ヒト剥離乳歯由来の免疫表現型間葉系幹細胞の単一細胞選別

Summary

このプロトコルは単一セルの分類方法を使用して人間のmesenchymal幹細胞の蛍光活動化させたセル分類の使用を記述する。具体的には、シングルセルソーティングの使用は、マルチパラメトリックフローサイトメトリーベースのアプローチと組み合わせることで、不均一な集団から免疫表現型細胞の99%の純度を達成することができます。

Abstract

生物の間葉系幹細胞(MSC)は、体内の成体細胞の複数の系統に分化する並外れた能力を持ち、免疫調節および抗炎症特性で知られています。これらの幹細胞の使用は、再生生物学の分野に恩恵をもたらしますが、同時に、それらに関連する複数の細胞の曖昧さのために、再生医療や治療薬にとって悩みの種でもあります。これらの曖昧さは、これらの幹細胞の供給源の多様性とin vitro での増殖条件から生じる可能性があり、どちらも機能的な不均一性を反映しています。

これにより、治療用途のために精製された均質なMSC集団を提供する方法論が保証されます。フローサイトメトリーの分野の進歩により、マルチパラメトリックアプローチを用いた単一細胞集団の検出が可能になりました。このプロトコルは蛍光助けられた単一セルの分類によって人間のexfoliated乳歯の(小屋)からの幹細胞を識別し、浄化する方法を概説する。表面マーカー、すなわちCD90-フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、CD73-ペリジニン-クロロフィルタンパク質(PerCP-Cy5.5)、CD105-アロフィコシアニン(APC)、およびCD44-V450の同時発現により、マルチパラメトリックフローサイトメトリーを用いてMSCの「明るい」陽性発現因子が同定されました。しかし、これらの陽性マーカーの四重発現者の割合は、継代7以降から後の継代にかけて有意な低下が観察された。

免疫表現型サブポピュレーションは、2つの陽性マーカーと1つの陰性マーカーのみが選択基準を構成する単一細胞ソートモードを使用してソートされました。この方法論により、選別した集団の細胞生存率が保証され、選別後の細胞増殖が維持されました。このようなソーティングの下流アプリケーションは、ゲーテッド亜集団の系統特異的な分化を評価するために使用できます。このアプローチは、他のシングルセルシステムに適用して、単離条件を改善し、複数の細胞表面マーカー情報を取得することができます。

Introduction

間葉系幹細胞(MSC)は、細胞ベースの治療に適したスケーラブルな細胞供給源と見なすことができ、再生医療のゴールドスタンダードシステムと見なすことができます。これらの細胞は、異なる組織起源を有する体内のさまざまな供給源から単離^{することができる1。}MSCの各タイプは、その発生源組織に応じて、曖昧なin vitro^挙動を示します2。これは、それらの形態^{学的および機能}的特性によく見られます3。複数の研究により、成体組織の分化、ゲノム状態、MSCの代謝および細胞構造など、寸法のクローン内変動が示されています^2,4。

細胞のイムノフェノタイピングは、幹細胞の同定のためのフローサイトメトリーの一般的なアプリケーションであり、これは2006年に国際細胞遺伝子治療学会(ISCT)によって利用され、細胞をMSCとして識別するための最小限の基準のリストを規定しました。それは、プラスチック接着とin vitroで3つの系統(骨形成性、軟骨形成性、脂肪形成性)に分化する能力に加えて、細胞集団の≥95%がCD105、CD73、CD90を発現しなければならず、これらの細胞はフローサイトメトリーで測定されたCD34....

Protocol

倫理的承認と参加への同意: ヒト剥離乳歯髄サンプルは、インフォームド コンセントと完全な倫理的承認を取得した後、バンガロールの Sri Rajiv Gandhi Dental College and Hospital (SRGCDS) 口腔顎顔面部門によって、病院倫理クリアランス委員会、SRGCDS によって確立された基準に従って受け取られました。その後、SHEDの分離、培養、維持、および適用が、MAHE-バンガロールのManipal Institute of Regenerative MedicineのInstitutional Committee for Stem Cell Research(IC-SCR)によって推奨されたガイドラインによって承認され、これに準拠しました。このプロトコルで使用されるすべての材料および試薬の詳細については、 材料表 を参照してください。

1. 試薬・緩衝液の調製

1. 培養維持に
   1. 未分化ヒトES細胞の基礎培地、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%L-グルタミン、および1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Pen-strep)を使用してMSC細胞培養培地(10%)を調製します(表2)。

Results

SHEDは、ビメンチン(赤色、III型中間フィラメント)、アクチンフィラメント(Alexa fluor 488 Phalloidin Probes)、およびDAPIで染色した核の発現を示す標準的な免疫蛍光アッセイで特性評価しました(図1A)。それらの増殖能力およびコロニー形成能力を推定するために、標準的な短期細胞増殖アッセイを実施しました。2日目から8日目にかけて増殖率が14.3倍に増加したことが図1Bに示されています。SHEDのクローン形成特性は、図1C-Eに示すCFU-Fアッセイから決定しました。ISCT基準に従って、多能性MSCは3つの中胚葉由来の系統に分化することができました。分化した脂肪細胞の油滴を検出するために、Oil Red Oによる細胞化学的染色を使用しました(図1F)。分化した骨芽細胞のマトリックスに見られるカルシウ.......

Discussion

組織工学および再生医療の分野では、出生後の情報源の中で、口腔組織由来のMSCは、その最小限の倫理的義務と顕著な多系統分化の可能性のために、深い関心を集めています²¹。影響を受けた第3大臼歯由来の歯髄幹細胞(DPSC)とSHEDは、神経変性疾患および外傷性疾患における治療の可能性について、歯科間幹細胞の中で最も注目を集めています²²。この原稿で説明するプロトコルは、マルチパラメトリックアプローチを使用してSHEDを特徴付け、シングルセルソートアプローチを使用して目的の集団をさらにソートするのに役立ちます。しかしながら、このプロトコルの適用は、経口MSCに限定されるだけでなく、人体における他の源組織からのMSCのイムノフェノタイピングおよび選別にも用いることができる²³。

このプロトコルのいくつかの重要なステップは、対処された生物学的問題の実装を成功させるために、ここで議論する必要があります。すべての選別プロトコルの鍵は、生物学的コントロールと.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
アルシアンブルーステイン	HiMedia	CCK029-1KT
抗生物質-抗真菌剤(100x)	15240062		の Gibco
BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig、 κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 & micro;m) パーティクルセット	BD Biosciences	560497
BD FACS Accudrop Beads	BD Biosciences 345249		ソートモジュールが開いたときのレーザー遅延を設定するために使用されます。
BD FACS Aria Fusion Flow cytometer	BD Biosciences	---
BD FACS Diva 9.4	BD Biosciences	---
BD FACS シース液	BD Biosciences	342003	BD FACSAria Fusion
BD FACSDiva CS&T研究ビーズ	BD Biosciences	655050	ノズルサイズに応じて機器構成に使用されます。
BD Horizon V450 マウス 反ヒト CD44	BD Biosciences	561292
BD Horizon V450 マウス IgG2b, κアイソタイプコントロール	BD Biosciences	560374	CD44-V450 アイソタイプ
BD Pharmingen APC マウス 抗ヒト CD105	BD Biosciences	562408
BD Pharmingen APC マウス IgG1, κアイソタイプコントロール	BD Biosciences	555751	CD105-APC アイソタイプ
BD Pharmingen DAPIソリューション	BD Biosciences	564907	DAPI1 mg/mLのストック溶液
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90	BD Biosciences	555595
BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κアイソタイプコントロール	BD Biosciences	555748	CD90-FITC アイソタイプ
BD Pharmingen PE マウス 抗ヒト CD45	BD Biosciences	555483
BD Pharmingen PE マウス IgG1, κアイソタイプコントロール	BD Biosciences	555749	CD45-PE アイソタイプ
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 マウス 抗ヒト CD73	BD Biosciences	561260
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 マウス IgG1, κアイソタイプコントロール	BD Biosciences	550795	CD73-PerCP-Cy 5.5 アイソタイプ
BD Pharmingen 精製マウス 抗ビメンチン	BD Biosciences	550513
ウシ血清アルブミン	Hi-Media	TC548-5G
クリスタルバイオレット	ニースケミカル社	C33809
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水	Sigma-aldrich	D5652-50L	dPBSを培養作業やメンテナンスに使用。
エタノール	---	---	一般的な滅菌に使用されます。
ウシ胎児血清	ThermoFisherのGibco	10270-106
ヤギ抗マウスIgG(H+L)交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A-21422
KO-DMEM	Gibco by ThermoFisher	10829018	分子
-グルタミン 200mM (100x)	Gibco
	ハイメディア	MB113
オイルレッド O	ハイメディア	CCK013-1KT
パラホルムアルデヒド	loba chemie	30525-89-4
ペニシリン ストレプトマイシン (100x)	Gibco by ThermoFisher	15140- 122
ファロイジン (ActinGreen 488 ReadyProbes 試薬)	Invitrogen	R37110
硝酸銀	HiMedia	MB156-25G
ナトリウムチオ硫酸塩五水和物	Chemport	10102-17-7
スフェロレインボー蛍光粒子、3.0 - 3.4 µm	BD Biosciences	556291
染色バッファー	MIRMで作成	----	PBS中の2%FBSを使用して調製しました
StemPro脂肪生成分化基礎培地	ThermoFisherのGibco	A10410-01	StemPro
Adipogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10065-01	Amopogenic培
StemPro軟骨形成サプリメント	ThermoFisher	A10064-01	軟骨形成培地用誘導培地
StemPro Osteogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10066-01	骨形成培地用誘導培地
StemPro 骨形成/軟骨形成分化基礎培地	ThermoFisherのGibco	A10069-01	骨原性および軟骨原性培地の両方の基礎培地
Triton-X-100	Hi-Media	MB031
トリパンブルー	ライフテクノロジーズによるGibco	15250-061
トリプシン - EDTA溶液 1x	Hi-media	TCL049
トゥイーン-20	メルク	〒9005-64-5