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方法論記事

神経膠腫幹細胞株におけるスフェロイド薬剤感受性スクリーニング

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DOI:

10.3791/65655

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2024年2月2日

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1Division of Oncology, Children’s Hospital of Philadelphia, 2Department of Pediatrics, Perelman School of Medicine at the University of Pennsylvania, 3School of Medicine, University of Pennsylvania

この記事について

サマリー

In vitro 薬剤感受性スクリーニングは、抗がん剤の組み合わせを発見するための重要なツールです。球体で増殖した細胞は、異なるシグナル伝達経路を活性化し、単層細胞株よりも in vivo モデルを代表すると考えられています。このプロトコールは、スフェロイド株の in vitro 薬物スクリーニングの方法を記述しています。

要約

In vitro 薬剤感受性スクリーニングは、抗がん剤併用療法の発見において重要なツールです。通常、これらの in vitro 薬物スクリーニングは、単層で増殖した細胞に対して行われます。ただし、これらの2次元(2D)モデルは、3次元(3D)スフェロイド細胞モデルと比較して精度が低いと考えられています。これは特に神経膠腫幹細胞株に当てはまります。球体で増殖した細胞は、異なるシグナル伝達経路を活性化し、単層細胞株よりも in vivo モデルを代表すると考えられています。このプロトコルは、スフェロイド株の in vitro 薬物スクリーニングの方法について説明しています。例として、マウスおよびヒト神経膠腫幹細胞株が用いられます。このプロトコルは、薬物または薬物の組み合わせが細胞死を誘発するかどうか、および2つの薬物が相乗的であるかどうかを決定するために使用できる3Dスフェロイド薬物感受性および相乗効果アッセイについて説明しています。神経膠腫幹細胞株は、RFPを発現するように改変されます。細胞は、低付着性の丸い井底96枚のプレートでめっきされ、球体は一晩で形成される。薬剤を添加し、組織培養インキュベーターに埋め込まれた蛍光顕微鏡であるIncuCyteライブイメージングシステムを使用してRFPシグナルを経時的に測定することにより、増殖をモニタリングします。その後、半値阻害濃度(IC50)、致死量中央値(LD50)、およびシナジースコアを計算して、薬物単独または組み合わせに対する感受性を評価します。このアッセイの3次元性は、 in vivoでの腫瘍の成長、挙動、および薬物感受性をより正確に反映し、さらなる前臨床研究の基礎を形成します。

概要

膠芽腫は、壊滅的な高悪性度の脳腫瘍で、全生存率は5年1です。神経膠芽腫のような高悪性度神経膠腫(HGG)は、小児集団におけるがん関連死亡の主な原因であり2 、成人でも治療が最も困難な腫瘍の1つです3。HGGの分子ドライバーに関する理解は大きく進歩しているにもかかわらず、治療の選択肢は依然として限られており3、臨床における治療感受性をより正確に予測する薬物スクリーニング法の必要性が強調されています。

3D細胞培養は、主に生理学的に関連性のある細胞挙動のモデリングに使用されてきました4。さらに、腫瘍微小環境の3D構造は、3D成長アッセイ5を確立することにより、in vitroで再現することができる。また、スフェロイドの増殖は異なるシグナル伝達経路を活性化するため、2D培養と比較してin vivoモデル6,7をより代表していると考えられています。小児用HGG幹細胞とマウスNF1神経膠腫幹細胞株は、ニューロスフェアとして自然に増殖し、これらのマウスNF1神経膠腫細胞株を中スループットの薬物スクリーニング8で使用しました。ここで使用された小児系統は、半球、正中線、および小脳の小児HGGに由来し、Children's Brain Tumor Network(突然変異および遺伝子発現プロファイル)9から取得され、完全に特徴付けられました。これらの系統は、核の赤色蛍光タンパク質(RFP)を発現するように改変されており、IncuCyteライブイメージングシステムを使用して増殖と生存をモニタリングすることができます。RFPシグナルの強度は、存在する細胞の数を表します。緑色蛍光タンパク質(GFP)などの他の蛍光色素も使用できます。

小児急性リンパ芽球性白血病、リンパ腫、上皮性悪性腫瘍、および他の多くの癌に対する併用化学療法は、腫瘍を根絶し、単剤に対する薬剤耐性を予防する効果的な方法です10,11。しかし、HGGの治療感受性を達成するためにどの薬剤を組み合わせればよいかについての情報は限られており、in vitro薬物試験においてより精度の高いスフェロイドモデルの使用が奨励されています。

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プロトコル

すべてのプロトコル手順は、フィラデルフィア小児病院治験審査委員会(IRB)によって承認されました。

1. 3Dスフェロイド細胞めっき

  1. 神経膠腫幹細胞培地を調製する:ベース培地を作製するには、50 mLの増殖サプリメントと5 mLの100倍ペニシリン-ストレプトマイシン溶液(10,000 U / mL)を基礎培地(500 mL)に加えます。神経膠腫幹細胞培地を作製するには、メーカーの説明に従って、上皮成長因子(EGF)と塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)をそれぞれ20 ng / mLと10 ng / mLの最終濃度に添加します。
    注:神経膠腫幹細胞培地は、4°Cで保存した場合、1週間使用できます。
  2. RFP発現細胞の解離:
    注:この例では、マウスNF1 HGG幹細胞株5746が使用されています。
    1. 神経膠腫球を15 mLの円錐管に移し、遠心分離機(150 x g で5分間)で神経膠腫球をスピンダウンします。上清を取り除き、300 μLのアキュターゼを加えて球体を解離します(37°Cで5分間インキュベートします)。
    2. 1 mLの神経膠腫幹細胞培地を加え、穏やかなピペッティングで球体を破壊します。解離した細胞を150 x gで5分間遠心分離し、上清を吸引し、ペレットを1 mLの神経膠腫幹細胞培地に溶解します。
  3. セルカウンターまたは血球計算盤を使用して細胞の濃度を測定します。蛍光セルカウンターを使用する場合は、2 μLのAcridine Orange/Propidium Iodide Stainに18 μLの細胞懸濁液を加えます。この懸濁液を12μL血球計算盤にロードして、懸濁液中に存在する生細胞/死細胞の数をカウントします。
  4. 神経膠腫幹細胞培地100μLあたり最終濃度2,000細胞まで細胞を希釈します。
    注:細胞濃度の変更は細胞株に依存する場合があり、それに応じて調整することができます。
  5. マルチチャンネルピペットを使用して、96ウェル丸底低アタッチメントプレートの各ウェルに100 μLの細胞懸濁液(100 μLあたり2,000細胞)をリバースピペッティングで分注します。
    注意: 丸い底の低い取り付けプレートを使用してください。これらのプレートは、各ウェルに単一の神経膠腫球の形成を刺激します。リバースピペッティングは、生細胞解析システムの画像取得を妨げる気泡の形成を回避します。
  6. プレートを150 x g で5分間遠心分離します。
    注:遠心分離は、3Dニューロスフェア形成を開始するための重要なステップです。
  7. 一晩インキュベートして、各ウェルに1つの球体が形成されるようにします。

2. シナジーアッセイのための薬剤添加(図1)

  1. 96ウェルプレートの各ウェルに、薬物1と2の両方の特定の濃度が供給されていることを確認してください。薬剤 1 の各濃度と薬剤 2 の各濃度が重複して結合されるグリッドを作成します。
  2. 神経膠腫幹細胞培地を使用して、相乗効果が決定される 2 つの薬剤 (薬剤 1 の 5 希釈と薬剤 2 の 7 希釈) の段階希釈を行います (図 1A)。
    注:この研究では、50%の段階希釈シリーズが使用されます。ただし、任意の希釈シリーズを利用できます。
    1. 希釈シリーズは、各ウェルの望ましい最終濃度よりも7倍濃縮されている必要があります。例えば、薬物 1 の最高最終濃度が 1 μM の場合、薬物 1 の希釈系列の最初の濃度を 7 μM (1 mL、 図 1A のチューブ B または I) にします。
    2. 希釈シリーズ( 図1に示すように、チューブC-HおよびJ-M)の各追加チューブに500 μLの神経膠腫幹細胞培地を添加します。
    3. 希釈シリーズを作成するには、チューブBまたはチューブIから500μLの薬物混合物を吸引し、希釈シリーズの次のチューブであるチューブCまたはチューブJ(500μLの神経膠腫幹細胞培地を含む)にそれぞれ追加します。よく混合し、希釈シリーズの次のチューブまで繰り返します。DMSOコントロール(チューブA)を作成し、DMSO濃度が条件間で同じであることを確認します。
      注:薬物濃度および希釈シリーズに変更を加えることができます。希釈シリーズを変更した場合は、 補足ファイル1 に正しい薬物濃度を必ず記載してください。
  3. 96ウェルプレートの各ウェルに、 図1Bに示すように、逆ピペッティングにより20 μLの薬物1と20 μLの薬物2を添加し、ウェルあたり最終容量を140 μLにします。薬物の組み合わせは重複して評価されます。IC50およびLD50に提供されているダウンストリーム解析を使用する場合は、図1Bに示すような薬剤レイアウトを使用します。
    1. このアッセイでは、各薬物自体の効果(他の薬物が存在しない状態)も測定されます。これらの単一の薬剤ウェルに20 μLのDMSOコントロール培地( 図1BのチューブA)を必ず追加して、各ウェルの最終容量を140 μLにしてください。
    2. ウェルに気泡が含まれていないことを確認してください、これはイメージングに影響を与えるためです。
      注:最終ボリュームに変更を加えることができます。ただし、ポイント2.2の濃度を調整してください。
  4. プレートをライブイメージャーにセットし、スフェロイドモジュールを使用して各ウェルの各球の成長をモニターし、単一球体設定で明視野とRFPの両方を4倍の倍率でイメージングします。
  5. プレートを72時間モニターし、プレートの各ウェルを一定の時間間隔(通常は2時間)でイメージングします。
    注:正しいプレートマップをアップロードしてください。これにより、適切なダウンストリーム解析が保証されます(図1C)。

3. IC50、LD50、シナジースコアの算出(図2 、 図3)

  1. ライブイメージャーソフトウェアを使用して、各ウェルおよび各時点のRFP強度を分析します。使用した解析パラメータは、補足ファイル(補足ファイル2)に記載されています。
    注:必要に応じて、さまざまな分析パラメータを使用できます。
  2. RFP データを各ウェルの Total Red Integrated RFP Intensity としてエクスポートし、グループ化されていない生データを必ずエクスポートします(図 2A)。
    注:付属のテンプレート(補足ファイル1)を使用してIC50とLD50を計算する場合は、ポイント3.2に従うことが不可欠です
  3. (1)DMSOのみと比較した倍率変化(この計算では、0 hの値は必要ありません)および(2)0時間と比較した倍率変化のLog2の各薬物の組み合わせの平均と標準偏差を、提供されたExcelシート(図2B および 補足ファイル1の例を参照)に貼り付けて決定します。
  4. スプレッドシートで薬物 1 と 2 の最大濃度を調整します (図 2B)。
    注:薬物1と2の濃度を調整してください。そうしないと、誤ったLD50およびIC50値が計算されます。
  5. 適切なデータ解析ソフトウェアアプリケーションを使用してIC50値を計算します(ここではGraphPadを使用します)。IC50値の計算には、ステップ3.4でのみ決定した DMSOと比較した平均倍率変化と標準偏差倍率変化 を使用し、薬物1と2のIC50テーブルをデータ解析ソフトウェアにコピーします(Log(阻害剤)vs.正規化応答、可変傾き)(図3A)。
    1. IC50の計算には、単一のコンポーネントが追加されたウェルからのデータのみを使用してください。データ解析ソフトウェアのLog drug concentration値を使用すると、付属のスプレッドシートで自動的に計算されます。
  6. シナジースコアの計算:
    1. すべての組み合わせのみのDMSOと比較した平均倍率変化を使用して、ソフトウェアパッケージまたはWebサイトを使用してシナジースコアを計算します。たとえば、https://synergyfinder.fimm.fi/ 12 (パラメーター: LL4 カーブ フィット、シナジー スコア計算の ZIP 法) などです。補足ファイル 1 は、SynergyFinder にアップロードできる Synergy 入力テーブルを作成するために必要な値を自動的に計算します (図 3B)。シナジー入力テーブルの例を補足ファイル3に示します。
      注:10を超えるスコアは相乗効果を示し、-10未満のスコアは拮抗作用を示し、-10から10の間の値は相加効果を示します。
  7. LD50 スコアを計算します。
    1. 薬物 1 の濃度ごとに、薬物 2 の LD50 を計算します。補足ファイルは、各濃度のLog2値と標準偏差を自動的に計算します(図3C)。
    2. 0 h と比較した Log2 倍変化の平均と標準偏差、およびデータ解析ソフトウェアの反復回数 (この研究では 2) を入力し、-1 での濃度を決定して LD50 値と LD50 標準偏差を計算します (Log2 = -1 は、0 h と比較してシグナルの 50% が失われる log2 値を表します)。これらの計算では、Log(inhibitor) vs. response, variable slope 4 parameters モデルを使用します。
      注:データ分析ソフトウェアは、log2 = -1値に対応する薬物濃度を自動的に計算しません。ただし、この値は、ユーザー定義の方程式として、データ解析ソフトウェアのレポートされた計算に追加することができます(図3C)。データ解析ソフトウェアのログ濃度値は、付属のスプレッドシートで自動的に計算されますので、必ず使用してください。 補足ファイル4 は、GraphPadソフトウェアのIC50およびLD50パネルを示しています。

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結果

一例として、マウス神経膠腫幹細胞株5746(RFP発現)の2つのRAS下流エフェクター経路を阻害するトラメチニブ(MEK阻害剤)とGDC-0941(PI3K阻害剤)の相乗効果を評価しました(図4)。 図4A は、トラメチニブとGDC-0941の組み合わせで処理された0時間および72時間の同じ球を示しています。これらの画像は、ライブイメージャーソフトウェアから直接エクスポートされました。IC50とLD50はGraphPad(図4B、D)で説明されているように計算され、シナジーはSynergyFinder(図4C)を使用して計算されました。 図4B は、IC50計算の出力を示しています。LogIC50、Hillslope、IC50の値は、両方の薬剤について、95%信頼区間と適合度とともに示されています。

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ディスカッション

このプロトコルは、神経膠腫8のスフェロイドモデルにおける薬物の脆弱性を評価するために効果的に使用されている3D薬物スクリーニングアッセイを説明しています。この3Dスフェロイドアッセイシステムは、球体で増殖した神経膠腫細胞株のコンビナトリアルケモセラピーのより正確な前臨床研究を可能にするために特別に設計されました。HGGにとって、この方法は、この壊滅的な疾患に対する有望な薬剤の脆弱性を特定するためのフレームワークを提供します。ただし、このシステムの潜在的な用途は神経膠腫に限定されず、このプロトコルは、他のさまざまな状態の3Dモデルで新しい治療法を評価するために使用できます。

この研究の目標は、in vitro 薬物スクリーニングの予測可能性を高め、前臨床試験、ひいては臨床で成功する可能性が最も高い薬剤の組み合わせを優先することです。特に神経膠腫では、臨床にうまく変換されるin vitro薬剤スクリーニングを使用して強力な薬物の組み合わ...

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
15 mL遠心分離チューブCELLTREAT22941115 mLポリプロピレン遠心分離チューブ、滅菌済み96
ウェルプレートS-bioMS9096UZ96ウェル丸底超低アタッチメントプレート
AccutaseSTEMCELL Technologies7922細胞剥離液
アクリジンオレンジ/ヨウ化プロピジウム 染色Logos BiosystemsF23001生死細胞計数用染色
bFGFSTEMCELL Technologies78003.2ヒト組換え bFGF
セルカウンターロゴス バイオシステムズL20001LUNA-FL デュアル蛍光セルカウンター
遠心分離機エッペンドルフ5810R遠心分離細胞とプレート
DMSOPierce20688化合物用溶媒
EGFSTEMCELL技術78006.2ヒト組換え EGF
エッペンドルフ チューブCostar07-200-534マイクロ遠心チューブ
Excel マイクロソフトMicrosoftExcel
GDC-0941SelleckchemS1065薬 1
GraphPadGraphPadGraphPad プリズム 9IC50 および LD50
血球計算盤のロゴBiosystemsLGBD10008Luna PhotonSlide
IncucyteSartoriusS3Tissue Culture Incubatorに埋め込まれた蛍光顕微鏡で、特定の時間間隔ですべてのウェルをイメージングします。
IncucyteソフトウェアSartoriusIncucyte 2022BAnalysis of proliferation data
MediaSTEMCELL Technologies5702NeuroCult (Mouse and Rat) proliferation kit containing Basal Medium and growth supplement
Penicillin-Streptomycin Gibco15140122抗菌薬
TrametinibSelleckchemS2673Drug 2
Excel を培地に追加

参考文献

  1. Ostrom, Q. T., et al. CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2013-2017. Neuro-Oncology. 22 (22 Suppl 2), v1-v95 (2020).
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