インドシアニングリーン血管造影による新生血管加齢黄斑変性症の血管形態の特性評価

加齢黄斑変性症(AMD)は、高齢者の重度の視力低下につながる一般的な状態です¹。米国だけでも、AMD患者数は現在の1,100万人から2050年には2,200万人近くに達すると予測されています。世界全体では、AMDの推定症例数は2040年までに2億8,800万人に達すると予想され^{ています2。}

脈絡膜新生血管(CNV)は、「滲出型」または血管新生AMDとも呼ばれ、網膜中心の下に異常な血管が形成されるため、視力に壊滅的な影響を与える可能性があります。これは、出血、網膜の滲出、および重大な視力喪失につながります。細胞外VEGFを標的とする抗血管内皮増殖因子(VEGF)療法の導入は、CNV治療に革命をもたらしました。しかし、これらの進歩にもかかわらず、患者の最大50%がこれらの治療法に対して最適ではない反応を示し、体液の蓄積や未解決の出血または新しい出血などの進行中の疾患活動性を示します^{3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14}。

臨床試験では、CNV患者の抗VEGF耐性は、大口径の分岐細動脈、血管ループ、および吻合部接続を特徴とする細動脈CNVの存在に対応することが多いことが示されています⁹。抗VEGF治療を繰り返すと、血管の異常、動脈CNVの発症、そして最終的には抗VEGF療法に対する耐性に寄与する可能性があります^14,15。細動脈CNVの場合、持続的な体液漏れは、特に^{血流の多い}条件下で、動静脈吻合ループのタイトジャンクションが不適切に形成されることによって引き起こされる滲出の増加が原因である可能性があります9。逆に、抗VEGF治療によく反応する個人は、毛細血管CNVを示す傾向があります。

動物モデルを用いた研究では、高齢マウスのレーザー誘導CNVが細動脈CNVを発症し、抗VEGF治療に対する耐性を示すことを実証しました^16,17。逆に、若いマウスにおけるレーザー誘導CNVは、毛細血管CNVの発達と抗VEGF治療に対する高い反応性につながります。したがって、機構的研究と治療的研究の両方において、CNV血管タイプを区別することが重要です。

臨床現場では、CNVは一般的にフルオレセイン血管造影(FA)の漏出パターン(例、タイプ1、タイプ2)に基づいて分類され、フルオレセイン色素を使用して滲出を追跡し、病的漏出の領域を特定します。AMDの研究では、CNVは主に動物モデルでFAを使用して研究されています。しかし、FAはCNVの血管形態を明らかにすることができません。さらに、FAは可視光スペクトルの画像のみをキャプチャし、網膜色素上皮(RPE)の下の脈絡膜血管系を視覚化することはできません。対照的に、血漿タンパク質に強い親和性を示すインドシアニングリーン(ICG)は、優勢な血管内保持を促進し、血管構造と血流の可視化を可能にします⁹。ICGの近赤外蛍光特性を利用することで、ICG血管造影法(ICGA)を用いて網膜および脈絡膜色素を画像化することが可能になります。これに関連して、FAとICGAを組み合わせて、毛細血管と細動脈CNVが観察される若齢および老齢マウスにおけるレーザー誘発脈絡膜新生血管(CNV)の漏出と血管形態を調査するプロトコルが提示されます。

この研究で実施された動物実験は、ベイラー医科大学の動物実験委員会(IACUC)から承認されました。すべての手順は、Association for Research in Vision and Ophthalmology(ARVO)の眼科および視力研究における動物の使用に関する声明に概説されているガイドラインに準拠して実施されました。本研究では、若齢(7〜9週間)および老齢(12〜16か月)のC57BL / 6J雄および雌マウスを使用しました。動物は市販の供給源から入手した( 資料表参照)。

1. イメージングシステムの準備

1. イメージングプラットフォーム( 材料表を参照)に加熱パッドを配置して、イメージング中にマウスの体温が維持されるようにします。加熱パッドを作動させ、温度を35°Cに調整します。
2. ダストカバーを取り外し、レーザー走査型検眼鏡の電源を入れます。マシンに55°レンズを置きます。
3. イメージングソフトウェア( 材料表を参照)をセットアップし、遺伝子型、性別、年齢などの重要な情報を入力します。イメージングセッションが開始されたら、ICGA画像をキャプチャするための IR (赤外線チャネル)を選択します。

2. ICGAおよびFA前の動物調製

1. マウスの重量を量って、必要な麻酔の量(ケタミン/キシラジン70-100 / 2.5-10 mg / kg、 材料表を参照)を決定します。
   注:代謝プロファイルはマウス株によって異なるため、投与量の最適化は非常に重要です。.イメージングを完了する前にマウスが目を覚ますこと、または過剰摂取や動物の死亡の可能性のリスクを避けるために、適切な投与量を決定することが不可欠です。
2. 1 mLの滅菌シリンジと30〜32 Gの針を使用して、腹腔内注射で麻酔を送達します。.マウスの片方の足をそっとつまんで、マウスに適切に麻酔がかけられているかどうかを確認します。動物が何らかの反応や動きを示した場合は、次のステップに進む前に、さらに時間待つことをお勧めします。これにより、動物は落ち着き、その後の処置に最適な条件を確保します。
3. 1%トロピカミド点眼液を投与して、マウスの両眼を拡張します。眼球運動およびまばたきを減らすために両目で0.5%のプロパラカインの塩酸塩の低下( 材料のテーブルを見なさい)を使用する前に少なくとも30秒待ちなさい。これに続いて、潤滑剤のアイジェルドロップで。
   注:麻酔の全期間を通じて、角膜混濁につながる可能性のあるマウスの目の極度の乾燥の問題に対処することが重要です。この不透明度により、視界が妨げられるため、その後のイメージングが困難になります。これを防ぐには、潤滑剤の点眼薬を継続的に塗布して、マウスの目の潤いを保つことが重要です。
4. マウスを温水パッドの上に置きます。
   注:マウスは表面積と体積の比率が高いため、環境への熱損失が増加します。麻酔による体温低下と組み合わさると、マウスに重大なリスクをもたらし、低体温症による死亡につながる可能性があります。低体温症を予防し、処置中のマウスの健康を確保するために必要な予防策を講じることが重要です。
5. 2 mg/mL ICG と 20 mg/mL フルオレセイン色素の 1:1 容量の混合物を調製します( 材料表を参照)。1 mLのシリンジと32 Gの針を使用して腹腔内注射により、250 μLの混合物を投与します。.
   1. 臓器に穴が開かないように、マウスの腹部の左下、後ろ足の近くの後脚に針を挿入します。
   2. プランジャーを慎重に引き出し、シリンジキャップに血液が入っていないことを確認します。一定のペースを維持しながら、ゆっくりと着実に染料を注入していきます。
      注:ICG色素は、使用前に0.22 μmシリンジフィルターでろ過する必要があります。

3. ICGAとFA

1. イメージングプラットフォームの加熱パッドにマウスを置き、イメージングを開始します。
2. マウスの本体をカメラに対して 45 度の角度で配置し、頭を少し下に回転させます。これにより、視神経をカメラの焦点の中心に置くことができます。
3. 綿棒を使用して、目を丁寧に拭き、最初に画像化されている目の潤滑剤の点眼薬またはジェルの層を取り除きます。イメージング手順の完了後、すぐに潤滑剤ゲルドロップを塗布してください。
   注意: 麻酔中に1分以上潤滑せずに目を放置することはお勧めしません。
4. カメラをマウスの目に向かって動かします。アクイジションモジュールから FAチャンネル を選択します。FAチャネルから放出される発光は、マウス角膜の中心に配置するために使用され、より迅速な配置が可能です。
5. 視神経が画面の中心になるようにマウスの頭を配置し、レーザー走査型検眼鏡を斜めに傾ける必要がないようにします。マウスの頭の位置を少し調整して、目的の位置合わせを実現します。
6. アクイジションモジュールで、 ICGAチャンネルを選択します。レーザー強度が100%に設定されていることを確認し、適切なレンズに合わせて55°オプションを選択します。これにより、レーザー走査型検眼鏡の最適な設定が保証されます。
   注意: 過飽和を防ぐために、初期段階をイメージングする場合は、通常約25%〜50%の低いレーザー強度を使用する必要があります。この範囲でレーザー強度を調整すると、過飽和を引き起こすことなく、鮮明で正確な画像をキャプチャできます。
7. イメージングソフトウェアで目が画面全体を占めている場合は、感度とフォーカスの設定を調整して、CNVメンブレンの最も鮮明な画像を取得します。
   1. 取得モジュールの 丸い黒い ボタンを回して、画像の感度を調整します。
   2. 検眼鏡の つまみ を回してピントを調整します。FAを用いて網膜血管系を可視化するための最適な焦点は、典型的には35〜45D(ジオプター)の範囲内である。一方、ICGAを使用して脈絡膜を視覚化するための理想的な焦点は、一般的に10〜15Dの間です。
      注:CNVメンブレンのサイズが異なるため、血管形態の最適なイメージングを得るには、10〜30Dで焦点を調整する必要がある場合があります。
8. ピントと感度を調整して最適な画像が得られたら、画像取得モジュールの 丸い黒い ボタンを押して画像を正規化します。ノーマライゼーションが完了したら(すべてのフレームがキャプチャされたら)、タッチスクリーンパネルの 取得 ボタンをクリックして画像を保存します。CNVをさまざまな角度から撮影するには、カメラを動かす必要がある場合があります。また、マウスをさまざまな位置に向けることで、CNV病変の最良の画像を提供することができます。
   注:視神経から血管系を見るときは、レーザー走査型検眼鏡の焦点または位置を再調整する必要がある場合があります。
9. アクイジションモジュールを使用して FAチャンネル に切り替えます。手順3.6〜3.7に記載されているのと同じ手順を実行して、各画像の感度と焦点を調整し、CNV病変の漏れをキャプチャします。
   注意: CNV漏れの過飽和を回避し、漏れ領域を人為的に増やすために、正しい感度が選択されていることを確認してください。
10. 注入後3〜4分後のICGAおよびFAの「初期段階」を画像化します。
    注:「初期段階」とは、脈絡膜血管系がはっきりとはっきりと見える時期です。通常4〜8分の間に発生する中期では、網膜血管と脈絡膜血管ははるかに色あせて拡散します。後期(>8〜10分)が始まると、脈絡膜血管と網膜血管の両方が識別できなくなります。しかしながら、蛍光高CNV病変は、減少したバックグラウンドに対して最大のコントラストを示す。これらのタイミングは可変であり、注入するICG色素の濃度と量によって異なります。ICG色素の量が多いほど、各フェーズのタイムラインが長くなり、より明確な血管が得られる傾向があります。フェーズは、絶対的な時間ではなく、上記の主要な機能に基づいて定義する必要があります。
11. すべての画像を取得したら、ゲル潤滑剤または軟膏をマウスの目に塗布し、回復のために加熱パッド上でマウスを注意深く監視します。通常、マウスが完全に回復するまでに1.5時間かかります。
12. マウスが麻酔から完全に回復し、目覚めたら、マウスをケージと指定された保持エリアに戻します。
13. イメージングシステムとレーザーをシャットダウンする前に、画像をTIFFまたはJPEGファイルとしてエクスポートして、後で分析します。

4. RPE/脈絡膜フラットマウントと染色

1. 4%パラホルムアルデヒドで一晩目を固定します。PBSで目を3回洗います。水晶体と角膜を取り除きます。
2. ブロッキング溶液(10%ウシ血清アルブミン、0.6%Triton X-100 in PBS)中で室温で1時間インキュベートします。PBS洗浄を3回繰り返します。
3. イソレクチンGS-IB4、Alexa-flour 568コンジュゲート、抗α平滑筋アクチン抗体( 材料表参照)をブロッキング溶液中で一晩インキュベートします。
4. PBSで3回洗います。サンプルをAlexa Fluor 488ヤギ抗ウサギ二次抗体( 材料表参照)とともに室温で2時間インキュベートします。
5. エッジから赤道まで放射状に 4 回カットします。網膜¹⁷を慎重に取り外します。
   注意: 血管新生膜が誤って剥がれないように注意する必要があります。
6. フラットマウントコロイドをスライドガラスに取り付けます。共焦点顕微鏡を使用してCNVを可視化します。

プロトコルに続いて、ICGAおよびFAは、若齢(7〜9週間)および老齢(12〜16か月)のC57BL / 6Jマウスのレーザー誘導CNVで実施されました。FAはCNV病変の位置と漏出に関する情報を提供し(図1、左パネル)、ICGAはCNV病変の血管形態を明らかにします(図1、右パネル)。若いマウスでは、毛細血管CNVがCNV病変を支配しています。対照的に、年老いたマウスは、大口径の血管、血管ループ、および吻合部接続を特徴とする細動脈CNVを示します。若齢マウスも老齢マウスも、FAの網膜血管系がはっきりと見える(図1、左パネル)。若いマウスのICGA画像では、網膜血管系が見えず、脈絡膜血管が薄く見え、脈絡膜血管系に焦点を当てたICGAの中期を示しています。高齢マウスのICGA画像では、脈絡膜血管が薄色した状態で部分的な網膜血管系が観察され、老齢マウスでは細動脈CNVのサイズが大きいため、網膜と脈絡膜の間の焦点を持つ中期が示唆されます。高齢マウスの動脈CNVは、若いマウスの毛細血管CNVと比較して、CNVサイズが大きく(図2)、有意に多くの漏出を示します。抗平滑筋アクチン抗体による免疫染色は、高齢マウスのCNV血管系を広範囲に標識し、細動脈の形態を確認します(図3)。対照的に、α平滑筋アクチンによる最小限の染色は、毛細血管の形態と一致する若いマウスの病変部位の血管系で観察されます。

図1:若齢マウスと老齢マウスのレーザー誘導CNVを描写したFA画像とICGA画像の比較。 FA画像はCNV病変の漏出を示し、ICGAは血管形態の視覚化を提供します。スケールバー:200 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:ICGA画像に基づく若齢マウスと老齢マウスのCNV病変サイズの定量化。 CNV領域を測定し、若齢マウスと老齢マウスでそれぞれ合計26および14のレーザースポットを解析した。エラーバーは標準偏差±平均を表します。 統計解析は対応のない t検定を用いて行いました。P < 0.0001 です。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:RPE/脈絡膜フラットマウント上のAlexa 568イソレクチンおよび抗α平滑筋アクチン抗体と共標識した、若齢および老齢マウスのCNV病変の代表的な画像。 赤色はAlexa 568イソレクチン、緑色は平滑筋アクチン(SMA)αを表しています。スケールバー:100 μm。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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