ヒト末梢血単核細胞の凍結保存と生体エネルギー評価

サマリー

単離された末梢血単核細胞は、免疫機能や免疫障害、代謝性疾患、またはミトコンドリア機能の解析に使用できます。この研究では、全血からのPBMCの調製とその後の凍結保存のための標準化された方法について説明します。凍結保存は、この時間と場所を独立させます。

要約

真核細胞の生理機能は、主にミトコンドリアが提供するエネルギーに依存しています。ミトコンドリアの機能不全は、代謝性疾患や老化に関連しています。酸化的リン酸化は、エネルギー的な恒常性の維持に不可欠であるため、決定的な役割を果たします。PBMCは、ミトコンドリア機能を測定するための低侵襲サンプルとして同定されており、疾患状態を反映することが示されています。しかし、ミトコンドリアの生体エネルギー機能の測定は、ヒトサンプル中のいくつかの要因によって制限される可能性があります。制限は、採取するサンプルの量、サンプリング時間 (多くの場合、数日間に分散)、および場所です。採取したサンプルを凍結保存することで、サンプルの一貫した収集と測定が可能になります。測定されたパラメータが、凍結保存された細胞と新たに調製された細胞の間で同等であることを確認するように注意する必要があります。ここでは、ヒト血液サンプルからPBMCを単離・凍結保存し、これらの細胞におけるミトコンドリアの生体エネルギー機能を解析する方法について述べる。ここに記載されているプロトコールに従って凍結保存されたPBMCは、新たに採取した細胞と比較して、細胞数と生存率、アデノシン三リン酸レベル、および測定された呼吸鎖活性にわずかな違いしか示しません。記載された調製物に必要なヒト血液はわずか8〜24mLであり、臨床試験中にサンプルを多中心的に収集し、その場で生体エネルギーを決定することを可能にします。

概要

ヒト末梢血単核球(PBMC)は、老化プロセスや変性疾患に関連する問題など、免疫学的および生体エネルギー学的問題の研究を含む、多くの科学分野でさまざまな用途に使用されています^1,2。PBMCは組成が不均一で、リンパ球(B細胞、T細胞、NK細胞)、単球、樹状細胞で構成されています。細胞は被験者内で大きな個体差やばらつきを示すことがあるため、これらの細胞を処理するための標準化された手順が必要です。単離の生存率や純度などの重要なパラメータは、その取り扱いの基本的な要件であり、収集時間、メラトニンレベル、被験者が絶食しているかどうかなどの環境要因によってさらに影響を受けます^3,4。

ここでは、PBMCの生体エネルギーに関する研究に基づいて、他の方法にも適したPBMCの単離、凍結保存、培養方法について説明します。筋生検はミトコンドリアのエネルギー代謝のゴールドスタンダードと考えられています^が5、血球の検査は迅速で低侵襲な手順です。これに加えて、老化やアルツハイマー病(AD)におけるミトコンドリア機能の変化は、脳だけでなく末梢にも起こることを示唆する研究がますます増えています^6,7,8,9,10。この方法では、糖尿病や肥満など、他の状態や病気の調査も可能です^11,12,13。多発性硬化症患者における遺伝子発現パターン、または免疫機能およびそれに対する一般的な影響を分析することができます14,15,16。

PBMCは一般に、酸化的リン酸化(OXPHOS)に依存してアデノシン三リン酸(ATP)を生成します^17,18。したがって、PBMCはサロゲートとして幅広い用途をカバーしています。これまでの報告では、PBMCのエネルギー代謝は、早期心不全¹⁹、敗血症性ショック²⁰、ミトコンドリア^機能の性差4などの臓器機能障害に対処するために用いられてきた。PBMCの凍結保存、単離、培養の一般的な方法は、異なる施設で得られた結果の比較可能性において利点があります。各ステップ^21,22のプロトコルには大きなばらつきがあり、この方法の目標は、PBMCにおける生体エネルギー測定のガイドラインを提供することである。

本稿では、PBMCの生体エネルギーパラメータを測定する方法について説明します。ヒトの血液からPBMCの生体エネルギーを単離、凍結保存、測定する方法を説明します。この方法は、患者の生体エネルギーパラメータを決定し、臨床状況でそれらを評価するために使用できます。これらの測定を適用するには、研究者は新鮮な血液サンプルを採取できる患者集団にアクセスする必要があります。

プロトコル

採血、分離、分析に関するこの原稿に記載されているすべてのプロトコルは、ドイツのギーセン大学の治験審査委員会によってレビューおよび承認されています。研究にサンプルを含めることについて、患者の同意が得られました。単離と細胞培養のすべてのステップは、生物学的安全キャビネットの下で行われます。

1.静脈穿刺

1. 消毒スプレー、滅菌綿棒、80mmチューブとマルチアダプター付き採血カニューレ、止血帯/血圧カフ、モノベット9mLリチウムヘパリンなど、採血に必要なすべての機器を準備します。
   注:抗凝固剤としてのEDTAも効果的です。
2. 最も適切な腕の静脈、通常は正中大静脈または頭静脈から血液を採取します。
3. 止血帯/血圧カフを約80 mm / Hgの軽い圧力で適用します。
4. 手袋や穿刺部位をアルコール入りの消毒スプレーで消毒してください。消毒した穿刺部位を風乾させます。
5. 圧迫カフの圧力により静脈が突き出ています。針(カニューレ直径(外側)21G / 0.8 mm、長さ19 mm)を静脈の15°〜20°の角度で挿入し、外傷を回避し、プロービングを最小限に抑えます。
6. 適切なシステムで血液を採取し、9 mLの血液を含む4本のチューブを使用します(7〜8本を超えるチューブは、1人の実験者が適切に分離するのに問題があります)。
7. 採血後、採血チューブを暗所に5分間置き、均一な抗凝固療法を確保します。

2. PBMC絶縁

1. 以下で説明するように、必要なすべてのソリューションを準備します。
2. ダルベッコ平衡塩溶液(DPBS;濃度1倍)とリンパ球分離培地(1.077 g / mL)を室温(20〜25°C)に戻します。
3. ウシ胎児血清(FBS)を室温で調製し、FBSを含む滅菌50 mLコニカルチューブ1本を氷上に保管します。血液サンプルごとに、2 mL の FBS が必要です。
4. 冷凍容器は4°Cで保管し、クライオチューブは4°Cで予冷します。
5. 細胞培養培地を37°Cに温めると、培地は50 mLのFBSとペニシリン50 U/mLのストレプトマイシン50 U/mLを含むRPMI 1640で構成されています。この溶液は、3°Cで最大2か月間保存できます。
6. 滅菌済みの 50 mL コニカルチューブに 8 mL の DPBS を加えます。滅菌した50 mLのコニカルチューブに15 mLのリンパ球分離培地を加えます(培地は光に敏感であるため、単離を開始する前に添加してください)。
7. 8 mLのDPBSに8 mLの血液を加え、3 mLのプラスチック製パスツールピペットでさらに慎重に混合します。
8. リンパ球分離培地の上に、3 mLのプラスチック製パスツールピペットで血液/DPBSミックスを穏やかに重ねます。最初の層を培地に塗布するには、チューブを20°〜30°傾けると、血中PBS混合物が培地層に浸透しにくくなります。
9. 血中PBS混合物をチューブの側壁を越えてリンパ球分離培地に慎重に重ねます。一定の速度を使用して、血流を一定に保ちます。
10. 次のステップでは、チューブをゆっくりと直立させ、残りの血液をチューブの側壁から血液層に慎重に層状にします。
11. ブレーキをオフにしたスイングバケットローターを備えた遠心分離機で、室温で1000 x g で10分間遠心分離します。遠心分離後、血液とPBMCの混合液を4層に分けます。最上層は血漿と血小板で構成され、第二層はPBMC層、続いてリンパ球分離中層、そして最後に最下層の赤血球と顆粒球で構成されています。図 1 に、さまざまなレイヤーを示します。
12. プラスチック製のパスツールピペットでプラズマ^層の2 /3を取り除きます。
13. 1 mLのピペットを使用して、サンプルに培地が混入しないように注意しながら、リンパ球単離培地層上のPBMCを回収します。
14. チップをPBMC層から1mm上に置きます。PBMC層に穴をあけてはならず、そうでなければ培地が細胞上を流れてしまいます。ピペットの吸引によりPBMCがここまで引っ張られ、この時点で数回回収することができます。
    メモ:収集するPBMCの数を最大化するには、手順の最後に表面上の残りの細胞を検索し、そこでも細胞を収集してみてください。手順を安定させるために、チューブを表面に置くことができます。
15. 層が完全に収穫されるまで、PBMC を新しい 50 mL チューブに段階的に移します。DPBSを25 mLまで添加し、リンパ球単離培地およびその他の残留物を洗い流します。
16. ブレーキをかけたまま、室温で100 x g で10分間遠心分離します。真空ポンプ等で上澄み液を除去し、細胞ペレットを傷つけないように注意する。
17. ペレットを 1 mL の DPBS に再懸濁し、DPBS を 25 mL のマークに加算します。もう一度洗浄を繰り返してから、次のステップに適した培地に再懸濁します。

図1:密度勾配遠心分離の模式図で、さまざまな層を説明しています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

3. 凍結保存

1. 冷凍容器を4°Cまで冷却し、氷上でFBSを冷却します。
2. PBMCペレットを1 mLのピペットで1 mLのFBSに再懸濁し、FBSは室温に戻します。
3. DMSOと予冷したFBSを氷上で1:5、最終濃度20%DMSOで混合し、FBS:DMSO混合物を氷に戻します。常に新鮮な溶液を準備します。
4. PBMC細胞懸濁液をFBSに移し、十分に標識された2 mLクライオチューブに移します。採取チューブ1本につきクライオチューブを1本使用してください。細胞数を mL あたり 1 x 10⁷ から 5 x 10⁷ の間で調整します。自動セルカウンターを使用して、細胞数と生存率を判断します。
5. FBS:DMSO混合物1 mLを1 mLピペットで、1秒あたり約1〜2滴ずつチューブに滴下します。滴下により、連続的かつ一貫した混合が可能になります。
6. 予冷した冷凍容器にチューブを入れます。冷凍容器を-80°Cの冷凍庫に24時間入れます。冷凍容器は、毎分-1°Cの制御された冷却を提供します。
7. -80°Cの冷凍庫からチューブを取り出します。冷凍庫から取り出した後、チューブを液体窒素の気相に保管します。各サンプルの場所を文書化します。

4. 解凍

1. 必要なすべての溶液を調製します:50 mLのFBSおよびペニシリン50 U/mL、ストレプトマイシン50 U/mLを含む細胞培養培地RPMI 1640。この溶液は、3°Cで最大2か月間保存できます。
2. 細胞培養培地を37°Cに予熱します。 予熱した細胞培養培地3 mLを滅菌50 mLコニカルチューブに加えます。
3. 液体窒素タンクからサンプルを取り出します。サンプルを37°Cのウォーターバスで約3.5分間解凍し、最後の氷が溶けたらすぐにウォーターバスから取り出します。ピンヘッドサイズの氷のかけらがチューブの中にまだ見えるはずです。
   注:DMSOはPBMCの作業に有害です。
4. cell:FBS:DMSO mixを1 mLピペットでクライオチューブから取り出します。PBMCサンプルを、調製した50 mLチューブ内の細胞培養培地と混合します。5 mLの培地で、2 mL、2 mL、1 mLの3段階でチューブを洗い流します。
5. 培地をチューブに移します。これは、可能な細胞残基を転写するために行われます。室温で100 x g で10分間遠心分離します。
6. 上清を廃棄し、計画された使用に適した培地を1 mL添加します。細胞はその後の実験の準備ができています。
   注:ただし、新鮮細胞または凍結細胞の機能試験では、リンパ球単離培地ベースの単離または細胞融解後に、インキュベーターでの休止期間(通常は一晩)が推奨されることがよくあります。

5. 細胞培養

1. 培養細胞を単離または融解した後、5% CO₂/95%空気中で37°Cで一晩。
2. 10% FBS、ペニシリン 50 U/mL、ストレプトマイシン 50 U/mL を添加した 1 mL の RPMI 培地に細胞を再懸濁します。さらなる使用には多くの可能性があり、アッセイの必要に応じて細胞を処理します。
3. 一般的な保存には、滅菌済みの6ウェル細胞培養プレートを使用し、休止期間後に細胞を回収します。1 mLのピペットで1 mLの細胞懸濁液をウェルに移し、4 mLの細胞培養培地を加えます。
   注:単離されたPBMCの量は個人によって大きく異なり、分離された血液8 mLごとに5 mLの細胞培養培地が入った1つのウェルで十分です。ただし、バフィーコートからPBMCを単離する場合、PBMCの量は全血サンプルよりも大幅に多いため、細胞をいくつかのウェルに分割する必要があります。
4. 37°Cで5%_CO2 を添加した加湿雰囲気中で細胞を24時間休ませます。 このインキュベーションは、凍結保存された細胞だけでなく、新たに単離された細胞に対しても行われます。

6. ATPアッセイ

3. 
   
11. 
    
14. 
    
15. 
    
16. 
    
17. 
    
21. 
    

結果

細胞生存率と細胞数
単離と凍結保存を成功させるには、細胞数と生存率をできるだけ高くする必要があります。凍結保存の前後に細胞をカウントし、細胞の健康と品質を確保するためにそれらの生存率を決定します。 図3 は、凍結保存前後のPBMCの代表的な説明図であり、細胞数および生存率はほとんど変わらない。これは、PBMC の分離と保存が成功したことを示します。

図3:凍結保存が細胞数と生存率に及ぼす影響。 試験群は、新たに単離されたPBMCを持つ対照群と、1ヶ月凍結保存後のPBMCに分けられます。細胞の計数およびそれらの生存率の決定は、自動セルカウンタ...

ディスカッション

このプロトコルは生体エネルギー分析のために適した方法で人間の血から末梢血の単核細胞(PBMC)を隔離し、cryopreserveする手段を提供する。記載されている方法は、PBMCを穏やかかつ大量に分離する可能性を提供し、高い生存率と生体エネルギー測定のための十分な細胞を備えています。中断が最小限であっても、長時間の単離が発生するという欠点がありますが、その後の凍結保存により、生体エネルギーの時間に依存しない測定が可能になります。この方法では、サンプルを採取し、後の時点で測定することができます。また、多施設試験でサンプルを収集し、中央で同時にパラメータを測定するのにも適しています。

凍結保存は、細胞を長期間保存し、その後測定する可能性を提供します。PBMCの単離は、約2〜3時間の時間のかかるプロセスであり、一度に採取できるサンプル数は少なくなります。1人の実験者が、品質を損なうことなく、2人以上の個体から同時に新鮮なPBMCを分離することは不可能です。新鮮な細胞で追跡実験を行う必要があるため、手順が複雑になり、追加のストレスと時間のトラブルが発生します。分離と実験のパフォーマンスを分...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.1 M トリエタノールアミン-HCl-バッファー (pH = 8,0)	自己調製	-
0.5 M トリエタノールアミン-HCl-バッファー	自己調製-
1.0 M トリス-HCl-バッファー (pH = 8,1)	自己調製	-
1.01 mM DTBB	自己調製-
10 % Triton X-100	自己調製	-
10 mM オキサラセタ	自己準備-
14–20 G 滅菌採血針 マルチアダプター Sarstedt Safety-Multifly	Sarstedt	156353_v
37% HCl		Carl Roth GmbH & Co. KG-70
% エタノール (EtOH)	自己調製-
アセチル-CoA	膵臓 Applichem	A3753
ADP	Sigma-Aldrich	A5285
アルコールワイプ			(70%イソプロピルアルコール)
アンチマイシンA	Sigma-Aldrich	A8674
Aqua (bidest.)	MilliQ Academic(自作)	-
Ascorbate	Sigma-Aldrich	A4034
ATP-Standard	Sigma-Aldrich	6016949
Biocoll Seperating Solution	Biochrom	6115
Biological safty cabinet MSC Advantage	Thermo Fisher Scientific Inc.
カルボニルシアン化物-p-トリフルオロメトキシ-フェニルヒドラゾン (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
セルカウンター TC20 自動セルカウンター	バイオ・ラッド
遠心分離機 ヘレウス メガフュージ 16 R	サーモフィッシャーサイエンティフィック インク
カウントスライド、セルカウンター用デュアルチャンバー	Bio-Rad	1450016
Cryotube Cryo.S	Grainer Bio-One	126263-2DG
Digitonin	Sigma-Aldrich	37008
Dimethylsulfoxid (DMSO)	Merck	102952
消毒スプレー
使い捨て手袋 ラテックス、ゴム、またはビニール。
Distrips(12.5 ml)DistriTips	Gilson	F164150
Dulbecco'S Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x)	Gibco (Thermo Scientific)	15217168
Ethanol (EtOH 100%)	Carl ROTH GmbH & Co. KG	9065.3
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F9665
Frezer (-80°C)	サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社
グルタミン酸	Sigma-Aldrich	G1626
ホルダー/アダプター
インキュベーター Midi 40 CO2	サーモフィッシャーサイエンティフィック(株)
注射用シリンジ	ハミルトン
リンゴ酸	シグマ-アルドリッチ	M-1000
MIR05	自家調理-
Mr.フロスティ冷凍容器	サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社
マルチリーダー CLARIOstar	BMG Labtech
窒素タンク ロケーター 6 plus	サーモフィッシャーサイエンティフィック インク
オリゴマイシン	Sigma-Aldrich	O4876
シュウ酸	Sigma-Aldrich-Oxygraph-2k
	Orobororus Instruments
	PAA	15140122
Pipettes Performance Pipettor 10 μL、100 μL、1000 μL	VWR
ロズウェルパーク。Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640)	Gibco (Thermo Scientific)	11530586
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875
Saccharose	Carl ROTH GmbH & Co. KG	9286.2
アジ化ナトリウム	Sigma-Aldrich	S2002
コハク酸	Sigma-Aldrich	S2378
テトラメチルフェニレンジアミン (TMPD)	Sigma-Aldrich	T3134
止血帯/血圧計 カフ
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン	Sigma-Aldrich	108382
Triton X-100	Sigma-Aldrich	108643
Trypanblau	Biochrom	T6146
真空ポンプ	Vaccubrand GmbH & Co.
ViewPlate-96	Perkin Elmer	6005181
ウォーターバス WNB22	Memmert GmbH & Co. KG