縫合糸拡張マウスモデルにおける骨リモデリングのための3次元可視化技術

頭蓋顔面縫合糸は、頭蓋顔面骨をつなぐ線維組織であり、頭蓋顔面骨の成長とリモデリングに重要な役割を果たします。縫合糸の構造は川に似ており、膜内骨形成を介して頭蓋顔面骨の形成に寄与する骨形成前線として知られる「川岸」に栄養を与えて構築するための細胞資源の流れ^{を提供します1。}

頭蓋顔面縫合糸への関心は、頭蓋縫合糸の早期閉鎖と顔面縫合機能障害を理解したいという臨床的ニーズによって推進されてきました。開腹縫合糸切除術は臨床治療で日常的に使用されていますが、長期追跡により、一部の患者で不完全な再骨化の再発が示されています²。拡張スプリングまたは内視鏡的ストライプ頭蓋切除術による低侵襲開頭術は、組織を廃棄するよりも、潜在的な縫合糸を保存するためのより安全なアプローチを提供する^{可能性があります3。}同様に、フェイスマスクや拡張器具などの整形外科的治療は、矢状または水平上顎形成不全の治療に広く使用されており、いくつかの研究では、年齢制限を延長して、ミニスクリュー支援口蓋エキスパンダーを介して成人患者を治療しています^4,5,6。さらに、間葉系幹細胞(MSC)と生分解性材料を組み合わせた頭蓋縫合糸再生は、将来の潜在的な治療法であり、関連疾患の治療に新しい方向性を提供します⁷。しかし、縫合糸の機能過程や調節機構は、いまだに解明されていない。

骨リモデリングは、主に骨芽細胞による骨形成と破骨細胞による骨吸収のバランスから成り立っており、力学的信号によって刺激された幹細胞の骨分化が重要な役割を果たします。何十年にもわたる研究の結果、頭蓋顔面縫合糸は高度に可塑性の間葉系幹細胞のニッチであることが判明しました⁸。縫合幹細胞(SuSC)は、間葉系幹細胞(MSC)または骨幹細胞(SSC)に属する幹細胞の不均一なグループです。SuSCは、Gli1、Axin2、Prrx1、Ctskの4つのマーカーによって in vivo で標識されています。 特にGli1⁺ SuSCは、幹細胞の生物学的特性を厳密に検証しており、典型的なMSCマーカーの高い発現を示すだけでなく、優れた骨形成能および軟骨形成能も示しています⁹。これまでの研究では、Gli1⁺ SuSCが引張力下での新しい骨形成に積極的に寄与していることが示されており、伸展骨形成をサポートする縫合糸幹細胞源として特定されています¹⁰。

過去には、幹細胞の広範な機械的特性が、Flexcell、4点曲げ、マイクロマグネットローディングシステムなどを介してin vitroで研究されていました。マウスの頭蓋縫合糸由来の間葉系細胞がin vitroで同定され¹¹、ヒト縫合糸間葉系幹細胞も最近単離された¹²が、in vitro系では縫合糸細胞の生体力学的応答は不明のままである。骨リモデリングプロセスをさらに調査するために、単離された頭蓋骨器官培養に基づく縫合糸拡張モデルが確立され、有用なin vivo縫合糸^{拡張モデルを確立する}ための道が開かれました^1,13。ウサギ¹⁴およびラット¹⁵は、縫合糸拡張のための基礎研究において最も広く用いられている動物である。しかし、マウスは、ヒトとの相同性の高いゲノム、多数の遺伝子改変系統、および強力な生殖ハイブリダイゼーション能力により、ヒト疾患を探索するための好ましい動物モデルです。頭蓋縫合糸拡張の既存のマウスモデルは、典型的には、矢状縫合糸に引張力を加えるためにステンレス鋼の歯列矯正スプリングワイヤーに依存している^16,17。これらのモデルでは、拡張装置を固定するために頭頂骨の両側に2つの穴が開けられ、ワイヤーが皮膚の下に埋め込まれているため、細胞活性化モードに影響を与える可能性があります。

可視化法に関しては、矢状方向のスライスの2次元観察が数十年にわたって一般的に採用されてきました。しかし、骨のリモデリングが複雑な3次元の動的プロセスであることを考えると、完全な3次元情報を取得することが急務となっています。PEGASOS組織透明技術は、この要件を満たすために登場しました^18,19。硬組織と軟組織の透明性に独自の利点があり、完全な骨リモデリングプロセスを3次元空間で再現することができます。

骨リモデリング期間の生理学的変化をより深く、より包括的に理解するために、手作りのホルダー間にバネをセットした標準的な矢状縫合糸拡張マウスモデルが確立されました¹⁰。標準化された酸エッチングおよび接着手順により、拡張装置を頭蓋骨にしっかりと接着し、矢状縫合糸に垂直な引張力を発生させることができました。さらに、PEGASOS組織透明化法は、縫合糸拡張後の骨モデリングの変化を完全に視覚化するために、拡張後の石灰化骨の二重標識後に適用されました。

ここで説明するすべての実験手順は、上海交通大学医学部上海第九人民病院の動物管理委員会によって承認されました(SH9H-2023-A616-SB)。この研究では、4週齢のC57BL/6雄マウスを使用しました。使用した器具はすべて、手順の前に滅菌されました。

1. 縫合糸拡張モデルの準備

1. 2つの保持ホルダーの準備。
   1. 0.014インチのオーストラリア線またはステンレス鋼線( 材料表を参照)を使用して、ライトワイヤープライヤーでらせん状のループを作成します。ループの直径は2mmで、1mmのテールが両側に確保されています(図1A)。
   2. 手術用のワイヤーとホルダーをオートクレーブ、プラズマ滅菌器、または適切な低温滅菌剤(グルタルアルデヒドなど)で滅菌します。
2. スプリングの準備。
   1. カスタマイズされたステンレス鋼のばねを準備します。
      注:この研究では、線径0.2 mm、外径1.5 mm、間隔1 mm、長さ7 mmの圧力スプリングを使用します(図1B)。1mmのスプリング圧縮ごとに、約30gの推力が得られました。
   2. セットする前に、スプリングを利用可能な長さにカットします。実験前に特殊ばねの力を確認してください。
      注:ばねのサイズは、力の大きさが並行実験で同じである限り、変化します。力は、条件が制限されている場合は、卓上一軸試験装置または小型電子動力計(材料表を参照)によって測定されます。長さの変化は、力の大きさに対して評価されます(図1C-E)。特に、スプリング力荷重の値は、マウスの年齢、骨の状態、研究対象に応じて変化させる必要があります。
   3. 長さ7mmのオーストラリア線または鋼線を1本用意し、バリアとして使用する直径2mmの紙を2枚作ります(図1F)。

2.矢状縫合糸拡張手術

1. 麻酔:マウスにチレタミン(25 mg/kg)、ゾラゼパム(25 mg/kg)、キシラジン(10 mg/kg)を麻酔します。同時に、角膜の乾燥を防ぐために滅菌眼軟膏を目に塗ります。つま先をつまんでマウスの麻酔の深さを判断します。
   注:次の特徴は、マウスが適切に麻酔されていることを示しています:ゆっくりと安定した呼吸、手足の脱力感、筋肉の弛緩、皮膚鍼灸反射とまぶた反射の消失、および角膜反射の弱さ。
2. 毛皮の除去と消毒:脱毛クリームで頭頂部の毛を慎重に取り除きます。目に触れないでください。その後すぐに、ヨードフォアと75%アルコールを交互に使用して、手術部位を消毒します。マウスに鎮痛剤としてメロキシカム(1mg/kg)を皮下注射で投与する。
3. 体位固定:マウスを正面に置き、手術台に手足を固定するためにサージカルテープを使用します。
4. 頭皮フラップを開く:手術用ハサミを使用して、マウスの首の近くの頭皮に沿って弓状のフラップを行い、矢状縫合糸と周囲の頭蓋骨を完全に露出させます。その後、手術台に6-0縫合糸で頭皮フラップを固定します。
5. 酸エッチング後に保持ホルダーを接着します。
   1. 頭蓋骨を乾燥させ、37%リン酸で20秒間エッチングし、通常の生理食塩水を使用して酸エッチングをクリーンアップします(図2A)。ゴム製のピペットバルブで頭蓋骨を乾燥させた後、白亜質の残留物が明らかになります。
   2. 矢状縫合糸から3mm離れた頭頂骨の両側に、2つのホルダー(ステップ1.1で準備)を光硬化接着剤でセメントで固定します(図2B)。
6. 頭皮フラップをリセットします。
   1. 頭皮フラップを手動で元に戻します(図2C)。ホルダーの位置にラベルを付け、両側の保持ホルダーの対応する位置で頭皮に2つの小さな穴を開けてから、羽ばたいた頭皮をリセットします。
   2. 同時に、小さなループを穴に通して、肌の表面を露出させます。湾曲した切開部を6-0縫合糸で縫合します(図2D)。皮膚の回復には1〜3日かかります。メロキシカム(1 mg / kg)を24時間ごとに1〜3日間皮下注射でマウスに投与します。.
      注意: 手術後は、マウスの頭皮の活動とホルダーが脱落していないかどうかを毎日確認してください。肌には、色や厚さなどさまざまな種類があります。健康な皮膚の頭皮は元の色を維持し、縫合後に皮膚の縁が徐々に融合します。頭皮の感染症が見つかった場合、または手術器具が脱落した場合は、マウスを研究から取り除き、安楽死させます。
7. スプリングとガイドワイヤーを取り付けます。
   1. スプリングを2つのホルダー間の距離より1mm長くカットします。
   2. 選択したプレッシャースプリングを圧縮し、両側の小さなコイルの間に置きます。
   3. ステンレス線を小さなコイルとスプリングに通し、スプリングを解放して約30gの始動推力を得ます。
   4. マウスのバネ部分の下の頭皮が圧迫されていないことを確認します。
   5. 緩みがなくしっかりしていることを確認したら、スプリングとホルダーの間に2枚の紙切れを光硬化型接着剤で接着し、スプリングの両端にバリアを設置します(図2E、F)。

3.石灰化した骨の二重標識

1. 原液の調製。
   1. 0.9%NaClおよび2%NaHCO₃を含む蒸留水で希釈溶液を調製します。
   2. 希釈液を使用して、20 mg/mLのアリザリン複合体二水和物と10 mg/mLのカルセインを調製します( 材料表を参照)。
   3. pH測定器を使用してpHを7.4に調整します。測定の合間にpHプローブを洗い流して、正確な測定値を確保します。
   4. 染料を滅菌容器に入れ、4°Cの冷蔵庫に保管します。箔は光を遮断するために使用されます。
2. 作業ソリューションを準備します。注射する前に、溶解溶液を使用して、原液をカルシウムの場合は 1 mg/mL、アリザリン複合体二水和物の場合は 2 mg/mL に希釈します。
3. 腹腔内に 5 mg/kg のカルセイン グリーンと 20 mg/kg のアリザリン レッドを 2 つの時点で注射して、石灰化した骨を標識し、2 つの時間の間の変化を分析します。通常、注入の12-14時間後サンプルを集めて下さい。
   注:注入前に染料を温め、注入時間が3分以上であることを確認してください。注入間隔は、膨張の時間によって異なります。この研究では、アリザリンレッドとカルセイングリーンをそれぞれ伸長前に一晩(O/N)注入し、採取前にO/Nを注入しました。
4. 2回目の注射の翌日に組織除去手順のために準備された頭蓋骨全体を採取します。

4. EdU染色

1. 腹腔内注射:マウスを安楽死させる2時間前に腹腔内にEdUを注射します(施設で承認されたプロトコルに従います)。用量は1 mg / 10 g体重です。.
2. ラベリングカクテル調製:混合トリス緩衝生理食塩水(最終100 mmol/L、pH 7.6)、CuSO₄ (最終4 mmol/L)、スルホシアニン3アジ化物(最終2-5 μmol/L)、アスコルビン酸ナトリウム(最終100 mmol/L、使用ごとに新鮮)を混合します( 材料表を参照)。
3. EdUホールマウント染色:PEGASOS組織透明化法の組織脱色ステップ(ステップ7)の後、サンプルをラベリングカクテルに室温(RT)で1日間入れます。

5. マイクロコンピュータ断層撮影イメージング

1. 組織の固定と保存:頭蓋骨を4°CのO/Nで4%パラホルムアルデヒド(PFA)に固定し、スキャンする前に0.5%PFAで保存します。
2. スキャンと分析:高解像度、ボクセルサイズ7μmのマイクロコンピュータ断層撮影(μCT)イメージングシステムでサンプルをスキャンします。

6. ペガソス組織透明化のための作業液の調製

1. 4% ポリホルムアルデヒド(PFA):PFA 粉末 4 g を 1× PBS に 100 mL に溶解します。
2. 心臓灌流溶液:0.02%ヘパリン、すなわち、1×PBSに溶解した20mgのヘパリン粉末を100mLまで;あるいは、0.05 mol/L EDTA、つまり0.05 molのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)( 材料表を参照)を脱イオン水溶液に溶解して、総容量が1 Lになるようにします。
3. 脱灰溶液:0.5 mol/L EDTA、すなわち0.5 molのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を脱イオン水溶液に溶解し、総容量1 Lにします。
4. 脱色溶液:25%Quadrol、250 mLのQuadrol(N、N、N'-Tetrakis (2-Hydroxypropyl)エチレンジアミン)( 材料の表を参照)を脱イオン水に溶解して総容量1 Lにします。
   注:Quadrolの粘度により、構成前に60°Cに加熱して流動性を高めることができます。
5. 脱脂液:30%、50%、70%tert-ブタノール(tB)( 材料表参照)、体積分率で水で調製。
   注:純粋なtBは室温で結晶性であることを考えると、使用する前に溶解するまで60°Cに加熱する必要があります。続いて、3%〜5%(v / v)のトリエタノールアミン(TEA)を添加して、溶液のpHを調節します>9.5。
6. 脱水溶液:TB-PEG溶液、70%tB+27%PEG-MMA+3%Quadrol(v/v)、ここでPEG-MMAは平均分子量500のポリ(エチレングリコール)メチルエーテルメタクリレート(ポリ(エチレングリコール)メタクリレート500、PEG-MMA500)( 材料表参照)。
7. 透明溶液:BB−PEG溶液、75%BB+22%PEG-MMA+3%クアドロール(v/v)、ここでBBは安息香酸ベンジル(BB)である。

7. PEGASOS法による頭蓋骨の透明度

1. 麻酔薬の腹腔内注射(ステップ2.1)でマウスを麻酔し、ピンチ反応でマウスの麻酔深度を判断し、心臓灌流前に抵抗反応がないことを確認します。
2. 心臓灌流と固定を行います。
   1. マウスの腹部を上に保持し、手足を粘着テープで固定し、胸部の円周に沿って慎重に切断して完全に露出させます。
   2. 眼科用ハサミで右心房に小さな切り込みを入れた直後に、左心室の頂点に灌流22Gの針を挿入します。
      注意: 過度の挿入による心臓弁の損傷を避けるために、針先のみが挿入されます。そうしないと、心灌流液が肺循環に入り、体循環の灌流効果に影響を与えます。
   3. 30〜50 mLの心灌流液(ステップ6.2)をシリンジに押し込みます。.肝臓が真っ赤から徐々に青白くなっていく様子が分かります。
   4. 右心房からの流出液が完全に透明になったら、4%PFA溶液を等量注入します。PFA灌流の操作は、換気されたフードで行われます。
   5. 組織および臓器を解剖して分離し、4% PFAで4°Cで一晩固定します。
3. 組織脱灰:EdU染色で処理したサンプルの場合、固定した硬組織を0.5 mol/L EDTA(pH 7.0)溶液(10 mL)に37°Cの振とう台で約2日間入れ、毎日液体を交換します。
   注:シグナル伝達を完全に保存するために、カルシウムキレート剤標識骨の正規化PEGASOS法では脱灰プロセスをスキップしてください。骨を処理して内因性蛍光またはホールマウント免疫染色シグナルを可視化するには、脱灰が必要です。
4. 組織の脱色:固定した頭蓋骨を25%クアドロール溶液(20mL)に37°Cの振とう台に1日間入れ、液体を1回交換します。
   注:脱色時間は、組織内のヘム含有量に関連しています。色の濃さは輸液置換治療を継続する必要性を表しているため、処理液の色を観察します。
5. EdU染色:サンプルを1× PBSで5分間(3回)リンスした後、標識カクテルに1日間浸します。その後、サンプルを1× PBSで1時間(3回)すすぎます。
6. 組織の脱脂と脱水
   1. 組織を30%tB、50%tB、および70%tB溶液に順番に入れ、37°Cの振とう台でグラジエント減少を実行します。 各濃度で約2時間入れます。
   2. 続いて、サンプルをTB-PEG溶液中で37°Cの振とう台で6時間脱水します。
      注:上記の処理時間は、組織の数に応じて増減できます。
7. 組織の透明性:完全に脱水した組織をBB-PEG溶液に浸し、透明になるまで37°C(2〜4時間)の振とう台に置きます。現在、サンプルは最大1〜2年間保存できます。
   注:ほぼ完全にクリアした後、チューブの蓋を開けてサンプルと媒体を振とうで空気にさらすと、透明度がさらに向上します。この方法は、個々の組織や臓器、および若いマウスの頭や体全体の透明性を向上させるのに適しています。しかしながら、成体マウスの全身の透明性のためには、上記のステップはフルサイクル灌流法を用いて行うべきである。

8. イメージング

注:この研究では、透明組織の3D可視化に共焦点顕微鏡を使用しました。ライトシート顕微鏡もこのプロトコルに適しています。いくつかのオペレーティングシステムは、以前に利用可能であることが確認されています。ここでは、レーザー共焦点顕微鏡のオペレーティングシステムを例として取り上げます( 材料表を参照)。

1. ユーザーマニュアルに従って、正しい手順に従ってレーザー共焦点およびLASAF操作インターフェースを開きます。さまざまな撮影チャンネルで必要なレーザーをオンにし、出力を調整します。光路と対応する波長(アリザリンレッドは561 nm、カルセイングリーンは488 nm)を設定し、ラベリングカクテルに従ってEdU信号に使用されます。
2. 透明なサンプルを、厚い標本、埋め込みボックス、または防水接着剤などの自作の配置装置を運ぶことができる凹面ガラスシャーレに入れて、透明なサンプルを透明な液体に浸します。
3. 低倍率の対物レンズを選択して、サンプルをすばやく見つけます。高速スキャン機能で頭蓋骨組織全体を俯瞰し、イメージングの対象領域を見つけます。
4. 出力電力を設定し、スキャンモードを選択し、最初に撮影係数(解像度、スキャン速度、ズーム率、画質、平均バックグラウンドノイズ など)を調整します。
   注意: 通常、スマートゲインの範囲は500〜800です(信号とノイズの両方の変化)。スマートオフセットは、画質を確保しながら、可能な限り 0 に近づけます(バックグラウンドノイズを低減するため)。PMTゲインが800より高い場合、またはHyDゲインが100%を超え、それでも輝度が不十分な場合は、レーザー強度を適切に上げることができますが、原則として、低いほど良いです。
5. 軸方向の距離 Z 範囲と、透明な組織の最も浅い側からドリルダウンされる Z ステップを設定します。つまり、最も深い辺と最も浅い辺を設定します。
   注意: 各レンズの分類と作動距離を確認してください。Zレンジを慎重に設定し、選択したレンズの限界を超えて作動距離を操作しないでください。「z-Galvo」は、細かい調整が必要な場合に選択できます。
6. 撮影パラメータを再度設定して、撮影を開始します。完了したら、多機能モジュールを介して画像をマージして処理します。最後に、指示された順序で機器を保管およびシャットダウンします。

このプロトコルを用いて、矢状縫合糸拡張のマウスモデルが確立されました(図1-2)。縫合糸拡張後の骨モデリング変化を3D可視化するために、PEGASOS組織透明化法を拡張後の頭蓋骨全体に適用しました。灌流後、頭蓋骨を分離し(図3A)、適切なPEGASOSプロセスを継続した(表1および表2)。驚くべきことに、頭蓋骨は、脱灰が行われたかどうかにかかわらず、完全なPEGASOSプロセス後にほぼ透明になりました(図3B、C)。

増殖後の変化を迅速に可視化するために、採取して固定したサンプルにμCTを使用しました。対照群(図4A)と比較して、頭蓋縫合糸は1日間力を加えた後、徐々に有意に拡大した(図4B)。5日目までに、骨縁にふわふわの骨突起が現れました(図4C)。

拡張後の縫合糸全体の石灰化並置率を3次元的に可視化するために、脱灰されていない頭蓋骨に対しても、効率的なPEGASOS技術とともにデュアルラベリング法を採用しました(図5)。生理学的条件下では、事前の標識シグナル間にわずかな変化が見られ(図5A)、力負荷は骨形成を有意に活性化しました。新たに石灰化した骨のジグザグパターンは、単一のカルシウム黄緑色のマーカーで標識され、7日間拡大した後に広がりました(図5B、C)。高解像度の3次元可視化では、辺縁骨のパターン変化は縫合糸拡張後の骨リモデリングプロセスを示し、縫合糸の両側で新たに形成された骨の程度が変化しました(図5C)。

さらに、縫合糸拡張時の細胞の増殖速度を可視化するために、石灰化プロセスを伴うPEGASOS組織透明化法を用いて、ホールマウントEdUの取り込みを試みました。成功裏に、標識は効率的で、透明な組織でよく保存されました。対照群では、いくつかのEdU+細胞が縫合糸全体にびまん性に分布しており(図6A)、これは生理学的骨リモデリングに重要であり、2D切片作成では見落とされる可能性があります。1日間増殖させると、増殖細胞は縫合糸の中央と端でピークに達しました(図6B)。縫合糸が広がるにつれて、増殖細胞の数は時間の経過とともに減少し、7日目に達しました(図6C)。強調表示された細胞は骨髄の小さな丸い細胞であり、EdU+縫合細胞とは異なる血球を示しました(図6C)。

図1:手術に必要な材料を準備しました。 保持ホルダーはステンレス鋼線で作られました。それらの直径は2mmで、1mmの尾部は両側に予約されていました(A)。線径0.2mm、外径1.5mm、間隔1mmの加圧ばね(B)を適用した。引張力はダイナメータ(C、D)によって検出されました。この実験では、1mmのばね圧縮ごとに約30g(E)の推力が得られました。紙切れを直径2mmの凧の形に切り取り、バリア(F)として使用しました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:縫合糸拡大マウスモデルの手術プロセス。 頭蓋骨フラップを反転させた後、保持ホルダーが露出する位置で酸エッチング(A)と接着(B)を行いました。頭皮フラップ(C)をリセットした後、ホルダーはマークされた位置(D)で露出しました。2つのホルダーの間には、頭蓋縫合糸に膨張力を加えるためのバネをセットし、ホルダーがしっかりと接着されていることを確認した上で、バネの両端に2枚の紙切れをバリア(E,F)として固定しました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:PEGASOS組織除去手順は、脱灰の有無にかかわらず、2つの頭蓋骨に適用されました。 灌流後、頭蓋骨が分離し、血痕のついた軟部組織が付着した(A)。脱灰過程(B)または非脱灰過程(C)を経験した頭蓋骨は、PEGASOSの全過程の後、ほぼ完全に透明であった。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:引張力が加わった後、徐々に膨張する頭蓋縫合糸。 矢状縫合糸のμCT画像(A)と1日および5日間の力負荷後(B、C)。スケールバー:100 μm。 Exp = 膨張。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図5:3D画像で縫合糸拡張後に活性化された骨形成。 (A-C) PEGASOS法でクリアした二重標識矢状縫合糸の3次元可視化。アリザリンレッドとカルセイングリーンは、それぞれ7日間拡大する前に一晩中腹腔内注射され(B、C)、同時時点で機械的負荷のない対照群(A)と比較して、安楽死しました。5倍レンズを用いて縫合画像全体を効率よく取得し(A,B)、(B)のボックス像は10倍レンズで撮像した(C,C',C''s)で拡大した。A,Bのスケールバー:100 μm、C:150 μm。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図6:3D画像での引張力負荷時に高度に増殖する縫合糸細胞。 PEGASOS組織透明化法と組み合わせたホールマウント取り込みアッセイでは、静粛性(A)または1日および7日間の強制負荷後(B、C)に縫合糸全体で増殖する細胞が示されました。10倍レンズで撮像。破線は、矢状縫合糸の2つのエッジの輪郭を描いています。スケールバー:100 μm。 Exp = 膨張。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

著者は何も開示していません。