ヒト剥離乳歯由来の免疫表現型間葉系幹細胞の単一細胞選別

Summary

このプロトコルは単一セルの分類方法を使用して人間のmesenchymal幹細胞の蛍光活動化させたセル分類の使用を記述する。具体的には、シングルセルソーティングの使用は、マルチパラメトリックフローサイトメトリーベースのアプローチと組み合わせることで、不均一な集団から免疫表現型細胞の99%の純度を達成することができます。

Abstract

生物の間葉系幹細胞(MSC)は、体内の成体細胞の複数の系統に分化する並外れた能力を持ち、免疫調節および抗炎症特性で知られています。これらの幹細胞の使用は、再生生物学の分野に恩恵をもたらしますが、同時に、それらに関連する複数の細胞の曖昧さのために、再生医療や治療薬にとって悩みの種でもあります。これらの曖昧さは、これらの幹細胞の供給源の多様性とin vitro での増殖条件から生じる可能性があり、どちらも機能的な不均一性を反映しています。

これにより、治療用途のために精製された均質なMSC集団を提供する方法論が保証されます。フローサイトメトリーの分野の進歩により、マルチパラメトリックアプローチを用いた単一細胞集団の検出が可能になりました。このプロトコルは蛍光助けられた単一セルの分類によって人間のexfoliated乳歯の(小屋)からの幹細胞を識別し、浄化する方法を概説する。表面マーカー、すなわちCD90-フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、CD73-ペリジニン-クロロフィルタンパク質(PerCP-Cy5.5)、CD105-アロフィコシアニン(APC)、およびCD44-V450の同時発現により、マルチパラメトリックフローサイトメトリーを用いてMSCの「明るい」陽性発現因子が同定されました。しかし、これらの陽性マーカーの四重発現者の割合は、継代7以降から後の継代にかけて有意な低下が観察された。

免疫表現型サブポピュレーションは、2つの陽性マーカーと1つの陰性マーカーのみが選択基準を構成する単一細胞ソートモードを使用してソートされました。この方法論により、選別した集団の細胞生存率が保証され、選別後の細胞増殖が維持されました。このようなソーティングの下流アプリケーションは、ゲーテッド亜集団の系統特異的な分化を評価するために使用できます。このアプローチは、他のシングルセルシステムに適用して、単離条件を改善し、複数の細胞表面マーカー情報を取得することができます。

Introduction

間葉系幹細胞(MSC)は、細胞ベースの治療に適したスケーラブルな細胞供給源と見なすことができ、再生医療のゴールドスタンダードシステムと見なすことができます。これらの細胞は、異なる組織起源を有する体内のさまざまな供給源から単離^{することができる1。}MSCの各タイプは、その発生源組織に応じて、曖昧なin vitro^挙動を示します2。これは、それらの形態^{学的および機能}的特性によく見られます3。複数の研究により、成体組織の分化、ゲノム状態、MSCの代謝および細胞構造など、寸法のクローン内変動が示されています^2,4。

細胞のイムノフェノタイピングは、幹細胞の同定のためのフローサイトメトリーの一般的なアプリケーションであり、これは2006年に国際細胞遺伝子治療学会(ISCT)によって利用され、細胞をMSCとして識別するための最小限の基準のリストを規定しました。それは、プラスチック接着とin vitroで3つの系統(骨形成性、軟骨形成性、脂肪形成性)に分化する能力に加えて、細胞集団の≥95%がCD105、CD73、CD90を発現しなければならず、これらの細胞はフローサイトメトリーで測定されたCD34、CD45、CD11b、CD14、およびHLA-DRの発現(≤2%陽性)を欠いている必要があると述べています⁵.MSCはISCTの最小限の基準の下で一連のバイオマーカーによって定義されましたが、それらの免疫特性はこれらのバイオマーカーでベンチマークすることができず、研究間の比較とクローン変異の定^{量化を容易にする}ために、これらの基準を超えるものが必要でした2。

ISCTによって設定されたガイドラインにもかかわらず、MSCに関する広範な研究により、MSCには不均一性が存在することが示されており、これは主にMSCド^ナー6、組織源⁷、クローン集団⁸内の個々の細胞、および培養条件^2,9の間に生じる不均一性の遍在性のために、多くの要因によって発生する可能性があります^。10.品質と細胞の運命を確保するための、さまざまな組織源からのこれらの初代細胞の特性評価と精製は、それらの生産における重要なステップです。母集団間の表示された変動を理解する必要性は、それを分割して個別に収集できる部分母集団に解決するための効率的な方法を必要とします¹¹。単一細胞レベルの分析は、細胞間変異の課題を克服し、不均一な集団から生じる生物学的ノイズを低減し、希少細胞の調査と特性評価を行う能力を提供するのに役立ちます¹²。

目的と選択したパラメータに基づいて、いくつかの方法を使用して、選択した母集団を並べ替えて強化できます。細胞選別技術には、バルクソーティング法と単一細胞ソーティング法の両方があります。バルクソーティングは、磁気活性化セルソーティング(MACS)¹³、フラクショネーション¹⁴、および水簸¹⁵によってターゲット集団を濃縮できますが、シングルセルソーティングは、蛍光活性化セルソーティング(FACS)¹¹によって、より均質な集団を濃縮できます。表1に、これらの各方法と独自の長所と短所の比較分析を示します。

表1:MACS、分画、水簸、FACSなどのさまざまな手法の比較分析では、その原理の違いと、特定の手法を他の手法よりも選択することの長所と短所を強調しています。 略語:MACS = Magnetic-activated cell sorting;FACS = 蛍光活性化セルソーティング。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

この技術の出現以来、単一細胞フローサイトメトリーは、不均一なサンプル中の特定の細胞集団の列挙¹⁶、検出、および特性評価において主要な役割を果たしてきました¹⁷。2006年、Hewittらは、分化したヒト胚性幹細胞(hESC)の均質なプールの単離を強化するための自動細胞選別法の基礎を築いた¹⁸。シングルセルソーティングにより、GFP形質導入ヒトES細胞の集団が濃縮され、遺伝子改変クローンの単離が容易になり、臨床研究に新たな局面が開かれました。ソート効率を向上させるために、一般的に2つのアプローチが取られてきました。選別された集団の収集培地は、選別後の細胞の生存率および増殖を維持するように改変されるか¹⁹ 、または細胞選別アルゴリズム/ソフトウェアが適切に改変される¹²。

技術の進歩により、市販のフローサイトメーターやセルソーターは、脆弱で希少な細胞集団、特に異なる起源の幹細胞を無菌的に選別する際に解決された課題に対処するのに役立っています。幹細胞生物学者の主な課題の1つは、遺伝子編集研究に必要なトランスフェクションプロトコルに従ったヒト多能性幹細胞のクローン分離でした¹⁹。これに対処するには、単一細胞を96ウェルプレートに分類し、マウス胚性線維芽細胞(MEF)とサプリメントおよび市販の低分子ROCK阻害剤でコーティングしました。しかし、細胞単離戦略は、ソーティングされた個々の細胞の免疫表現型を同定するソーティングアルゴリズムの特徴であるインデックスソーティングを使用することで大幅に改良することができる¹²。シングルセルソーティングにおけるこの洗練されたモダリティは、特に希少な造血幹細胞集団に関して、幹細胞のソーティング効率を高めるのに役立っただけでなく、シングルセルクローンを下流の機能アッセイに効率的にリンクさせることにも役立ちました²⁰。

この論文は、ヒト剥離乳歯(SHED)から採取した免疫表現型幹細胞の単一細胞選別に焦点を当て、サブポピュレーションを濃縮して機能分化能力を研究します。2つのMSC陽性マーカー、CD90およびCD73、および陰性造血マーカーCD45の組み合わせを使用して、MSCを免疫表現型決定し、dimおよびnull発現因子を同定した。免疫表現型に基づいて、亜集団は純粋なMSC、単一陽性および二重陰性の集団として識別されました。これらは、シングルセルソーティングモードを使用してソーティングし、マーカーの発現差が in vitro 培養条件のアーティファクトであるかどうか、または機能特性にも影響を与えるかどうかを特定するためのさらなる機能研究のために、純粋で濃縮された亜集団を取得しました。「陽性MSCマーカー」の均一な発現因子ではない細胞を選別し、その機能的特性を調べました。

Protocol

倫理的承認と参加への同意: ヒト剥離乳歯髄サンプルは、インフォームド コンセントと完全な倫理的承認を取得した後、バンガロールの Sri Rajiv Gandhi Dental College and Hospital (SRGCDS) 口腔顎顔面部門によって、病院倫理クリアランス委員会、SRGCDS によって確立された基準に従って受け取られました。その後、SHEDの分離、培養、維持、および適用が、MAHE-バンガロールのManipal Institute of Regenerative MedicineのInstitutional Committee for Stem Cell Research(IC-SCR)によって推奨されたガイドラインによって承認され、これに準拠しました。このプロトコルで使用されるすべての材料および試薬の詳細については、 材料表 を参照してください。

1. 試薬・緩衝液の調製

1. 培養維持に
   1. 未分化ヒトES細胞の基礎培地、10%ウシ胎児血清(FBS)、1%L-グルタミン、および1%ペニシリン-ストレプトマイシン(Pen-strep)を使用してMSC細胞培養培地(10%)を調製します(表2)。

6. 
   

1. 6. 
      
2. 4. 
      

5. 6. 
      

1. 1. 
      
2. 6. 
      
5. 4. 
      

Results

SHEDは、ビメンチン(赤色、III型中間フィラメント)、アクチンフィラメント(Alexa fluor 488 Phalloidin Probes)、およびDAPIで染色した核の発現を示す標準的な免疫蛍光アッセイで特性評価しました(図1A)。それらの増殖能力およびコロニー形成能力を推定するために、標準的な短期細胞増殖アッセイを実施しました。2日目から8日目にかけて増殖率が14.3倍に増加したことが図1Bに示されています。SHEDのクローン形成特性は、図1C-Eに示すCFU-Fアッセイから決定しました。ISCT基準に従って、多能性MSCは3つの中胚葉由来の系統に分化することができました。分化した脂肪細胞の油滴を検出するために、Oil Red Oによる細胞化学的染色を使用しました(図1F)。分化した骨芽細胞のマトリックスに見られるカルシウ...

Discussion

組織工学および再生医療の分野では、出生後の情報源の中で、口腔組織由来のMSCは、その最小限の倫理的義務と顕著な多系統分化の可能性のために、深い関心を集めています²¹。影響を受けた第3大臼歯由来の歯髄幹細胞(DPSC)とSHEDは、神経変性疾患および外傷性疾患における治療の可能性について、歯科間幹細胞の中で最も注目を集めています²²。この原稿で説明するプロトコルは、マルチパラメトリックアプローチを使用してSHEDを特徴付け、シングルセルソートアプローチを使用して目的の集団をさらにソートするのに役立ちます。しかしながら、このプロトコルの適用は、経口MSCに限定されるだけでなく、人体における他の源組織からのMSCのイムノフェノタイピングおよび選別にも用いることができる²³。

このプロトコルのいくつかの重要なステップは、対処された生物学的問題の実装を成功させるために、ここで議論する必要があります。すべての選別プロトコルの鍵は、生物学的コントロールと...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
アルシアンブルーステイン	HiMedia	CCK029-1KT
抗生物質-抗真菌剤(100x)	15240062		の Gibco
BD CompBead Plus Anti-Mouse Ig、 κ/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 & micro;m) パーティクルセット	BD Biosciences	560497
BD FACS Accudrop Beads	BD Biosciences 345249		ソートモジュールが開いたときのレーザー遅延を設定するために使用されます。
BD FACS Aria Fusion Flow cytometer	BD Biosciences	---
BD FACS Diva 9.4	BD Biosciences	---
BD FACS シース液	BD Biosciences	342003	BD FACSAria Fusion
BD FACSDiva CS&T研究ビーズ	BD Biosciences	655050	ノズルサイズに応じて機器構成に使用されます。
BD Horizon V450 マウス 反ヒト CD44	BD Biosciences	561292
BD Horizon V450 マウス IgG2b, κアイソタイプコントロール	BD Biosciences	560374	CD44-V450 アイソタイプ
BD Pharmingen APC マウス 抗ヒト CD105	BD Biosciences	562408
BD Pharmingen APC マウス IgG1, κアイソタイプコントロール	BD Biosciences	555751	CD105-APC アイソタイプ
BD Pharmingen DAPIソリューション	BD Biosciences	564907	DAPI1 mg/mLのストック溶液
BD Pharmingen FITC Mouse Anti-Human CD90	BD Biosciences	555595
BD Pharmingen FITC Mouse IgG1, κアイソタイプコントロール	BD Biosciences	555748	CD90-FITC アイソタイプ
BD Pharmingen PE マウス 抗ヒト CD45	BD Biosciences	555483
BD Pharmingen PE マウス IgG1, κアイソタイプコントロール	BD Biosciences	555749	CD45-PE アイソタイプ
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 マウス 抗ヒト CD73	BD Biosciences	561260
BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 マウス IgG1, κアイソタイプコントロール	BD Biosciences	550795	CD73-PerCP-Cy 5.5 アイソタイプ
BD Pharmingen 精製マウス 抗ビメンチン	BD Biosciences	550513
ウシ血清アルブミン	Hi-Media	TC548-5G
クリスタルバイオレット	ニースケミカル社	C33809
ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水	Sigma-aldrich	D5652-50L	dPBSを培養作業やメンテナンスに使用。
エタノール	---	---	一般的な滅菌に使用されます。
ウシ胎児血清	ThermoFisherのGibco	10270-106
ヤギ抗マウスIgG(H+L)交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A-21422
KO-DMEM	Gibco by ThermoFisher	10829018	分子
-グルタミン 200mM (100x)	Gibco
	ハイメディア	MB113
オイルレッド O	ハイメディア	CCK013-1KT
パラホルムアルデヒド	loba chemie	30525-89-4
ペニシリン ストレプトマイシン (100x)	Gibco by ThermoFisher	15140- 122
ファロイジン (ActinGreen 488 ReadyProbes 試薬)	Invitrogen	R37110
硝酸銀	HiMedia	MB156-25G
ナトリウムチオ硫酸塩五水和物	Chemport	10102-17-7
スフェロレインボー蛍光粒子、3.0 - 3.4 µm	BD Biosciences	556291
染色バッファー	MIRMで作成	----	PBS中の2%FBSを使用して調製しました
StemPro脂肪生成分化基礎培地	ThermoFisherのGibco	A10410-01	StemPro
Adipogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10065-01	Amopogenic培
StemPro軟骨形成サプリメント	ThermoFisher	A10064-01	軟骨形成培地用誘導培地
StemPro Osteogenesis Supplement	Gibco by ThermoFisher	A10066-01	骨形成培地用誘導培地
StemPro 骨形成/軟骨形成分化基礎培地	ThermoFisherのGibco	A10069-01	骨原性および軟骨原性培地の両方の基礎培地
Triton-X-100	Hi-Media	MB031
トリパンブルー	ライフテクノロジーズによるGibco	15250-061
トリプシン - EDTA溶液 1x	Hi-media	TCL049
トゥイーン-20	メルク	〒9005-64-5