、翻訳的な関連性があります¹¹。ヒトと同様に、すべてのマウスがCSD治療後に社会的回避を発症するわけではなく、ストレス応答性に個性が存在することを示唆している。Cohenらは、個性の神経生物学を研究するための有望なアプローチとして、カットオフ行動基準を提案している¹²。行動に基づく動物の選択は、グループ分けの結果であり、遺伝子環境研究の基礎を強調しています。その後、異なるサブグループはしばしば特定の遺伝的変異/修飾の明確な濃縮を示し、それらは異なる環境条件下で調査することができます¹³。したがって、社会的回避の発達における個性を利用して、慢性的に社会的に敗北した雄マウスの単一グループを、ストレス感受性(社会的回避性)とストレス耐性(社会的非^回避性)の2つのサブグループに分けました^9,14。しかし、マウスにおける社会的回避表現型を不適応または適応行動として解釈することは、治療(ここではCSD)および治療後の行動アッセイの両方の全体的な文脈で考慮されるべきである。さらに、選択した治療後の行動アッセイは、理想的には、社会的回避の発達だけでなく、社交性の他の側面を評価します。私たちの最近の研究は、CSD誘発性社会的回避における条件付け学習の関与を明らかにしました¹⁵。具体的には、CSD誘発性社会的回避は、無条件刺激に対する条件刺激として機能する居住者の株の特徴形質、つまり居住者による攻撃に対する嫌悪的条件反応です。さらに、社会的に回避するサブグループ内では、嫌悪的な居住者の系統と他の安全な新規系統の形質を区別できる個体もいれば、両方の系統に対して一般的な社会的回避を示す個体もいます。ここでは、洗練されたCSD後の行動分析である社会的脅威安全性テスト(STST)¹⁵を提案します。他の社会的相互作用テスト⁹とは異なり、STSTは、社会的回避の発達を、正しい嫌悪的条件付け反応(すなわち、成功した条件学習)および社会的脅威-安全識別能力の測定として同時に評価することを可能にし、どちらも、慢性的に社会的に敗北した雄マウスの単一グループ内のストレス感受性およびストレス耐性のある個体を特定するために利用される。社会的脅威と安全性の差別と嫌悪的反応の一般化の評価は、慢性的に社会的に敗北した動物の単一グループを回復力と感受性のあるサブグループに分類するために使用される翻訳基準を拡張します。

すべての手順は、実験手順のための動物の世話と使用に関する欧州共同体理事会指令に従って実施され、地方自治体(Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz)によって承認されました。 図 1 は、概略的なタイムラインを表しています。

1.治療

1. 対象動物:C57BL6/J雄マウスを7週齢で入手し、到着後、温度と湿度が管理された施設で12時間の明暗サイクル(点灯:8:00、消灯:20:00、23°C、湿度38%)で1つの家に餌と水を適量与えます。
2. 慢性的な社会的敗北(CSD)
   1. 治療群
      1. 1週間の馴化後、CD-1株をレジデントの株として使用して、10日間連続してCSD治療を行います(詳細なプロトコルについては、慢性社会的敗北⁹ および修正慢性社会的敗北治療¹⁰を参照してください)。
      2. C57BL6/JマウスをCD-1マウスのケージに挿入し、物理攻撃を10秒カウントします。このエピソードを 3 回繰り返し、それぞれ異なる CD-1 マウスを使用し、エピソード間 15 分間隔で行います。
      3. この間、C57BL6/J マウスと CD-1 マウスの間にメッシュの壁を配置し、感覚的な接触のみを許可します。第3話に続いて、C57BL6/JマウスをCD-1マウスのケージに一晩収容し、両者をメッシュの壁で隔てます。これを10日間繰り返します。
         メモ: CD-1 マウス番号 = C57BL6/J マウス番号 + 1。C57BL6/Jで処理したマウスの数が10匹未満の場合でも、10日間の治療を通して毎日、新しいCD-1マウスで最後の感覚段階(一晩中続く)を確実に行うために、最低10匹のCD-1マウスが必要です。
      4. 10日間を通して動物の身体的健康状態を注意深く評価します。動物が重傷を負っている場合は、倫理的および科学的理由(治療後の試験中の運動性/活動性)のために実験から除外します。 表 1 に、ウェルビーイングのチェックリストを示します。
   2. 対照母集団
      1. 到着時に、治療群と同じ年齢のマウスを同じ条件で維持します。
      2. 1週間の馴化後、対照動物を空のケージに90秒間導入し、治療群に使用されたものと同じメッシュの壁で半分に区切られた個々のケージ(シングルハウス)に戻します。これを10日間の治療と並行して毎日実行します。.
         注:対照群と治療群を別々の部屋に収容することをお勧めします。
3. 最後の(10^回目の)感覚段階の後、すべてのマウスを到着時と同様の条件で新しいケージに入れ、一晩休ませます。
   注:最後の感覚段階は24時間続く必要があり、その後、動物は単房です。

2.処理後試験:社会的脅威安全性試験(図2)

1. CSD処理後、すべてのマウス(治療群および対照群)を、到着時と同様の条件で新しいケージに入れ、一晩休ませます。
2. 朝の時間帯(8:00-13:30)に、3室のアリーナ(合計60cm×40cmの長方形、透明なアクリルの壁と滑らかな床でできている)を5%エタノールで洗浄し、37ルクスの光条件でカメラの下に置きます。アリーナ全体が見えるようにします。
3. メッシュエンクロージャー(金属またはアクリル製のケージ状)を5%エタノールで洗浄し、 図1Aの角に示すように配置します。
4. 馴化フェーズ:アリーナの中央に興味のある動物を導入し、6分間探索させてから、ホームケージに戻します。
5. 新規(未知)CD-1ソーシャルターゲット(同種)を一方のメッシュエンクロージャーの下に置き、新規の129/Svソーシャルターゲットをもう一方のメッシュエンクロージャーの下に配置します。
   注:熟知バイアスを避けるために、未知の129/Svコンスペフィックを使用することが重要です。できれば、アリーナごとに4つのメッシュエンクロージャーを用意してください:2つは慣れ段階に、2つはテスト段階に起因する。
6. テストフェーズ:アリーナの中央に関心のある動物をすぐに再導入し、6分間探索できるようにします。
7. すべての動物を家に帰します。異なる動物の試験の合間に、アリーナとメッシュの囲いを5%エタノールで清掃しますが、同じ動物の観察中、つまり、慣れと試験の段階では決して清掃しないでください。
8. 動物間でメッシュエンクロージャーの位置を交互に(同じ動物内の2つの相間では行わないでください)、位置の優先バイアスの可能性を制御します。

3. スコアリングと分析

注:ストレス処理後のテスト、つまりSTSTのみが採点および分析されます(CSDストレス処理は行われません)。

1. 相互作用ゾーンをメッシュエンクロージャーの境界から2cmとして定義します。
2. 動物の鼻が相互作用ゾーン内にある慣れ段階でメッシュエンクロージャーを探索するのに費やした時間をスコアリングします。
3. 動物の鼻が相互作用ゾーン内にあるテスト段階で、社会的ターゲットとの対話に費やされた時間をスコアリングします。
   注意: 検出は、手動(手動スコアリング用のタイマーまたはソフトウェアを使用)または自動で行うことができます。検出方法に関係なく、探索や社会的相互作用の測定にはノーズポイントを、活動関連の測定には身体の中心点(移動距離など)を取ります。
4. 社会的相互作用指数は、テスト段階で各社会的ターゲットの探索に費やされた時間/慣れ段階で2つの空のメッシュエンクロージャーの探索に費やされた平均時間として計算します(図2B)。
5. 治療群を次のように3つのサブグループに分けます:社会的相互作用指数≥1のCD-1社会的標的を持つ動物は非回避者であり、社会的相互作用指数<1と両方の社会的標的を持つ動物は無差別回避者であり、社会的相互作用指数≥1の動物は129/Svの社会的標的のみを有した動物は識別回避者です(図2C-D)。
   注:3つのサブグループのそれぞれに含まれる動物の数は、異なる動物バッチ間で異なる場合があります(CSD治療を受けるすべての動物の約1/3は、3つのサブグループのいずれかの表現型特性を示します)。
6. 治療群と対照群の間のCD-1社会的目標との社会的相互作用指数を統計的に分析することにより、ストレス効果を評価します(パラメトリック2標本t検定またはノンパラメトリックマンホイットニー検定のいずれか)。

嫌悪的条件反応の測定としての社会的相互作用指数
社会的相互作用指数≥1は、空のメッシュエンクロージャーの探索と比較して、それぞれの社会的ターゲットとのより大きな社会的相互作用を反映しています。ここでは、特定の株の特徴付け形質について食欲も嫌悪も経験がないと定義されるベースライン条件下では(ここでは、対照群に対する社会的標的と治療群に対する129/Sv社会的標的の両方)、無傷の社交性レベルは、同じ株の社会的相互作用指数≥1に反映されます。一方、特定の系統(ここでは居住者の系統、すなわちCD-1系統)による社会的嫌悪的条件付け経験(ここではCSD治療)に続いて、その特徴付け形質が条件刺激として機能し、正しい嫌悪的条件付け反応の測定としての社会的回避の発達は、同じ系統の社会的相互作用指数<1に反映されます。CSD ストレス効果は、最初に評価され、全体的な治療群レベルで評価されます (プロトコルのステップ 3.6 を参照)。具体的には、CD-1株に対する社会的回避発達の尺度として、CD-1社会的目標との社会的相互作用指数<1を有する治療群にストレス効果が反映される。一方、対照群の無傷のベースライン社交性レベルは、同じ社会的目標を持つ社会的相互作用指数≥1を持つことに反映されています。この結果、両群間でCD-1社会的標的との社会的相互作用指数に有意差(p < 0.05)が生じました(図2C)。

社会的脅威安全性テストによる単一の慢性的に社会的敗北したグループ内の3つの異なる表現型サブグループの同定
プロトコルのステップ3.4および3.5で説明したように、社会的相互作用指数に基づいて動物を分割した後、両方の社会的ターゲット間の単一のサブグループ内の指数の有意差(p < 0.05)は、識別回避者のサブグループ内でのみ見られます(図2D、E)。識別回避者サブグループと無差別回避者サブグループは、条件刺激(CD-1株)に対する社会的回避の発達の測定値であるCD-1社会的ターゲットとの社会的相互作用指数<1を持ち、それによって正しい嫌悪条件反応の発達と成功した嫌悪条件学習の発達を反映しています。対照的に、非回避者サブグループの社会的相互作用指数(≥1)は、同じ社会的目標(CD-1株)による嫌悪条件学習の障害を反映しています。一方、脅威と安全の識別能力は、社会的相互作用指数≥1を持ち、129/Svの社会的目標を、安全/中立刺激(129/Sv系統)に対する無傷の社会性レベルの測定値として持つ識別回避者サブグループに反映されています。対照的に、無差別回避者サブグループの嫌悪的反応の一般化は、社会的回避の測定と同じ社会的目標を持つ社会的相互作用指数<1を持つことに反映され、したがって、安全/中立刺激に対する嫌悪的条件反応。各サブグループ内のマウスの割合は約33%です。ただし、一部の動物のバッチは各サブグループに多かれ少なかれ含まれているため、これは予測不可能です。最後に、潜在的な交絡因子としての社会的選好バイアスの欠如は、対照群内の両方の社会的標的との社会的相互作用指数≥1(すなわち、p>0.05)に反映されています。

社会的脅威安全性試験結果の解釈
脅威に関連する手がかりの正常な条件学習や脅威と安全の識別を含む、識別回避者のサブグループの特徴は、ストレスに強い個人の特徴として議論されています16、17、18、19、20、21、22.対照的に、無差別回避者サブグループに見られるように、心的外傷的出来事後の全般化された嫌悪的条件反応は、心的外傷後ストレス障害や不安障害などのストレス関連精神障害の主要な症状です16,17,23,24,25,26したがって、ストレスの影響を受けやすい個人の特徴です。最後に、非回避者サブグループは、学習障害の表現型を表す16。

図1:回路図のタイムライン 施設に到着したら、すべてのマウスを7日間シングルハウスし、その後、CSDストレス処理群または処理対照群を治療に指定します。治療は10日間続き、その後、動物は1日間シングルハウスされます。STST(動物の単一飼育から1日後に行われる)を実行するためにアリーナを設置します。6分間の慣れ段階から始めます。すぐに慣れ段階に続き、さらに6分間テスト段階を行います。最後に、動物をホームケージに戻します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:社会的脅威安全性テスト (A)テスト設計。この試験は、開口部のある透明な壁で区切られた3等分された3つのチャンバーアリーナで行われ、対象の動物(C57BL6/J、黒)がその間を移動できるようにします。各周辺部には、1つのメッシュエンクロージャーが配置されています。1つの囲いには、CSD治療中に早期に遭遇した居住者の株からの新しい社会的標的が含まれています(CD-1、白)。もう一つは、年齢、大きさ、性別が一致する新規系統の新規社会的標的を、住民の系統の新規マウスと異なるが、毛皮の色(129/Sv、褐色)から抽出したものである。どちらの社会的ターゲットも、対象の動物よりも古く、大きいです。関心のある動物はアリーナの真ん中に導入され、メッシュの囲いが空の慣れ段階と、図のように社会的ターゲットがメッシュの囲いの中に配置されるテスト段階で、6分間アリーナを探索することが許可されます。(B)社会的相互作用指数。動物の鼻が相互作用ゾーン内(メッシュエンクロージャーの境界から2cm)にある馴化段階でメッシュエンクロージャーを探索するのに費やした時間をスコアリングします。続いて、鼻が相互作用ゾーン内にあるテスト段階で、社会的ターゲットとの対話に費やした時間をスコアリングします。図のように社会的相互作用指数を計算します。(C)慢性的な社会的敗北ストレス効果:治療群は、CD-1株に対する社会的回避発達の尺度としてCD-1社会的目標を持つ社会的相互作用指数<1を持っています。一方、対照群の無傷のベースライン社交性レベルは、同じ社会的目標を持つ社会的相互作用指数≥1を持つことに反映されています。この結果、両グループ間でCD-1ソーシャルターゲットとの社会的相互作用指数に有意差(p < 0.05)が生じます。結果は、平均±平均の標準誤差(SEM)、グループあたりn = 16、Mann-Whitney検定として表されます。(D)慢性的な社会的敗北治療後の社会的脅威安全性テストの代表的な結果。治療群は、動物の社会的相互作用指数と社会的標的に基づいて3つのサブグループに分けられます。社会的相互作用指数≥1のマウスとCD-1の社会的標的を非回避者、社会的相互作用指数<1のマウスと両方の社会的標的を無差別回避者、社会的相互作用指数≥1の129/Svの社会的標的のみを持つマウスを識別回避者と呼ぶ。対照群は、両方の社会的ターゲットで同様の指標を持っています。結果はSEM±平均として表され、n = 55/サブグループあたり。(E)STSTのテスト段階における各サブ/グループの代表的なヒートマップ。色が濃いほど、そのエリアで過ごす時間が長いことを示します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

表1:慢性的な社会的敗北手順の中止基準。 この表は、合計4つのオブザベーションファミリーを示しており、それぞれにいくつかのサブオブザベーション27があります。各観測値にはスコアがあります。スコアの合計に応じて、取るべき対策が示されます。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

著者は何も開示していません。