方法論記事

定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)に基づく ヘリコバクターピロリ 感染と抗生物質耐性の迅速診断

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DOI：

10.3791/65689

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2023年7月28日

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1Laboratory Medicine, Guangdong Provincial People’s Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Southern Medical University, 2Division of Microbiology and Immunology, School of Biomedical Sciences, The University of Western Australia, 3Center for Precision Health, School of Medical and Health Sciences, Edith Cowan University, 4Medical Technology School of Xuzhou Medical University, 5Marshall Laboratory of Biomedical Engineering, School of Medicine, Shenzhen University, 6The Marshall Centre for Infectious Diseases Research and Training, The University of Western Australia, 7Marshall International Digestive Diseases Hospital, Zhengzhou University, 8Marshall Medical Research Center, Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、ストリングテストを通じて ヘリコバクターピロリ 胃感染症を迅速に診断するための非侵襲的な方法を提示し、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)を使用してクラリスロマイシンとレボフロキサシンに対する抗生物質耐性を決定します。

要約

ヘリコバクターピロリは、世界人口の約半分に感染する主要なヒト病原体であり、抗生物質耐性の増加により深刻な健康上の脅威になりつつあります。慢性活動性胃炎、消化性潰瘍疾患、胃がんの原因物質であり、国際がん研究機関によってグループIの発がん性物質に分類されています。したがって、ピロリ菌の迅速かつ正確な診断とその抗生物質耐性の決定は、この細菌性病原体の効率的な根絶にとって重要です。現在、ピロリ菌の診断方法には、主に尿素呼気検査(UBT)、抗原検査、血清抗体検査、胃鏡検査、迅速ウレアーゼ検査(RUT)、および細菌培養が含まれます。その中で、最初の3つの検出方法は非侵襲的であり、実施しやすい検査です。ただし、これらの手法では細菌を回収することはできません。したがって、薬剤耐性試験は実施できない。最後の3つは侵襲的な検査ですが、費用がかかり、高度なスキルが必要であり、患者に損害を与える可能性があります。したがって、ピロリ菌の検出と薬剤耐性試験のための非侵襲的、迅速、同時の方法は、臨床現場で効率的にピロリ菌を根絶するために非常に重要です。このプロトコルは、ピロリ菌感染と抗生物質耐性を迅速に検出するための定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)と組み合わせたストリングテストを含む特定の手順を提示することを目的としています。細菌培養とは異なり、この方法は、ピロリ菌の感染状態と薬剤耐性の容易、迅速、非侵襲的な診断を可能にします。具体的には、qPCRを用いて、ピロリ菌感染のレアと、クラリスロマイシンとレボフロキサシンに対する耐性をそれぞれコードする23S rRNAおよびgyrA遺伝子の変異を検出しました。日常的に使用されている培養技術と比較して、このプロトコルは、ピロリ菌感染を検出し、qPCRを使用して抗生物質耐性を決定するための非侵襲的、低コスト、および時間を節約する技術を提供します。

概要

ピロリ菌は、主に胃の幽門領域に生息するらせん状の運動性の高いグラム陰性菌です1。これは、世界人口の50%近くが感染する一般的な病原体です2。ピロリ菌感染症のほとんどの人は臨床症状がなく、慢性胃炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、胃がんなど、感染から数年後にさまざまな病気を発症します3。異なる集団に基づくいくつかの研究では、胃がんや前がん病変を予防するためのピロリ菌を排除することの有効性が実証されています4,5。そのため、世界保健機関(WHO)の国際がん研究機関は、予防措置としてピロリ菌の撲滅を勧告しています6。

ピロリ菌感染を特定するための非侵襲的方法の使用は、無症候性消化不良のほとんどの個人にとって治療の重要な要素です。尿素呼気検査(UBT)、ピロリ菌糞便抗原検査(SAT)、および血清学的検査は、一般的な非侵襲的技術です。これらの中で、UBTは利用可能な最も侵入が少なく、最も正確な手順です。UBTは、ピロリ菌に豊富に存在するウレアーゼを使用して、同位体標識された尿素をアンモニアと二酸化炭素(13Cまたは14C)に加水分解します。対照的に、イムノクロマトグラフィーアッセイ(ICA)7は、サンプリングに便利でシンプルで非侵襲的です。ただし、テストの精度は、便サンプルの品質、温度、サンプル収集とテストの間隔など、いくつかの要因の影響を受けます。免疫応答に基づく別の検査は、患者の血清中の抗体を検出する血清H.ピロリ抗体検査です。ただし、この検査は、細菌が除去された後も抗体が長く残るため、処理後の分析には適していません8。もう一つの大きな欠点は、これらの方法はピロリ菌感染を診断するだけであり、感受性に基づく治療を導く薬剤耐性試験ができないことです。

侵襲的な検査法では、胃生検組織を内視鏡検査で採取し、組織学、ウレアーゼ迅速検査、細菌培養を行う必要があります。これらのテスト方法も、いくつかの要因により非常に制限されています。現在、これらの技術は、高齢患者、前癌性疾患または悪性疾患のリスクが高い患者、および胃食道逆流症または ピロリ菌 感染の一次治療に失敗した患者に限定されています9。第二に、 ピロリ菌の独特の増殖特性により、細菌培養の成功率は50%にしか達しません10。したがって、分子検出法は、侵襲的検出法の高い要求を克服し、感度ベースの治療を導くための新しい希望を提供します。分子検出法の中でも、定量PCRは近年大きく進化しています。qPCRは、従来のPCRとは異なり、ゲル電気泳動を必要とせず、アニーリング段階でプライマーとプローブを添加することにより、サンプル中のDNA/RNAを正確に定量します。 ピロリ菌 感染および薬剤耐性を検出するためのqPCRキットが市販されている。それにもかかわらず、各方法には制限があります。したがって、患者の臨床診断と治療は、症状、徴候、病歴、他の臨床検査、および治療への反応と組み合わせて考慮する必要があります。

現在、 ピロリ菌 感染症の治療方法は抗生物質の服用が主流ですが、最近では抗生物質耐性の上昇により治療が難しくなってきています。その後、ピロリ 菌 の治療効果の大幅な低下が世界的に観察され、 ピロリ菌 の根絶が主要な公衆衛生上の問題となっています11。

クラリスロマイシンとレボフロキサシンは、ピロリ菌によって引き起こされる感染症の治療に使用される2つの広域抗生物質ですが、いくつかの研究では、ピロリ菌分離株におけるこれら2つの薬剤に対する広範な耐性が報告されています。A2143G、A2142G、およびA2142Cは、2.9 kb 23S rRNA遺伝子に見られる多数の点突然変異のうちの3つであり、マクロライドの結合を妨げることによってクラリスロマイシン耐性をもたらします。同時に、レボフロキサシン耐性遺伝子の突然変異遺伝子座は、主にgyrA遺伝子12の6つの突然変異部位(A260T、C261A、T261G、G271A、G271T、A272G)に位置する。遺伝子変異に基づくこれらの耐性メカニズムの発見は、文化ベースの研究を通じて、ピロリ菌の検出が分子検査に徐々に移行することにつながりました。

全体として、 ピロリ菌 感染および薬剤耐性を検出するための非侵襲的、効果的、かつ同時診断法の緊急の臨床的必要性がある。ストリングテストとqPCRを組み合わせた方法を採用して、サンプリングの難しさを克服し、異なるプライマープローブを使用して ピロリ菌 感染と薬剤耐性を同時に検出するという目標を達成しました。

プロトコル

本研究は、中国広州市南方医科大学広東省人民病院の倫理委員会が定めた倫理的配慮(承認番号:KY-Q-2022-384-02)に準拠して実施した。18〜60歳の年齢範囲の患者がこの研究に含まれました。抗生物質、抗菌漢方薬、プロトンポンプ阻害剤(PPI)などの薬を服用している患者、またはH2 受容体拮抗薬など、 テスト前2週間以内に、この研究には含まれていませんでした。過去3ヶ月間に H.ピロリ に対する治療を受けた患者もこの研究から除外されました。深刻な心臓、肝臓、腎臓の問題、重度の神経障害、または精神疾患のある人もこの研究に参加することを許可されていません。この研究には妊婦および授乳中の母親は含まれていなかった。本研究で使用した消耗品(試薬、薬品、機器、ソフトウェア)の詳細は、 材料表に記載されています。

1.胃液サンプリングのためのストリングテスト

  1. サンプル収集の前に一晩絶食するように患者に依頼します。
  2. 翌日、ストリングテストキットを開き、カプセルを取り、ストリングの端でループを保持します。
  3. ひもを患者の頬にテープで留め、カプセルを喉の奥近くの舌の上に置き、一口の水で飲み込むように依頼します。
  4. カプセルを患者の胃に溶かし、カプセル内のひもを露出させて胃粘液を吸収します。.
  5. 訓練を受けた助手に、患者がカプセルを飲み込んでから1時間後に紐を注意深く引き抜くように依頼します。.
  6. 胃液に浸したひも(40 cm)の下端を切り取り、TSE(トリス/生理食塩水/EDTA)サンプル保存液に入れ、室温(RT)で臨床検査室に送り、その後ピロ リ菌 を検出し、qPCRを使用して抗生物質耐性プロファイルを決定します。

2. DNA抽出

  1. 検体を運ぶ収集チューブを、適切にラベル付けされた試験管ラックに置き、10秒間ボルテックスします。
  2. 32ウェルプレート(核酸抽出または精製キット)を数回逆さまにして、磁気ビーズを再懸濁します。10秒間短い渦を流した後、プレートからアルミホイルシーリングを慎重に取り外します。
  3. 各サンプルとポジティブコントロールとしての ピロリ菌 DNAから200μLの胃液を別々のウェルに移します。
  4. 32ウェルプレートを核酸抽出機の対応するサンプルスロットに配置し、自動DNA抽出を行います。
  5. DNAの抽出と確認後、陽性サンプルのqPCRを介してクラリスロマイシンとレボフロキサシンの抗生物質耐性試験を開始します。
  6. 過剰な胃液と抽出したDNAサンプルを-20°Cで置き、長期保存と将来の使用に備えてください。
  7. 汚染を避けるために、バイオセーフティキャビネットでこれらすべての手順を実行してください。

3. ピロリ菌 の検出と抗生物質(クラリスロマイシンとレボフロキサシン)に対する耐性のためのqPCR

  1. ピロリ菌およびそのゲノム内の抗生物質耐性変異の疑いを検出するためにqPCRを実行します。
    1. qPCR反応液(ピロリ菌 核酸検出キット)を氷上で解凍し、試薬の損失を防ぐためにフリックやスピニングで混合します。
    2. 32ウェルプレート上の各サンプルについて、20 μLのPCR反応混合物(ジェノタイピング反応プレミックス[Taq酵素、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、反応バッファー、塩化マグネシウムを含む]、尿素フォワードプライマーとリバースプライマー、および 尿素 プローブ)と、抽出したDNA5 μLを混合します。
    3. 32 ウェル qPCR プレートを qPCR マシンで実行します。サーマルサイクラーをプログラムする:反応混合物は、最初に42°Cと95°C(両方とも1サイクル)でそれぞれ2分間順次反応します。その後、95°Cで40サイクル、変性を10秒間、アニーリングと伸長を58°Cで45秒間行った。
    4. 蛍光シグナル取得をFAM(H. pylori)に設定し、データ取得を増幅延長期間に設定します。反応が完了したら、将来の結果分析のためにデータを保存します。
    5. qPCR用の特定のソフトウェアを使用してデータを分析します, 機器は自動的にベースラインしきい値を選択します.
    6. ピロリ菌の検査結果が陽性の場合、機械は自動的にサンプルの薬剤耐性試験を開始します。試薬キットを、H.ピロリ菌(qPCR)キットの23S rRNA遺伝子およびgyrA遺伝子変異の検出試薬に置き換えます。
      注:試薬キット(ヘリコバクターピロリの23S rRNA遺伝子およびgyrA遺伝子変異[qPCR]の検出試薬)には、PCR反応混合物(ジェノタイピング反応プレミックス[Taq酵素、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、反応バッファー、塩化マグネシウムを含む])、プライマー、およびプローブ)が含まれています。すべての負の品質管理製品は滅菌精製水です。ピロリ菌核酸検出キットの陽性品質管理製品は、不活化ピロリ菌標準ビーズ(ATCC 43504)です。キット内の強ピロリ菌陽性および弱陽性の品質管理品(ピロリ菌の23S rRNA遺伝子およびgyrA遺伝子変異の検出試薬)は、標的遺伝子と変異遺伝子を含む不活化ピロリ菌株のDNAです。同様に、実際の状況に基づいて、ピロリ菌感染の有無や薬剤耐性を含むすべての診断基準は、CT ≤ 35に設定され、典型的なS字型の曲線を持っています。弱い品質管理の濃度は1.0 x 103コピー/ mLであり、強い品質管理の濃度は1.0 x 108コピー/ mLです。

結果

qPCR法による胃液中の ピロリ菌 感染と抗生物質耐性の検出
尿素A遺伝子を増幅してピロリ菌感染を検出するためにqPCRを行い、23S rRNA遺伝子とgyrA遺伝子の点突然変異を標的とすることで抗生物質耐性プロファイルを決定しました(表1)。qPCR実験の3つのグループすべての品質管理CT値は推奨範囲内であり、実験時にサンプルがすべて正常な状態にあり、テスト結果が信頼できることを示しています。この研究では、実験プロトコルの信頼性を特徴付けるために、異なるテスト結果(S1-S5)を持つ5つのサンプルが選択されました。S1は感染していないピロリ菌の代表的な株を表し、S2-S5サンプルは異なる耐性結果を持つピロリ菌に感染した株です(図1)。ピロリ菌に感染していない検体ではそれ以上の耐性試験を行わないように設定したため、ピロリ菌の陰性結果を示した後、S1検体は耐性試験に入らなかった。ピロリ菌感染陽性検体については、S2 CT値はすべて検出範囲内であり、ピロリ菌陽性であり、クラリスロマイシンとレボフロキサシンに対する二重耐性を示しており、臨床医は自分の裁量で他の治療法を選択することが推奨されました。S3 CT値はピロリ菌感染およびレボフロキサシン耐性試験の検出範囲内であったが、クラリスロマイシン耐性試験ではCT値は検出されず、S3サンプルがレボフロキサシン耐性患者からのものであることを示している。同様に、S4サンプルのCT値は、ピロリ菌感染およびクラリスロマイシン耐性の検出範囲内であったが、レボフロキサシン耐性についてはCT値が検出されず、この患者がクラリスロマイシンに耐性であることを示し、治療のためにレボフロキサシンを服用することが推奨された。最後に、S5サンプルテストは、ピロリ菌感染の検出についてのみ検出範囲内のCT値を示し、この患者は両方の抗生物質に敏感であり、2つの薬剤のいずれかを使用して治療できることを示しました。ピロリ菌感染や薬剤耐性も検出する細菌培養法と比較して、この方法は、患者にダメージを与えることなく、ピロリ菌感染や薬剤耐性を検出するのに安全で効果的であり、医師が適切な治療計画を立てる際に導くために使用できます。

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図1:qPCRによる胃液中の ピロリ菌 とその抗生物質耐性の検出。
(A) ピロリ菌 感染の定量的PCR増幅、(B)クラリスロマイシン耐性の検出、および(C)レボフロキサシン耐性の検出。「S」はサンプルを表します。「S1」は、 ピロリ菌 感染に対して陰性に戻り、抗生物質耐性についてもテストされたサンプルです。「S2」は、クラリスロマイシンとレボフロキサシンの両方に耐性のある ピロリ菌感染サンプルです。「S3」も ピロリ菌陽性サンプルですが、クラリスロマイシン感受性でレボフロキサシン耐性です。「S4」も ピロリ菌陽性サンプルですが、クラリスロマイシン耐性でレボフロキサシン感受性です。「S5」は ピロリ菌陽性サンプルですが、クラリスロマイシンとレボフロキサシンの両方の影響を受けやすいです。弱い品質管理の濃度は1.0 x 103 コピー/ mLであり、強い品質管理の濃度は1.0 x 108 コピー/ mLです。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

見本ピロリクラリスロマイシンレボフロキサシン
+/-ティッカー+/-ティッカー+/-ティッカー
S1-U-U-U
S2+22.61+22.77+23
S3+28.32-U+30.18
S4+28.76+27.67-U
S5+31.59-U-U

表1: ピロリ菌 感染の検出ならびにクラリスロマイシンおよびレボフロキサシンに対する耐性のqPCR結果を示す表。 この表は、 ピロリ菌 感染の定性的結果、分離株がクラリスロマイシンに耐性であることを示す23S rRNA遺伝子変異の検出、および分離株がレボフロキサシンに耐性であることを示す gyrA 遺伝子変異の検出を示しています。+/-、定性的結果。+、肯定的な結果。−、否定的な結果。

ディスカッション

ピロリ菌 の検出は、侵襲的および非侵襲的方法の両方を用いて行うことができる13。組織病理学、迅速ウレアーゼ検査、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、細菌培養などの一般的に使用される侵襲的技術には、内視鏡検査と生検が必要です。血清学的検査、尿素呼気検査、および酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)は、非侵襲的手順の中で推奨されます14。非侵襲的方法は、患者にとって実行が簡単で経済的で快適ですが、菌株同定や抗生物質感受性試験などの追加のアッセイを実行するための ピロリ菌 の単離と培養には、侵襲的な検査が必要です。抗生物質耐性の現在の上昇に伴い、以前に使用されていた抗生物質は無効になり、したがって、薬剤耐性 ピロリ菌 分離株によって引き起こされる感染症の治療に失敗しています。この場合、耐性菌の除去に成功する可能性が最も高い抗生物質を選択するために、抗生物質感受性試験を行うために ピロリ菌 を回収する必要があるかもしれません。

寒天希釈法やイプシロメーター試験(E検定)などの日常的に実施される培養ベースの感受性アッセイには、いくつかの制限があります:ピロリ菌は成長の遅い細菌であるため、時間がかかり、費用がかかり、スキルベースであり、侵襲的な技術が必要です。蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)技術やqPCRなどの交互に異なる分子ベースの技術を使用して、クラリスロマイシンに対する耐性をコードする23S rRNA遺伝子などのいくつかの変異を同定することができます15,16。クラリスロマイシンおよびレボフロキサシンに対する耐性を決定するためのプライマーおよびプローブを設計するために、ピロリ菌の23S rRNA耐性遺伝子の3点突然変異部位(A2142G、A2143G、A2142C)およびキノロン系抗生物質のgyrA耐性遺伝子の6点突然変異部位(A260T、C261A、T261G、G271A、G271T、A272G)をそれぞれ選択した。

ENTEO-TESTに由来するストリングテストは、吸収性の高いナイロンストリングに取り付けられたカプセルを使用し、それを飲み込んで胃分泌物を収集します17。現在、結核18の診断、毒性の高い肺炎桿菌(hvKp)と従来の肺炎桿菌19の区別、グラム陽性菌とグラム陰性の細菌と酵母の同定、胃液からのピロリ菌の診断にストリングテストが使用されています20。本研究では、低侵襲技術であるストリングテストとqPCRを組み合わせて、臨床現場でピロリ菌感染症を同定し、以前に報告されているピロリ菌ゲノムの耐性コード変異を標的とした感受性試験を実施しました。ureA遺伝子を選んだのは、ピロリ菌特有のハウスキーピング遺伝子であり、他の生物との交差反応のリスクがないからです。すべてのピロリ菌分離株は、ヒトの胃で生き残るためにureA遺伝子を持っている必要があり、ノックアウト実験では、ureA遺伝子を持たないピロリ菌は胃にコロニーを形成する能力がないことが示されています。

qPCRにとって、品質管理基準は非常に重要です。 ピロリ菌のqPCR検出では、品質管理基準の要件は次のとおりです:陰性品質管理製品(FAM検出経路における蛍光シグナルの増加なし、典型的なS型増幅曲線なし、CT値>35.00または明白なシグナルなし)。陽性の品質管理製品(S字型曲線を示すFAM検出経路の蛍光信号成長曲線、CT値≤35.00)、および上記の要件を同時に満たす必要があります。それ以外の場合、テストは無効と見なされ、再度実施する必要があります。さらに、抗生物質(クラリスロマイシンおよびレボフロキサシン)に対する ピロリ菌 耐性のqPCR検出については、陽性結果と陰性結果を区別するCT値が30.00に変化する以外は、他の要件は上記と同じです。特に、プライマーとプローブに関する配列情報は、商業的所有権を含むため、この論文では利用できません。

各患者により効率的な抗生物質を選択するためには、世界的に抗菌薬耐性が増加し、さらにさまざまな地域間の耐性パターンの違いによるピロ リ菌 の局所的な有病率とその抗生物質耐性プロファイルを調査することが重要です。私たちの研究の主な限界は、サンプルサイズが非常に小さく、ピロリ 菌 感染の有病率とその完全な抗生物質耐性プロファイルを示すために中国のさまざまな地理的地域をカバーしていなかったことですが、ストリングテスト技術は十分に開発されており、qPCRと組み合わせることで、 ピロリ菌 の同時診断を達成しました感染および薬剤耐性の検出。これらの結果は、このアプローチが世界のさまざまな地域でより大規模に使用できることを示唆しています。

謝辞

この作業は、深センの三明医学プロジェクト(助成金番号。SZSM201510050)および広東基礎応用基礎研究財団(助成金番号2022A1515220023)。広東省人民病院高度人材研究財団(No.KJ012021097)、および中国国家自然科学財団(81871734、82072380、82272423)。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備において何の役割も果たしていませんでした。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
23S rRNAおよびgyrA遺伝子点変異検出キット(PCR-蛍光プロービング)ホンメド・インファゲンヘリコバクター・ピロリのクラリトロマイシンおよびレボフロキサシンに対する耐性の検出
ABI 7500蛍光定量PCRマシンサーモフィッシャー・サイエンティフィックSEDA 20163220767蛍光定量PCR増幅
ABI 7500ソフトウェアサーモフィッシャー・サイエンティフィックデータ分析
BSC-1500IIA2-XバイオベースSEDA 20143222263バイオセーフティキャビネット
DNA抽出キットダーン・ジェネ 
E遠心分離機ウィールテックチューブの壁に残った液体を遠心分離して取り除きます。
H. ピロリDNA検出キット(PCR-蛍光プロービング)およびnbsp;ホンメド・インファゲンピロリ菌感染の検査
ストリームSP96自動核酸抽出器ダーン・ジーンセダ20140104DNA抽出のために、nbsp;
ストリングテストキットホンメド・インファゲンそこには紐に結ばれたカプセル、ハサミ、綿棒、サンプル保存チューブが含まれています。
超低温冷凍庫など、(DW-YL450) メリンセダ20172220091-20 & deg;Cは試薬の貯蔵とnbsp;
ボルテックス-5カイリンベル試薬の混合用に、nbsp;

参考文献

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qPCR DNA 23S rRNA

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