ここでは、複合植物を生産するために アグロバクテリウムツメファシエンス によって媒介されるワンステップ形質転換方法の詳細なプロトコルを提供します。
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方法論記事
アグロバクテリウム・リゾゲネスに基づく毛状根形質転換による効率的かつ再現性の高い複合植物の生産法
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
Agrobacterium rhizogenesを介した毛状根の形質転換を用いて、トランスジェニック根と非トランスジェニック茎および芽を有する複合植物を作製することは、根関連の生物学を研究するための強力なツールです。毛状根の形質転換は、広範囲の双子葉植物およびいくつかの単子葉植物種において確立されており、遺伝子型とはほとんど無関係である。複合植物を得るためのA.根茎による胚軸注射の伝統的な方法は、非効率的で、時間がかかり、面倒であり、そしてしばしば柔らかくて小さな胚軸植物の死を引き起こす。A. rhizogenesによって媒介される非常に効率的なワンステップの毛状根形質転換が以前に確立されており、毛状根を生成した後の移植の必要性がなくなりました。この研究では、部分的な胚軸と一次根を取り除き、胚軸切開部位をA.リゾゲネスでコーティングし、次に胚軸を滅菌バーミキュライトに植えました。12日間の栽培後,胚軸切開部が拡大し,新たな毛状根が誘導された.本稿では、A. rhizogenesが媒介するワンステップ形質転換法の詳細なプロトコルを提供し、野生ダイズ、ナスアメリカナム、カボチャの複合植物を生産することによってその有効性を実証します。
概要
アグロバクテリウム根粒菌は、リゾビア科のグラム陰性土壌細菌です。 A.根粒菌は、ほとんどすべての双子葉植物、いくつかの単子葉植物、および個々の裸子植物に創傷を介して感染し、感染した植物に毛状の根を作り出す可能性があります。細菌はRi(根誘導)プラスミドを持ち、RiプラスミドのT-DNAはオピン合成遺伝子とロール遺伝子(根座遺伝子)を持っています。RiプラスミドのT-DNAが植物細胞に入り、宿主染色体に組み込まれた後、ロール遺伝子の発現により毛状根の産生が誘導されます1。目的遺伝子を持つ植物二元発現ベクターをA.リゾゲネスに形質転換し、形質転換したA.リゾゲネスを用いて植物に感染させる。 トランスジェニック根は、感染した植物において誘導され得、トランスジェニック根および非トランスジェニック茎および芽を含む複合植物を産生する。一般的に、複合植物は14-20日以内に得ることができます。A. 根茎媒介の毛状根形質転換は、一般に双子葉植物の遺伝子型によって制限されない2.A. rhizogenesに感染した植物が産生する毛状の根は、成長速度が速く、遺伝が安定しており、操作が簡単なという特徴があります。A. rhizogenesによって媒介される毛状根の形質転換は、現在、....
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プロトコル
1. 植物の生育条件と A. rhizogenes の培養
- 種まき
注:野生の大豆の種子は、中国の聊城市楊谷県で収集されました。 S. americanum の種子とカボチャの地元の品種Yinsuは市場から購入しました。- 野生の大豆、 S. americanum、および地元の種類のカボチャの種子を集め、1 cmの深さでバーミキュライトに播種し、十分に水をやります。8 cm x 11 cm x 9 cmのプラスチックの箱に20個の種子を植えます。24 ± 2°Cの成長チャンバーで、相対湿度約70%で16時間の明暗/ 8時間の暗サイクルで植物を栽培します。
注:野生の大豆種子のコートは、播種する前に割る必要があります。研究の質問が植物と微生物の間の相互作用に焦点を当てている場合、種子、バーミキュライト、プラスチックの箱、および水は使用前に滅菌する必要があります。 - A. rhizogenes K599の活性化と培養
注:A.リゾゲネスK599株は、赤色蛍光レポーター遺伝子DsRed2を有する1つのバイナリベクターpRed13052を有していた。- A. rhizogenes K599株を-80°Cの冷凍庫から取り出し、固体LB培地(50 mg/Lカナマイシン....
- 野生の大豆、 S. americanum、および地元の種類のカボチャの種子を集め、1 cmの深さでバーミキュライトに播種し、十分に水をやります。8 cm x 11 cm x 9 cmのプラスチックの箱に20個の種子を植えます。24 ± 2°Cの成長チャンバーで、相対湿度約70%で16時間の明暗/ 8時間の暗サイクルで植物を栽培します。
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結果
高効率ワンステップ A.リゾゲネス媒介有毛根形質転換
人工K599接種後12日目に胚軸切開部位に毛状根を作製した。トランスジェニック毛状根は、バイナリーベクターに含まれるレポーター遺伝子の発現に基づいて決定した。複合野生ダイズ、S. americanum、およびカボチャのレポーター遺伝子DsRed2で形質転換されたトランスジェニック根を、自然(図2A、図2C、および図2E)および緑色励起光(図2B、図2D、および 図2F)で観察しました。
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ディスカッション
ワンステップ A.リゾゲネス媒介毛根法は、胚軸注入法よりも単純で効率的な複合植物の生産方法です。ワンステップARM法は、毛状根の形質転換の効率を大幅に向上させ、毛状根を生成する時間を短縮し、毛状根の数を増やし、関連する作業量を減らします。改良された形質転換プロトコルは、マメ科植物と根粒菌の間、および植物とアーバスキュラー菌根菌の間の共生に関する研究に最適です。これは、毛状根の生産後の複合植物の移植が不要であり、移植中に生じる非接種株による汚染を回避するという事実に起因し得る。さらに、形質転換効率は1つの植物種(カボチャ)で100%であった。
以下の理由は、毛状根の形質転換において、ワンステップARM法が胚軸注射法よりも効率的であった理由を説明する可能性があります。まず、一次根を除去したが、苗の蒸散は維持された。これにより、蒸散引きは切開部における胚軸細胞へのA .リゾゲネス 浸潤を促進した。第2に,胚軸切開による創傷面積は胚軸注射法による創傷面積よりも大きかったため, A. rhizogenesの感染植物細胞が多かった。最後に、.......
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開示事項
著者には、宣言する利益相反はありません。
謝辞
この研究は、聊城大学研究基金(318012028)と山東省自然科学財団(ZR2020MC034)の支援を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| kanamycin | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. (カナマイシン サンゴン バイオテック (上海) 有限公司) | ||
| LBミディア | 三言生物科(上海)有限公司 | ||
| プラスチックボックス | LiaoSu | 8 cm x 11 cm x 9 cm | |
| カボチャ | 郷土品種陰蘇 | ||
| ストレプトマイシン | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | A610494 | |
| Tanon-5200Multi machine | Tanon Co., Ltd., China | 5200Multi | chemiluminescence imaging system |
| tomato | local variety Zhongshu4 | ||
| wild soybean | collected in Yanggu County, Liaocheng, China |
参考文献
- Chilton, M. D., et al. Agrobacterium rhizogenes inserts T-DNA into the genome of the host plant root cells. Nature. 295, 432-434 (1982).
- Fan, Y., et al.
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再版と許可
