方法論記事

クライオ電子顕微鏡のための単層グラフェン被覆格子の作製

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DOI：

10.3791/65702

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2023年9月8日

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1Department of Structural and Computational Biology, Scripps Research

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、単分子膜のグラフェンを電子顕微鏡グリッドに塗布するためのプロトコールと、クライオ電子顕微鏡の構造決定に使用するための調製方法について説明します。

要約

極低温電子顕微鏡(クライオEM)は、高分子複合体の原子構造を調べるための強力な技術として登場しました。クライオ電子顕微鏡の試料調製では、通常、有窓支持フィルムの穴内に懸濁したガラス質氷の薄層に試料を保存する必要があります。しかし、クライオ電子顕微鏡研究で一般的に使用されるすべてのサンプル前処理アプローチは、試料を空気と水の界面に曝露するため、試料に強い疎水性効果をもたらし、多くの場合、変性、凝集、および複雑な解離を引き起こします。さらに、試料の領域と空気-水界面の間の好ましい疎水性相互作用は、高分子が採用する配向に影響を与え、異方性指向性分解能で3D再構成を行います。

グラフェンの単層へのクライオ電子顕微鏡試料の吸着は、バックグラウンドノイズの導入を最小限に抑えながら、空気と水の界面との相互作用を緩和するのに役立つことが示されています。グラフェン担体は、クライオ電子顕微鏡イメージングに必要なタンパク質の濃度を大幅に低減するという利点もあります。これらの支持体の利点にもかかわらず、グラフェンでコーティングされたグリッドは、商業的なオプションには法外な費用がかかり、大規模な社内生産に関連する課題があるため、クライオ電子顕微鏡コミュニティでは広く使用されていません。この論文では、単層グラフェンをほぼ完全にカバーするクライオ電子顕微鏡グリッドのバッチを調製するための効率的な方法について説明します。

概要

単粒子極低温電子顕微鏡(クライオEM)は、生体高分子の3D構造を研究するために使用される技術として、ますます応用が進んでいます。過去 10 年間の電子顕微鏡光学系、直接電子検出1、およびコンピューターアルゴリズム 2,3,4 の技術的進歩により、クライオ電子顕微鏡ユーザーは、生化学的に安定な高分子複合体の構造を原子に近い分解能で決定できるようになりました 5,6,7,8.これらの進歩にもかかわらず、クライオ電子顕微鏡イメージング用のサンプルの保存には顕著な障壁が残っており、生体試料の大部分をこのような高解像度に分離するのを妨げています。

この方法は、さまざまな生体試料の構造決定に使用されてきましたが、一般的に使用されているクライオ電子顕微鏡試料作製法はすべて、試料を疎水性の気水界面(AWI)にさらすため、高分解能の構造決定を制限する問題がしばしば発生します。生体試料はAWIに曝露されると変性する傾向が高く、複雑な凝集と分解につながる可能性があることが確立されています11、12、13、14。さらに、生体試料の表面上の疎水性パッチは、粒子を氷12中で好ましい配向をとらせる。多くのシナリオでは、サンプルの単一の疎水性領域により、すべての粒子が氷の中で単一の配向をとることを余儀なくされ、それによって信頼性の高い再構成を生成する能力が失われます。AWIの問題に加えて、試料は、フィルムの有窓層の表面に対する親和性を示し、穴15内の氷中に浮遊する粒子の数を制限する可能性がある。

AWIや映画との相互作用から生じるこれらの問題を軽減するために、いくつかの方法論的および技術的解決策が開発されました16,17。一般的なアプローチの1つは、EMグリッドの有窓フィルムをアモルファスカーボンの薄い層(数十ナノメートル)でコーティングすることです。このコーティングは、粒子が吸着できる穴全体に連続した表面を提供し、AWI15、18、19、20との相互作用からサンプルを部分的に遮蔽するという利点があります。しかし、炭素層が追加されると、イメージング領域のバックグラウンドシグナルの量が増加し、特に小さな(<150 kDa)試料では、達成可能な分解能を損なう可能性のあるノイズが発生します。近年、酸化グラフェン(GO)フレークを使用してクライオ電子顕微鏡グリッド上に支持膜を生成することは、従来のアモルファスカーボンよりも優れていることが示されています。GOフレークは、グラファイト層の酸化によって生成され、表面とエッジにカルボキシル、ヒドロキシル、およびエポキシ基の形で実質的な酸素含有量があるため、親水性の単層グラファイトの疑似結晶シートが得られます。水性懸濁液中の市販のGOフレークは安価であり、GOフレークをEMグリッドに適用するための多数の公開方法があります18,21。ただし、これらの方法では、多くの場合、グリッドが GO フレークで部分的にしか覆われず、領域に GO フレークの複数の層が含まれることになります。さらに、GOフレークは、薄いアモルファスカーボンで観察されたものに近いクライオ電子顕微鏡画像に顕著なバックグラウンドシグナルを寄与する22,23。

炭素原子の単一の2次元結晶アレイからなる原始的な単層グラフェンは、電子顕微鏡で位相差を生じないという点でGOとは異なります。したがって、単層グラフェンは、生体試料をイメージングするための目に見えない支持層を生成するために使用できます。また、単層グラフェンはGOよりも強度が高く、EMグリッド上に単層として適用することができ、近年のグラフェン被覆EMグリッドの作製技術の進歩により、高被覆単層グラフェングリッドを自社で作製することが可能になりました24,25,26,27,28,29,30.しかし、クライオ電子顕微鏡の構造決定にグラフェン被覆グリッドを使用する利点があるにもかかわらず、商業的な選択肢には法外な費用がかかり、社内生産が複雑なため、広くは使用されていません。ここでは、生体試料のクライオ電子顕微鏡構造決定のために、単層グラフェンで覆われたEMグリッドを効果的に製造するためのステップバイステップガイドについて説明します(図1)。この詳細なプロトコルに従うことで、クライオ電子顕微鏡の研究者は、1日で数十個の高品質グラフェン支持グリッドを再現性よく準備することができます。グラフェンでコーティングされたグリッドの品質は、LaB6フィラメントを備えたローエンドの透過型電子顕微鏡(TEM)を使用して簡単に調べることができます。

プロトコル

1. グラフェングリッドの作製に必要な材料と付属品の準備

注:グラフェンは容易に汚染されるため、グラフェンコーティングの効率とグラフェングリッドの品質が低下します。したがって、グラフェンと接触するすべての材料を完全に洗浄することが重要です。材料の準備とすべてのステップは、ドラフトに入れておく必要があります。

  1. グリッドをグラフェンでコーティングするために使用する必要な材料を集めます(図2A)。
  2. ガラス器具を脱イオン(DI)水で数回すすぎ、ほこり、糸くず、油性の残留物を取り除きます。
  3. 使い捨てワイプを使用してガラスカバーガラスを75%エタノールで洗浄し、エアダスターを使用して汚染物質を取り除きます。
    注:このプロトコルで使用されるクランプTEMグリッドホルダーブロックは、最大45グリッドを保持できます。グラフェングリッドの大量生産の場合、一度に45グリッド以下を準備できます。ただし、ラボでメソッドが確立されるまでは、小ロット生産(4〜6グリッド)から始めることをお勧めします。

2. 水中での0.2 M過硫酸アンモニウム(APS)の調製

注:このAPS溶液は、後のステップでグラフェン/Cuシートから銅(Cu)担体を除去するためのエッチング液として使用されます。常に新しいものを準備してください APS ソリューション。再利用された溶液や古い溶液は、銅を効果的にエッチングできず、後のステップでグラフェンに銅の残留物を残す可能性があります。

  1. 500 mLフラスコを脱イオン水(DI)水ですすぎ、200 mLの脱イオン水と電子レンジを最大設定で約1分間加え、水を脱気します。
  2. 200 mLの脱イオン水に9gの過硫酸アンモニウムを加えて、0.2 M APSの溶液を生成します。
    注意: APSは有毒であり、取り扱うときは個人用保護具(PPE)を着用することをお勧めします APS.処分する APS 廃棄物は、承認された廃棄物処理プラントで。
  3. マグネチックスターラーの攪拌子で溶液を攪拌し、フラスコをドラフトの下の真空源に接続します。
    注:APS溶液を脱気すると、気泡の形成を防ぐのに役立ち、ステップ6でのCuエッチングの効率が低下する可能性があります。

3.グラフェン/銅をあぶらとり紙できれいなカバーガラスに転写します

注:グラフェンサプライヤーのCu上に15 x 15 cmの化学気相成長(CVD)グラフェンフィルムを使用しています。市販の単層グラフェン/Cuシートは、真空下で保管する必要があります。グラフェンはCVD法によってCuの両面で成長するため、グラフェンサプライヤーは通常、品質チェックを行い、より良い面の使用を推奨します。このプロトコルでは、グラフェンのこの推奨側を「上側」、反対側を「裏側」と呼びます。

  1. あぶらとり紙を約20mm×40mmの長方形にカットします。この吸い取り紙は、グラフェン/Cuシートのパッドとして使用され、グラフェン/Cuシートのコーティングに使用される過剰なメタクリル酸メチル(MMA(8.5)MMA EL6)を吸収します。そのため、使用するグラフェン/Cuシートよりも大きなサイズにカットしてください。
  2. ポリイミドテープを使用して、あぶらとり紙の四隅を、自家製のスピンコーターに収まる清潔なカバーガラスの上部にテープで貼り付けます。
    注:ポリイミドテープは薄く、簡単に剥がすことができるため、取り扱いが容易です。
  3. グラフェン/銅シートを真空貯蔵庫から1枚取り出します。
  4. 清潔でほこりのないはさみを使用して、準備するグリッドの数を完全に覆うのに十分なCuグラフェンシートの小さな正方形を慎重にカットします。たとえば、5 x 5 の配列に配置された 25 個のグリッドの場合、18 mm x 18 mm のピースをカットします。グラフェン/Cuシートを、清潔で乾いたピンセットで吸い取り紙の上に置きます。グラフェン/Cuシートの裏面が下を向いていることを確認し、上面と裏面の区別がつきにくいため、誤ってグラフェン/Cuシートをひっくり返さないように注意してください。
  5. グラフェン/Cuシートの四隅を吸い取り紙/カバーガラスにテープで貼り付け、テープで覆われた領域は次のステップでMMAで覆われないため、テープとグラフェン/Cuシートの間の接触量を最小限に抑えます。
    注意: 静電気放電はグラフェンフィルムを損傷する可能性があるため、グラフェンまたはグラフェングリッドを取り扱うときは、電気的に接地された状態を維持し、静電気の蓄積を最小限に抑えることをお勧めします。これは、グラフェンまたはグラフェングリッドを取り扱う直前に、静電気リストストラップを着用するか、接地された金属物体に触れることで実現できます。

4.単層グラフェン/ CuシートにMMA(8.5)MMA EL6(MMA)の薄層をコーティングします

注:Cuがエッチングされた後、MMAのこの層はグラフェン単層をサポートし、将来のステップでグラフェンシートの取り扱いを可能にします。MMAコーティングは、グラフェンの単層だけでは透明になるため、グラフェン膜の可視化も可能にします。

  1. Hanらが以前に説明したように、テープで留められたグラフェン/Cuシートの入ったカバーガラスを、ヒュームフード内の自家製スピンコーター(これはコンピューターファンを使用して組み立てることができます)に置きます(図2B)。
  2. 安全ゴーグルを着用し、グラフェンシートにガラスピペットを使用してMMAを2滴加えると、すぐに最高速度で回転し始めます。
  3. 回転させながら、中央にさらに2滴加えます。1分間回転させます。
    注:グラフェンを完全にコーティングするのに十分なMMAが塗布されていることを確認してください。よくわからない場合は、さらに数滴追加します。グラフェンが完全にコーティングされていない場合、Cuがエッチングされた後に膜に「穴」が現れます。
  4. ドラフト内で10分間風乾します。

5. グラフェン/Cuシート裏面のグラフェンを除去する

注:銅の裏側(MMAでコーティングされていない面)で成長したグラフェンは、この過剰なグラフェンがCuエッチングの有効性を低下させるため、後続のステップに進む前に除去する必要があります。このグラフェンをプラズマに曝露することでこのグラフェンを除去しますが、これは、生物学的サンプル調製用のEMグリッドを準備するために通常使用されるグロー放電装置を使用して行うことができます。

  1. テープを慎重にはがし、MMAコーティングされたグラフェン/Cuシートを清潔で乾いたピンセットでカバーガラスから持ち上げます。
  2. MMA /グラフェン/ Cuシートの部分を、MMA面を下にして、清潔でほこりのないガラスカバーガラスにテープで貼り付けます。
  3. MMA/グラフェン/Cuシートを含むカバーガラスをグロー放電装置に挿入し、ネガティブ染色またはクライオ電子顕微鏡サンプル調製のグリッドを準備する際に通常使用される設定を適用します。
    注意: グラフェンフィルム上の酸化銅(CuO)(ナノ)粒子の汚染につながる可能性のある裏面のCuの酸化を防ぐために、長時間のグロー放電は避ける必要があります。

6. APS溶液中のMMA/グラフェン/CuシートからCuをエッチングします。

  1. ドラフト内で、作りたてのAPS溶液200 mLを清潔でほこりのない結晶化皿(150 x 75 mm)に注ぎます。
  2. MMA/グラフェン/Cuシートをスライドガラスから取り除きます。どちらの側にMMAが含まれているかを追跡します。
  3. エッチングを開始するには、プラズマ処理されたCu面を下にしてMMA/グラフェン/CuシートをAPS溶液の表面に置きます。幅広のガラスビーカーをアルミホイルまたは蓋で覆い、ほこりが入らないようにします。
  4. 3時間インキュベートします。1時間経ってもCuの大部分がエッチングされない場合は、セクション2〜6の手順を繰り返してから、次の手順に進みます。
    注:1時間経ってもCuの大部分がエッチングされない場合は、膜のMMA/グラフェン側がCu側ではなくAPS溶液の表面に配置されている可能性があります。Cuは3時間後に完全にエッチングする必要があり、Cuが完全にエッチングされた場合、MMA/グラフェン膜は無色です。グラフェンは汚染しやすいため、グラフェンの品質に悪影響を与えるため、表面に糸くずや脂っこい残留物が蓄積しないように、必ず容器を覆ってください。

7. MMA/グラフェンフィルムを脱イオン水ですすいでください

  1. ドラフトで、清潔でほこりのない結晶化皿に脱イオン水を入れます。
  2. APS溶液の表面に対して~45°の角度で配置された清潔でほこりのないガラスカバーガラスで、グラフェンMMAフィルムをそっとすくい上げます。
  3. スライドガラスを水に対してほぼ90°の角度で配置し、MMA/グラフェンがスライドからゆっくりと滑り落ちて水面に浮かぶように、ガラスカバーガラスを水中にそっと下ろします。
  4. MMA/グラフェンフィルムを水面に1時間置いて、APSを洗い流します。

8.グラフェンの単層でコーティングするグリッドをきれいにします

注:グラフェンがグリッドフォイル表面に付着する最大限に活用するには、グラフェンの転写先となるグリッドをできるだけきれいにする必要があります。市販のグリッドには、グラフェンを転写する前に除去しなければならない残留汚染物質が含まれていることがよくあります。

  1. 3つの結晶皿をきれいにして乾かし、ほこりがないようにします。
  2. ドラフト内で、200 mLのクロロホルム、アセトン、イソプロピルアルコール(IPA)を3つの結晶化皿のそれぞれに注ぎます。結晶化皿をアルミホイルで覆い、有機溶媒の蒸発を最小限に抑えます。
    注意: クロロホルムとアセトンは皮膚の炎症を引き起こし、吸入すると有毒になる可能性があります。これらの有機溶剤への曝露を制限し、PPEを着用してください。
  3. 200 mLのクロロホルムを含む最初の結晶化ディッシュの底に、クランプTEMグリッドホルダーブロックのベースを置きます。
  4. 各グリッドをグリッドボックスからグリッドホルダーブロックのウェルに個別に移し、有窓フィルム側が上を向いていることを確認します。結晶化皿をアルミホイルで覆い、オービタルシェーカーの上に置き、30分間静かに振とうします。
  5. 金属製の蓋をグリッドホルダーブロックに置き、次の結晶化ディッシュへの移し替え中にグリッドを固定します。曲がったフォークと長いピンセットでグリッドホルダーブロックを結晶化皿から慎重に持ち上げ、200 mLのアセトンを含む2番目の結晶化皿の底に置きます。グリッドホルダーブロックから蓋を外し、オービタルシェーカーで30分間静かに振る。
  6. グリッドホルダーブロックに蓋を置き、200 mLのIPA溶液を含む結晶化皿に移して、アセトン残留物を取り除きます。グリッドホルダーブロックから蓋を外し、20分間静かに振とうします。
  7. グリッドホルダーブロックから有窓フィルム面を上に向けてグリッドを、あぶらとり紙で覆われたガラスシャーレに個別に移します。
  8. ドラフトの下でグリッドを少なくとも30分間乾燥させ、ほこりがグリッドに付着しないようにグリッドが覆われていることを確認します。

9.きれいなグリッドを、脱イオン水の下のステンレス鋼の金網または穴あきトレイに置かれた吸い取り紙に移します

注:グリッドは、グラフェンを水に浮かべてグリッドに降ろすことができるように、平らな面のDI水の下に沈める必要があります。これは、Palovcakらによって記述されているように、市販のグリッドコーティングトラフを使用して、または酸化グラフェングリッドを生成するために使用されるペトリ皿と蠕動ポンプを使用して実行できます18。

  1. ステンレス鋼のメッシュまたはトレイをグリッドコーティングトラフに置き、純水ですすいでください。
  2. ステンレス製のメッシュ/トレイより少し小さい吸い取り紙を切り、脱イオン水に浸してプラットフォームの上に置きます。
    注:あぶらとり紙は、移動と取り扱いを可能にするためにプラットフォームよりもわずかに小さくなっています。
  3. 洗浄したグリッドを、あぶらとり紙の上に有窓フィルム面を上にして静かに移します。グリッドは疎水性である可能性が高いため、グリッドを垂直に水に沈めるか、水の張力により曲がる可能性があります。グリッドを正方形の配列に配置して、互いにできるだけ近づけますが、重なり合わないようにします(図2C)。
  4. これで、グリッドをグラフェン単分子膜でコーティングする準備が整いました。水面がグリッドから少なくとも5mm上になるように、グリッドコーティングトラフにさらにDI水を入れます。

10. グラフェンをグリッドに転写する

  1. グラフェンフィルムから少し離れた角度でゆっくりとトラフにカバーガラスを下げて、きれいなカバーガラスで結晶化皿からMMA/グラフェンフィルムを慎重にすくい取ります。シートとカバーガラスの端が平行になるようにカバーガラスをグラフェンMMAシートの下に置き、カバーガラスを水から垂直に持ち上げて、MMA /グラフェンフィルムを持ってきます。
  2. MMA/グラフェンフィルムがカバーガラスから剥がれて水面に浮かぶように、カバーガラスを~45°の角度で水中に下げて、MMA/グラフェンフィルムをトラフに移します。
  3. 水位が下がる前に、MMA/グラフェンフィルムをグリッドの真上に配置します。先端を溶かしたガラス製のパスツールピペットを使用して開口部を密閉し、MMA/グラフェンフィルムの位置を慎重に操作します。
  4. シリンジで水位を約1.25 mL/分でゆっくりと下げ、MMA/グラフェンフィルムがろ紙に着地するときにグリッド表面を完全に覆うようにします
    注:水位が下がったときにグリッド上の位置を維持するために、グラフェンMMAシートをさらに操作する必要がある場合があります。
  5. 清潔で乾いたピンセットを使用して、グリッドを保持している吸い取り紙を持ち上げて、清潔で乾燥したほこりのないペトリ皿に入れるか、ステンレス鋼のプラットフォーム全体を移します。
  6. ドラフトの下でMMA/グラフェングリッドを少なくとも30分間風乾します。ほこりの粒子による汚染を防ぐために、グリッドをアルミホイルまたは蓋で覆ってください。
  7. グリッドをインキュベーターに移し、65°Cのインキュベーターで30分間焼きます。
  8. インキュベーターからグリッドを取り外し、室温で5分間蓋をして、グリッドを室温まで冷却します。

11. MMAの取り外しとグリッドのクリーニング

注:グラフェンでコーティングされたグリッドにMMAが残るのを防ぐために、MMAはアセトンで完全に洗い流す必要があります。

  1. ドラフト内で、室温で200 mLのアセトンを含む2つの晶析皿と200 mLのイソプロパノール(IPA)を含む1つの晶析皿を準備します。結晶化皿をアルミホイルで覆い、有機溶媒の蒸発を最小限に抑えます。
    注意: アセトンは皮膚の炎症を引き起こす可能性があり、吸入すると有害である可能性があるため、アセトンを取り扱うときはPPEを着用してください。
  2. クランプTEMグリッドホルダーブロックのベースを、200 mLの新鮮なアセトンを含む最初の結晶化ディッシュの底に置きます。
  3. あぶらとり紙からグリッドホルダーブロックのウェルに各グリッドを個別に移し、MMA側が上を向いていることを確認します。結晶化皿をホイルで覆い、オービタルシェーカーの上に置き、30分間静かに振とうします。
  4. 金属製の蓋をグリッドホルダーブロックに置き、次の結晶化ディッシュへの移し替え中にグリッドを固定します。曲がったフォークと長いピンセットでグリッドホルダーブロックを結晶化皿から慎重に持ち上げ、200 mLの新鮮なアセトンが入った2番目の結晶化皿の底に置きます。グリッドホルダーブロックから蓋を外し、オービタルシェーカーで30分間静かに振る。
  5. グリッドホルダーブロックに蓋を置き、200 mLのIPA溶液を入れた結晶化皿に移して、アセトン残留物を取り除きます。グリッドホルダーブロックから蓋を外し、20分間静かに振とうします。
  6. あぶらとり紙で覆われた小さなガラスシャーレにグリッドを移し、少なくとも10分間風乾します。ほこりの粒子による汚染を防ぐために、グリッドを蓋で覆ったままにしてください。
  7. グリッドは、真空デシケーター内でアルミホイルで包まれたグリッドボックスに使用または移す準備ができています。
    注:真空デシケーター内にグラフェングリッドを保管すると、周囲条件による疎水性粒子の汚染を防ぐことができます。これらのグリッドは、使用前に最大数か月間保存できます27。

12. UV/オゾン処理によるグラフェングリッドの親水性化

注:グラフェンは非常に疎水性であり、ブロットプランジアプローチでは、サンプルの滴が均一に広がる親水性の表面を必要とするため、クライオ電子顕微鏡サンプル調製には適していません。従来のグロー放電デバイスは、プラズマを穏やかにパルスさせてグラフェン表面を親水性にするように構成できますが、これらのデバイスは薄いグラフェン単層を破壊する傾向があります。UV/オゾンクリーナーを使用してグラフェン25の表面に部分的に酸素を供給し、単層を損傷することなくクライオ電子顕微鏡サンプル調製に親水性にできることが以前に示されました。

  1. プライミングが必要なUV /オゾンシステムを使用している場合は、システムの電源を入れ、ランプを10分間プライミングします(このステップでは、グリッドが露出していないことを確認してください)。UV /オゾンクリーナーがプライミングされている間に、真空デシケーターからグリッドを取り外し、きれいなカバーガラスに移します。
  2. UV/オゾンシステムの準備ができたら、グラフェン面を上にしてグリッドを含むカバーガラスをUV/オゾンクリーナーに置き、グリッドをオゾンガスに4分間さらします。
  3. オゾンに曝露した後は、すぐにグリッドを使用してクライオ電子顕微鏡サンプルを調製してください。
    注:プライミングが必要なUV/オゾンシステムを使用する場合は、ランプを10分間プライミングした直後にグリッドをクリーナーに入れる必要があります。グリッドをオゾンガスに6分以上さらすと、グラフェン層が破壊されますので、やめてください。

結果

ここで説明するグラフェングリッド製造プロトコルの実行に成功すると、グラフェンの単層で完全にコーティングされたEMグリッドが得られます。グリッドのグラフェンカバレッジは、任意のTEMを使用して確認できます。TEMではクリーンなグラフェンの単分子膜はほとんど見えないため、顕微鏡の回折モードで調べ、グラフェンを構成する炭素原子の六方晶組織に対応するブラッグスポットを観察する必要があります(図3A)。MMAコーティング中に導入される単層グラフェンのしわが時折観察されるのは正常です(図3B)。また、グラフェンで覆われた穴の1つの中央で高倍率の画像を取得することで、グラフェンに存在する汚染レベルを確認することもできます(図3C)。高分解能検出器で取得した場合、この画像のフーリエ変換には、2.14 Å の炭素-炭素間隔に対応するブラッグスポットが含まれているはずです(図4C)。炭素原子の単分子膜は位相差を生成するのに十分な電子散乱を生じさせないため、クリーンなグラフェンの画像は、画像のフーリエ変換においてコントラスト伝達関数に関連するトーン環を示さない。しかし、製造後のグラフェングリッドの汚染を防ぐことは非常に困難であり、EMグリッドの洗浄やグラフェンコーティング後のMMAの除去が不十分な場合、グリッドに顕著な汚染物質が実空間画像で見えるようになります(図3C)。図 4 に示すように、0.5 mg/mL のアポフェリチンを穴あき金グリッドに適用した場合(図 4A)、グラフェン担体を使用しない場合(図 4B)を比較すると、グラフェングリッドはサンプルに濃縮効果を発揮します。アポフェリチンなどのタンパク質のクライオ電子顕微鏡構造を高分解能で解析するために、同様のグラフェン製造プロトコルが以前に報告されている25,27。

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図1:グラフェンでコーティングされたクライオ電子顕微鏡グリッドを作製するための概略図。 グラフェングリッド製造プロセスにおける主要なステップを図示する。略語:クライオEM = cryogenic electron microscopy;MMA =メタクリル酸メチル;APS = 過硫酸アンモニウム。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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図2:グラフェングリッドを作るために必要な材料 。 (A)クライオ電子顕微鏡グリッドのコーティングに必要な材料は、それに応じてラベル付けされています。(B)スライドガラス上のあぶらとり紙にグラフェン/銅シートをテープで貼り付けたコーターの拡大図。スピンコーターは、地元のコンピューター/金物店から部品を購入して組み立てることができます。(C)水位制御に使用できるシリンジに取り付けられたグリッドコーティングトラフの拡大図。グリッドは、ステンレス鋼メッシュ上の吸い取り紙の上に配置されます。あぶらとり紙は、グラフェンシートをグリッドに合わせることができるように、グリッドの位置を操作するのに役立ちます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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図3:しわやMMA汚染を示すグラフェングリッドの代表的な回折パターン画像と明視野画像 。 (A)グラフェンの単層で覆われたEMグリッドは、回折モードのTEMでイメージングすると、グラフェンの六方格子に対応するブラッグピークを示します。2.14 Å の炭素-炭素間隔に対応するブラッグピークは丸で囲まれ、矢印で示されています。(B)単分子膜の皺(矢印で示す)がある単層グラフェングリッドの明視野画像。(C)MMA汚染のある単層グラフェンの明視野画像(矢印で表示)。スケールバー = 100 nm (B,C)。略語:EM =電子顕微鏡法;MMA = メタクリル酸メチル。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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図4:グラフェンで覆われた金グリッド上のアポフェリチン:(A)グラフェンで覆われた金グリッド上の0.5 mg/mLアポフェリチンのクライオ電子顕微鏡写真。(B)同じ濃度で画像化されたアポフェリチンは、グラフェンを含まない穴の開いた金グリッドを使用して調製した場合、実質的に低い濃度で見ることができます。(C)グラフェンで覆われた金グリッド上の0.5 mg/mLアポフェリチンのクライオ電子顕微鏡写真のFFT(ブラッグピークは六方形グラフェン格子に相当)。スケールバー = 100 nm (A,B)。略語:クライオEM = cryogenic electron microscopy;FFT = 高速フーリエ変換。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

生体試料をガラス質氷の薄層に保存することは、高分解能クライオ電子顕微鏡による構造決定にとって非常に重要なステップです。しかし、研究者はしばしばAWIとの相互作用から生じる問題に遭遇し、好ましい配向、複雑な分解、変性、凝集を引き起こします。さらに、サンプルは、有窓フィルムの穴を横切って吊り下げられた薄い氷を埋めるのに十分な濃度を常に確保できるとは限りません。いくつかの研究グループは、これらの制限24,25,26,27,28,29,30のいくつかを克服するために、EMグリッドをグラフェンの単層でコーティングする方法を開発し、グラフェングリッドは大きな成功を収めています。ここでは、グラフェングリッドのバッチを社内で効果的に準備し、TEMでグラフェングリッドの品質を調べるためのステップバイステップの説明を提供します。私たちは、以下に概説するいくつかの重要なステップにおいて、特別な注意を払う必要があることを強調します。

グラフェンは、空気中の汚染物質を引き寄せる傾向が強い。したがって、グラフェングリッド製造プロセスでは、グラフェン/ Cuシートまたはグリッドと接触するすべてのツールが清潔でほこりがないことを確認することが重要です。グラフェンの転写に使用されるガラスカバーガラスは、エタノールと純脱イオン水ですすぐか、エアダスターを使用して洗浄できます。また、ドラフトの下で作業し、グラフェンシートとグリッドを常にホイルまたは清潔なガラス板で覆っておくことをお勧めします。グリッド上のほこりや汚染物質は、グラフェンがEMグリッドに完全に付着するのを妨げる可能性があります。グラフェンまたはグラフェン被覆グリッドを取り扱う場合、静電気放電によるグラフェン膜の損傷を防ぐために電気的に接地することが重要です。静電気放電は、リスト接地ストラップを使用すること、グラフェンまたはグラフェングリッドが取り扱われるたびに接地された金属物体に触れること、および/またはピンセット24を保持している手に手袋を着用しないことによって回避することができる。

グラフェンの単層は非常に薄い(炭素原子の幅)ため、グラフェンをグリッドに転写する際には、MMAやポリMMA(PMMA)などの有機層でグラフェンを支持することが重要です。PMMAは、グラフェンの転写に最も広く使用されている材料です。しかし、PMMAはグラフェンと強い親和性を持ち、多くの場合、グラフェンフィルムにポリマー汚染を引き起こす可能性があります。MMAは、残留汚染が少ないため、このプロトコルで使用されます25。しかし、PMMAとMMAの両方に、グラフェン膜の一部の領域に見られるしわや亀裂が形成されるという欠点があります(図3B)。これらのしわは、CVD法31によるグラフェン成長中に一般的に発生するため、回避することは困難な場合がある。最近では、銅箔をCu(111)/サファイアウェーハに置き換えて成長基板とする、シワのない超平坦グラフェンを成長させる方法が開発された32。

これまでの経験から、銅エッチング後に脆くなり、後工程での取り扱いが難しいポリマー被覆Cuグラフェンシートをメーカーから購入するよりも、グラフェン/Cuシートを購入し、MMAでグラフェンを自社でサポートする方が良いとしています。MMAコーティングに使用したスピンコーターは、前述のように、地元のコンピューター/ハードウェアストアの部品を使用して安価に構築できます25。

MMAコーティングの工程では、Cu-グラフェンシート上のグラフェン表面全体をMMAで覆うことが重要です。銅がエッチングされた後、MMAグラフェンは半透明になり、MMAの被覆がない領域は空の穴のように見えます。銅面のMMAコーティングを防ぐためには、コーティング中に吸い取り紙を下に置き、CVDフィルムからスピンアウトする余分なMMAを吸収することが重要です。

エッチングとすすぎの後、MMA/グラフェンシートは、水位を制御するためにシリンジまたは蠕動ポンプを備えた市販または自家製のトラフシステムを使用してEMグリッドに移す準備が整います。転写ステップの前に、クロロホルム、アセトン、IPAの連続した浴でグリッドを完全に予備すすぐことが重要です。グラフェンでコーティングされたグリッドを65°Cで焼成すると、グラフェンの完全性が維持され、グリッドへのグラフェンの吸着が促進されます。最後に、グリッド上のMMA汚染を防ぐためには、アセトン浴でMMAを完全に除去し、IPAでグリッドを洗浄することが重要です。洗浄されていないMMAの残留物はEMグリッドで観察され、画像のS/N比が低下します(図3C)。アセトン-IPA洗浄プロセスを繰り返して、グラフェン表面をさらに洗浄することができます。

グラフェングリッドを親水性にするために、グリッドをUV/オゾンに曝露しました。UV/オゾン洗浄剤のモデルによっては、グラフェンに損傷を与えることなく、クライオ電子顕微鏡サンプル調製用のグラフェン層に十分な酸素を供給するための最適化が必要な場合があります。システムに関係なく、UV/オゾン処理直後のクライオ電子顕微鏡試料塗布には、これらのグリッドを使用することが重要です。グラフェングリッドを親水性にする別の方法は、他の研究33,34で説明されています。

開示事項

著者には開示すべき利益相反はありません。

謝辞

Scripps Researchでこれらの方法を確立する際に有益な議論をしてくれたXiao Fan博士に感謝します。B.B.は、ヒューイット医学研究財団のポスドク研究員の支援を受けました。W.C.は、全米科学財団の博士課程前フェローシップの支援を受けています。D.E.P.は、米国国立衛生研究所(NIH)のG.C.L.への助成金NS095892によってサポートされています。このプロジェクトは、NIHの助成金GM142196、GM143805、およびG.C.L.へのS10OD032467によっても支援されました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
70% EtOHPharmco (190 pf EtOH)241000190CSGL
アセトンSigma Aldrich650501-4L
過硫酸アンモニウム (APS)Sigma Aldrich215589-500g危険; 細心の注意を払ってください
クロロホルムSigma AldrichC2432-1L
クランプ TEM グリッド ホルダー ブロック 45 グリッド用PELCO16830-45
コンピュータファンアマゾン(Noctua)B07CG2PGY6
カバースリップベルコガラス1203J71標準カバースリップ
結晶化皿パイレックス3140-100
電子機器ダスターファルコン安全製品75-37-6
ファルコンダストオフエアダスターステープルズN / A
フィルターペーパーWhatman1001-055
ファインチップピンデュモン0508-L4-PO
フラスコパイレックス4980-500
フォークスーパーマーケットN/A
ガラス パスツールピペットVWR14672-608
グラフェン/CuグラフェンN/ACVD単層グラフェン CU
グリッド コーティング トラフLadd Research Industries10840やすい
イソプロパノールフィッシャーサイエンティフィ67-63-0
カプトンテープアマゾン(MYJOR)MY-RZY001ポリイミドテープ
キムワイプフィッシャーサイエンティフィック06-666
twzeerコールパーマーエッセンシャルUX-07387-15
メタルグリッドホルダーテッドペラ16820-81
MMA(8.5)MMA EL 6KAYAKU Advanced MaterialsM31006 0500L 1GL可燃性
モデル 10 ラボオーブンQuincy Lab, Inc.
シャーパイレックス3610-102
プラズマクリーナー(ソララス950)ガタン株式会社N / A
はさみFiskars194813-1010
標準アナログオービタルシェーカーVWR89032-088
UltrAuFoil R1.2 / 1.3 - Au300ォンティフォイルN / Aホーリーゴールドグリッド
紫外線オゾンクリーニングシステムUVOCSモデルT10X10 / OES
セット 壊れックロングFO19013レ ク

参考文献

  1. Li, X., Zheng, S. Q., Egami, K., Agard, D. A., Cheng, Y. Influence of electron dose rate on electron counting images recorded with the K2 camera. Journal of Structural Biology. 184 (2), 251-260 (2013).
  2. Tang, G., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  3. Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. eLife. 7, 1-22 (2018).
  4. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  5. Grigorieff, N., Harrison, S. C. Near-atomic resolution reconstructions of icosahedral viruses from electron cryo-microscopy. Current Opinion in Structural Biology. 21 (2), 265-273 (2011).
  6. Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
  7. Zhang, K., Pintilie, G. D., Li, S., Schmid, M. F., Chiu, W. Resolving individual atoms of protein complex by cryo-electron microscopy. Cell Research. 30 (12), 1136-1139 (2020).
  8. Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
  9. Schultz, P. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).
  10. Nguyen, H. P. M., McGuire, K. L., Cook, B. D., Herzik, M. A. Manual blot-and-plunge freezing of biological specimens for single-particle cryogenic electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. 2022 (180), 1-16 (2022).
  11. Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-em grids. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 25 (3), 289-313 (2016).
  12. Glaeser, R. M., Han, B. -G. Opinion: hazards faced by macromolecules when confined to thin aqueous films. Biophysics Reports. 3 (1-3), 1-7 (2017).
  13. Han, B. G., Watson, Z., Cate, J. H. D., Glaeser, R. M. Monolayer-crystal streptavidin support films provide an internal standard of cryo-EM image quality. Journal of Structural Biology. 200 (3), 307-313 (2017).
  14. Noble, A. J., et al. Routine single particle CryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, 1-42 (2018).
  15. Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (6), 560-571 (2018).
  16. Liu, N., Wang, H. W. Better cryo-EM specimen preparation: how to deal with the air-water interface. Journal of Molecular Biology. 435 (9), 167926(2022).
  17. Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nature Methods. 15 (10), 793-795 (2018).
  18. Palovcak, E., et al. A simple and robust procedure for preparing graphene-oxide cryo-EM grids. Journal of Structural Biology. 204 (1), 80-84 (2018).
  19. Patel, A., Toso, D., Litvak, A., Nogales, E. Efficient graphene oxide coating improves cryo-EM sample preparation and data collection from tilted grids. bioRxiv. , (2021).
  20. Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. Fabrication of carbon films with ~500nm holes for cryo-EM with a direct detector device. Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).
  21. Pantelic, R. S., Meyer, J. C., Kaiser, U., Baumeister, W., Plitzko, J. M. Graphene oxide: A substrate for optimizing preparations of frozen-hydrated samples. Journal of Structural Biology. 170 (1), 152-156 (2010).
  22. Pantelic, R. S., et al. Graphene: substrate preparation and introduction. Journal of Structural Biology. 174 (1), 234-238 (2011).
  23. Russo, C. J., Passmore, L. A. Progress towards an optimal specimen support for electron cryomicroscopy. Current Opinion in Structural Biology. 37, 81-89 (2016).
  24. Passmore, L. A., Russo, C. J. Specimen preparation for high-resolution cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 51-86 (2016).
  25. Han, Y., et al. High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (2), 1009-1014 (2020).
  26. Zheng, L., et al. Robust ultraclean atomically thin membranes for atomic-resolution electron microscopy. Nature Communications. 11 (1), 541(2020).
  27. Ahn, E., Kim, B., Cho, U. -S. Batch production of high-quality graphene grids for cryo-EM: cryo-EM structure of Methylococcus capsulatus soluble methane monooxygenase hydroxylase. bioRxiv. (Cvd), (2021).
  28. Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (24), 11718-11724 (2019).
  29. Fan, H., Sun, F. Developing graphene grids for cryoelectron microscopy. Frontiers in Molecular Biosciences. 9, 937253(2022).
  30. D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. eLife. 8, e42747(2019).
  31. Zhang, X., et al. Evolution of copper step beams during graphene growth by CVD method. Applied Surface Science. 610, 155518(2023).
  32. Zheng, L., et al. Uniform thin ice on ultraflat graphene for high-resolution cryo-EM. Nature Methods. 20 (1), 123-130 (2023).
  33. Fujita, J., et al. Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis. Scientific Reports. 13, 2279(2023).
  34. Lu, Y., et al. Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM. Nature Communications. 13, 6718(2022).

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