このプロトコルは単一セルの分類方法を使用して人間のmesenchymal幹細胞の蛍光活動化させたセル分類の使用を記述する。具体的には、シングルセルソーティングの使用は、マルチパラメトリックフローサイトメトリーベースのアプローチと組み合わせることで、不均一な集団から免疫表現型細胞の99%の純度を達成することができます。
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方法論記事
ヒト剥離乳歯由来の免疫表現型間葉系幹細胞の単一細胞選別
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
生物の間葉系幹細胞(MSC)は、体内の成体細胞の複数の系統に分化する並外れた能力を持ち、免疫調節および抗炎症特性で知られています。これらの幹細胞の使用は、再生生物学の分野に恩恵をもたらしますが、同時に、それらに関連する複数の細胞の曖昧さのために、再生医療や治療薬にとって悩みの種でもあります。これらの曖昧さは、これらの幹細胞の供給源の多様性とin vitro での増殖条件から生じる可能性があり、どちらも機能的な不均一性を反映しています。
これにより、治療用途のために精製された均質なMSC集団を提供する方法論が保証されます。フローサイトメトリーの分野の進歩により、マルチパラメトリックアプローチを用いた単一細胞集団の検出が可能になりました。このプロトコルは蛍光助けられた単一セルの分類によって人間のexfoliated乳歯の(小屋)からの幹細胞を識別し、浄化する方法を概説する。表面マーカー、すなわちCD90-フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、CD73-ペリジニン-クロロフィルタンパク質(PerCP-Cy5.5)、CD105-アロフィコシアニン(APC)、およびCD44-V450の同時発現により、マルチパラメトリックフローサイトメトリーを用いてMSCの「明るい」陽性発現因子が同定されました。しかし、これらの陽性マーカーの四重発現者の割合は、継代7以降から後の継代にかけて有意な低下が観察された。
免疫表現型サブポピュレーションは、2つの陽性マーカーと1つの陰性マーカーのみが選択基準を構成する単一細胞ソートモードを使用してソートされました。この方法論により、選別した集団の細胞生存率が保証され、選別後の細胞増殖が維持されました。このようなソーティングの下流アプリケーションは、ゲーテッド亜集団の系統特異的な分化を評価するために使用できます。このアプローチは、他のシングルセルシステムに適用して、単離条件を改善し、複数の細胞表面マーカー情報を取得することができます。
概要
間葉系幹細胞(MSC)は、細胞ベースの治療に適したスケーラブルな細胞供給源と見なすことができ、再生医療のゴールドスタンダードシステムと見なすことができます。これらの細胞は、異なる組織起源を有する体内のさまざまな供給源から単離することができる1。MSCの各タイプは、その発生源組織に応じて、曖昧なin vitro挙動を示します2。これは、それらの形態学的および機能的特性によく見られます3。複数の研究により、成体組織の分化、ゲノム状態、MSCの代謝および細胞構造など、寸法のクローン内変動が示されています2,4。
細胞のイムノフェノタイピングは、幹細胞の同定のためのフローサイトメトリーの一般的なアプリケーションであり、これは2006年に国際細胞遺伝子治療学会(ISCT)によって利用され、細胞をMSCとして識別するための最小限の基準のリストを規定しました。それは、プラスチック接着とin vitroで3つの系統(骨形成性、軟骨形成性、脂肪形成性)に分化する能力に加えて、細胞集団の≥95%がCD105、CD73、CD90を発現しなければならず、これらの細胞はフローサイトメトリーで測定されたCD34、CD45、CD11b、CD14、およびHLA-DRの発現(≤2%陽性)を欠いている必要があると述べています5.MSCはISCTの最小限の基準の下で一連のバイオマーカーによって定義されましたが、それらの免疫特性はこれらのバイオマーカーでベンチマークすることができず、研究間の比較とクローン変異の定量化を容易にするために、これらの基準を超えるものが必要でした2。
ISCTによって設定されたガイドラインにもかかわらず、MSCに関する広範な研究により、MSCには不均一性が存在することが示されており、これは主にMSCドナー6、組織源7、クローン集団8内の個々の細胞、および培養条件2,9の間に生じる不均一性の遍在性のために、多くの要因によって発生する可能性があります。10.品質と細胞の運命を確保するための、さまざまな組織源からのこれらの初代細胞の特性評価と精製は、それらの生産における重要なステップです。母集団間の表示された変動を理解する必要性は、それを分割して個別に収集できる部分母集団に解決するための効率的な方法を必要とします11。単一細胞レベルの分析は、細胞間変異の課題を克服し、不均一な集団から生じる生物学的ノイズを低減し、希少細胞の調査と特性評価を行う能力を提供するのに役立ちます12。
目的と選択したパラメータに基づいて、いくつかの方法を使用して、選択した母集団を並べ替えて強化できます。細胞選別技術には、バルクソーティング法と単一細胞ソーティング法の両方があります。バルクソーティングは、磁気活性化セルソーティング(MACS)13、フラクショネーション14、および水簸15によってターゲット集団を濃縮できますが、シングルセルソーティングは、蛍光活性化セルソーティング(FACS)11によって、より均質な集団を濃縮できます。表1に、これらの各方法と独自の長所と短所の比較分析を示します。
表1:MACS、分画、水簸、FACSなどのさまざまな手法の比較分析では、その原理の違いと、特定の手法を他の手法よりも選択することの長所と短所を強調しています。 略語:MACS = Magnetic-activated cell sorting;FACS = 蛍光活性化セルソーティング。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
この技術の出現以来、単一細胞フローサイトメトリーは、不均一なサンプル中の特定の細胞集団の列挙16、検出、および特性評価において主要な役割を果たしてきました17。2006年、Hewittらは、分化したヒト胚性幹細胞(hESC)の均質なプールの単離を強化するための自動細胞選別法の基礎を築いた18。シングルセルソーティングにより、GFP形質導入ヒトES細胞の集団が濃縮され、遺伝子改変クローンの単離が容易になり、臨床研究に新たな局面が開かれました。ソート効率を向上させるために、一般的に2つのアプローチが取られてきました。選別された集団の収集培地は、選別後の細胞の生存率および増殖を維持するように改変されるか19 、または細胞選別アルゴリズム/ソフトウェアが適切に改変される12。
技術の進歩により、市販のフローサイトメーターやセルソーターは、脆弱で希少な細胞集団、特に異なる起源の幹細胞を無菌的に選別する際に解決された課題に対処するのに役立っています。幹細胞生物学者の主な課題の1つは、遺伝子編集研究に必要なトランスフェクションプロトコルに従ったヒト多能性幹細胞のクローン分離でした19。これに対処するには、単一細胞を96ウェルプレートに分類し、マウス胚性線維芽細胞(MEF)とサプリメントおよび市販の低分子ROCK阻害剤でコーティングしました。しかし、細胞単離戦略は、ソーティングされた個々の細胞の免疫表現型を同定するソーティングアルゴリズムの特徴であるインデックスソーティングを使用することで大幅に改良することができる12。シングルセルソーティングにおけるこの洗練されたモダリティは、特に希少な造血幹細胞集団に関して、幹細胞のソーティング効率を高めるのに役立っただけでなく、シングルセルクローンを下流の機能アッセイに効率的にリンクさせることにも役立ちました20。
この論文は、ヒト剥離乳歯(SHED)から採取した免疫表現型幹細胞の単一細胞選別に焦点を当て、サブポピュレーションを濃縮して機能分化能力を研究します。2つのMSC陽性マーカー、CD90およびCD73、および陰性造血マーカーCD45の組み合わせを使用して、MSCを免疫表現型決定し、dimおよびnull発現因子を同定した。免疫表現型に基づいて、亜集団は純粋なMSC、単一陽性および二重陰性の集団として識別されました。これらは、シングルセルソーティングモードを使用してソーティングし、マーカーの発現差が in vitro 培養条件のアーティファクトであるかどうか、または機能特性にも影響を与えるかどうかを特定するためのさらなる機能研究のために、純粋で濃縮された亜集団を取得しました。「陽性MSCマーカー」の均一な発現因子ではない細胞を選別し、その機能的特性を調べました。
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プロトコル
倫理的承認と参加への同意: ヒト剥離乳歯髄サンプルは、インフォームド コンセントと完全な倫理的承認を取得した後、バンガロールの Sri Rajiv Gandhi Dental College and Hospital (SRGCDS) 口腔顎顔面部門によって、病院倫理クリアランス委員会、SRGCDS によって確立された基準に従って受け取られました。その後、SHEDの分離、培養、維持、および適用が、MAHE-バンガロールのManipal Institute of Regenerative MedicineのInstitutional Committee for Stem Cell Research(IC-SCR)によって推奨されたガイドラインによって承認され、これに準拠しました。このプロトコルで使用されるすべての材料および試薬の詳細については、 材料表 を参照してください。
1. 試薬・緩衝液の調製
- 培養維持に
- 未分化ヒトES細胞の基礎培地、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%L-グルタミン、および1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Pen-strep)を使用してMSC細胞培養培地(10%)を調製します(表2)。
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結果
SHEDは、ビメンチン(赤色、III型中間フィラメント)、アクチンフィラメント(Alexa fluor 488 Phalloidin Probes)、およびDAPIで染色した核の発現を示す標準的な免疫蛍光アッセイで特性評価しました(図1A)。それらの増殖能力およびコロニー形成能力を推定するために、標準的な短期細胞増殖アッセイを実施しました。2日目から8日目にかけて増殖率が14.3倍に増加したことが図1Bに示されています。SHEDのクローン形成特性は、図1C-Eに示すCFU-Fアッセイから決定しました。ISCT基準に従って、多能性MSCは3つの中胚葉由来の系統に分化することができました。分化した脂肪細胞の油滴を検出するために、Oil Red Oによる細胞化学的染色を使用しました(図1F)。分化した骨芽細胞のマトリックスに見られるカルシウ...
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ディスカッション
組織工学および再生医療の分野では、出生後の情報源の中で、口腔組織由来のMSCは、その最小限の倫理的義務と顕著な多系統分化の可能性のために、深い関心を集めています21。影響を受けた第3大臼歯由来の歯髄幹細胞(DPSC)とSHEDは、神経変性疾患および外傷性疾患における治療の可能性について、歯科間幹細胞の中で最も注目を集めています22。この原稿で説明するプロトコルは、マルチパラメトリックアプローチを使用してSHEDを特徴付け、シングルセルソートアプローチを使用して目的の集団をさらにソートするのに役立ちます。しかしながら、このプロトコルの適用は、経口MSCに限定されるだけでなく、人体における他の源組織からのMSCのイムノフェノタイピングおよび選別にも用いることができる23。
このプロトコルのいくつかの重要なステップは、対処された生物学的問題の実装を成功させるために、ここで議論する必要があります。すべての選別プロトコルの鍵は、生物学的コントロールと...
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開示事項
著者らは、この論文の出版に関して利益相反がないことを宣言します。
謝辞
インドのバンガロールにあるジャワハルラール・ネルー先端科学研究センターのフローセル施設には、フローサイトメトリーのコア施設をご利用いただき、感謝いたします。分化細胞のペレット培養の凍結切片は、インドのバンガロールにあるNeuberg Anand Reference Laboratoryで実施されました。この研究は、インドのマニパル高等教育アカデミー(MAHE)からのUCの学内資金によって支援されました。AGは、MAHEからのDr. T. M. A. Pai Scholarshipの支援に感謝しています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| アルシアンブルーステイン | HiMedia | CCK029-1KT | |
| 抗生物質-抗真菌剤(100x) | 15240062 | の Gibco | |
| BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig、 κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 & micro;m) パーティクルセット | BD Biosciences | 560497 | |
| BD FACS Accudrop Beads | BD Biosciences 345249 | ソートモジュールが開いたときのレーザー遅延を設定するために使用されます。 | |
| BD FACS Aria Fusion Flow cytometer | BD Biosciences | --- | |
| BD FACS Diva 9.4 | BD Biosciences | --- | |
| BD FACS シース液 | BD Biosciences | 342003 | BD FACSAria Fusion |
| BD FACSDiva CS&T研究ビーズ | BD Biosciences | 655050 | ノズルサイズに応じて機器構成に使用されます。 |
| BD Horizon V450 マウス 反ヒト CD44 | BD Biosciences | 561292 | |
| BD Horizon V450 マウス IgG2b, κアイソタイプコントロール | BD Biosciences | 560374 | CD44-V450 アイソタイプ |
| BD Pharmingen APC マウス 抗ヒト CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
| BD Pharmingen APC マウス IgG1, κアイソタイプコントロール | BD Biosciences | 555751 | CD105-APC アイソタイプ |
| BD Pharmingen DAPIソリューション | BD Biosciences | 564907 | DAPI1 mg/mLのストック溶液 |
| BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
| BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κアイソタイプコントロール | BD Biosciences | 555748 | CD90-FITC アイソタイプ |
| BD Pharmingen PE マウス 抗ヒト CD45 | BD Biosciences | 555483 | |
| BD Pharmingen PE マウス IgG1, κアイソタイプコントロール | BD Biosciences | 555749 | CD45-PE アイソタイプ |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 マウス 抗ヒト CD73 | BD Biosciences | 561260 | |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 マウス IgG1, κアイソタイプコントロール | BD Biosciences | 550795 | CD73-PerCP-Cy 5.5 アイソタイプ |
| BD Pharmingen 精製マウス 抗ビメンチン | BD Biosciences | 550513 | |
| ウシ血清アルブミン | Hi-Media | TC548-5G | |
| クリスタルバイオレット | ニースケミカル社 | C33809 | |
| ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 | Sigma-aldrich | D5652-50L | dPBSを培養作業やメンテナンスに使用。 |
| エタノール | --- | --- | 一般的な滅菌に使用されます。 |
| ウシ胎児血清 | ThermoFisherのGibco | 10270-106 | |
| ヤギ抗マウスIgG(H+L)交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21422 | |
| KO-DMEM | Gibco by ThermoFisher | 10829018 | 分子 |
| -グルタミン 200mM (100x) | Gibco | ||
| ハイメディア | MB113 | ||
| オイルレッド O | ハイメディア | CCK013-1KT | |
| パラホルムアルデヒド | loba chemie | 30525-89-4 | |
| ペニシリン ストレプトマイシン (100x) | Gibco by ThermoFisher | 15140- 122 | |
| ファロイジン (ActinGreen 488 ReadyProbes 試薬) | Invitrogen | R37110 | |
| 硝酸銀 | HiMedia | MB156-25G | |
| ナトリウムチオ硫酸塩五水和物 | Chemport | 10102-17-7 | |
| スフェロレインボー蛍光粒子、3.0 - 3.4 µm | BD Biosciences | 556291 | |
| 染色バッファー | MIRMで作成 | ---- | PBS中の2%FBSを使用して調製しました |
| StemPro脂肪生成分化基礎培地 | ThermoFisherのGibco | A10410-01 | StemPro |
| Adipogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10065-01 | Amopogenic培 |
| StemPro軟骨形成サプリメント | ThermoFisher | A10064-01 | 軟骨形成培地用誘導培地 |
| StemPro Osteogenesis Supplement | Gibco by ThermoFisher | A10066-01 | 骨形成培地用誘導培地 |
| StemPro 骨形成/軟骨形成分化基礎培地 | ThermoFisherのGibco | A10069-01 | 骨原性および軟骨原性培地の両方の基礎培地 |
| Triton-X-100 | Hi-Media | MB031 | |
| トリパンブルー | ライフテクノロジーズによるGibco | 15250-061 | |
| トリプシン - EDTA溶液 1x | Hi-media | TCL049 | |
| トゥイーン-20 | メルク | 〒9005-64-5 |
参考文献
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