光変換を用いた肺転移からの腫瘍細胞播種の追跡

サマリー

肺転移の選択的光変換のための外科的プロトコルを含む肺転移からの腫瘍細胞の再分配を研究する方法を提示し、続いて第三次臓器における再播種性腫瘍細胞の同定を行います。

要約

転移(がんの全身性広がり)は、がん関連死の主な原因です。転移は、原発腫瘍の細胞が播種して転移を播種する一方向のプロセスであると一般的に考えられていますが、既存の転移の腫瘍 細胞も再播種し、「転移からの転移」または「転移から転移への播種」として知られるプロセスで三次部位に新しい病変を生じさせる可能性があります。転移から転移への播種は、転移の負担を増加させ、患者の生活の質および生存率を低下させる可能性がある。したがって、この現象の背後にあるプロセスを理解することは、転移性がん患者の治療戦略を洗練させるために重要です。

転移から転移への播種については、物流上および技術上の限界もあって、ほとんど知られていない。転移から転移への播種に関する研究は、主にシーケンシング法に依存しており、転移から転移への播種イベントの正確なタイミングや、それらを促進または防止するものを研究する研究者にとっては実用的ではない可能性があります。これは、転移から転移への播種の研究を容易にする方法論の欠如を浮き彫りにしています。これに対処するために、我々は、肺転移の選択的光変換のためのマウス外科的プロトコルを開発し、本明細書に記載し、肺から三次部位に再播種する腫瘍細胞の特異的マーキングと運命追跡を可能にする。私たちの知る限り、これは腫瘍細胞の再播種と肺からの転移から転移への播種を研究するための唯一の方法であり、ゲノム解析を必要としません。

概要

転移は、がん^{関連死の主な}原因です1。転移性がんは、原発腫瘍の細胞が全身に播種し、遠隔臓器の臨床的に検出可能な腫瘍に増殖するときに発生します^2,3。

転移は、腫瘍細胞が原発腫瘍から播種し、離れた臓器にコロニーを形成する一方向のプロセスであると一般的に考えられていますが⁴、臨床的および実験的証拠の増加は、より複雑で多方向のプロセスが作用していることを示唆しています。循環腫瘍細胞は原発腫瘍を再播種することができ(まだ存在する場合)5,6,7,8,9、および既存の転移性病巣からの腫瘍細胞が三次部位に移動して新しい病変を引き起こす可能性があることが示されています10,11,12,13.実際、最近のゲノム解析からの証拠は、一部の転移性病変が原発腫瘍からではなく、他の転移から生じることを示唆しています-「転移からの転移」または「転移から転移への播種」として知られる現象14,15,16。転移から転移への播種は、原発腫瘍を切除した後でも疾患プロセスを永続させ、転移負荷を増加させ、患者の生活の質と生存率を低下させる可能性があります。したがって、転移から転移への播種の背後にあるプロセスを理解することは、転移性疾患患者の治療戦略を洗練させるために重要です。

潜在的に重篤な臨床的影響にもかかわらず、転移から転移への播種についてはほとんど知られていない、一部は物流上および技術上の限界のためである。ヒトでの研究は、臨床サンプルの不足によって制限されています。転移性病変の臨床的切除および生検は、単一の播種性腫瘍細胞が潜んでいる可能性のある一見健康な臓器の生検と同様にまれである。つまり、ヒトでの研究は、通常、原発腫瘍がまだ残っているか、以前に切除されたが研究者がまだ利用できる個人の剖検サンプルを使用してのみ可能です。そのような試料が入手可能な場合、癌進行の系統解析は、配列決定法を用いて実施されなければならない¹⁴。しかしながら、一致した原発腫瘍および転移の一括シーケンシングは、包括的な系統追跡に必要な感度を有していない。例えば、1つの病変のバルクシーケンシングにより、一致した病変のいずれでも検出できないサブクローンが明らかになることがあります。この場合、このサブクローンの起源を特定することはできません。原発腫瘍または別の転移に検出限界を下回る頻度で存在していたか、またはそれが発見された転移性病変の最初のコロニー形成後に発生した可能性があります。シングルセルシーケンシングは感度を向上させますが、コストが高いため、この手法の大規模な適用は制限されます。これらの研究のレトロスペクティブな性質は、一過性の転移事象と異なる時点での疾患の状況に関する洞察が限られていることも意味します。

動物モデルでは、最近の技術の進歩により、高い空間的および時間的分解能を備えた前向き系統発生マッピングが可能になりました^17,18,19,20。これらの技術は、CRISPR/Cas9ゲノム編集を利用して、進化するバーコード(時間の経過とともに蓄積する遺伝性変異)を持つ細胞を操作します。シーケンシングでは、バーコード^{17、18、19、20}の突然変異プロファイルに基づいて各細胞の系統をたどることができます。実際、このような技術は、転移から転移への播種をマッピングするためにすでに使用されています。最近の論文で、Zhangらは、骨転移中の乳がん細胞と前立腺がん細胞が骨から再播種し、複数の臓器に二次転移を播種することを実証しました²¹。

これらの新しい方法は、がんの進行に関する詳細で高解像度の系統図を作成する大きな可能性を秘めていますが、転移から転移への播種イベントの正確なタイミングと、それらを促進または予防するものを研究している人にとっては、非常に実用的ではありません。これらの知識のギャップを埋めることは、転移性がんの理解と治療を洗練させるために不可欠ですが、そのような研究を促進するための技術が著しく不足しています。このニーズに対処するために、私たちは最近、転移部位(肺)の光変換を介して腫瘍細胞を特異的にマーキングし、その後三次臓器でそれらを再識別できる新しい技術を開発し、ここに提示します。この手法を用いて、我々は最近、乳がん細胞が肺転移から再播種し、第三次臓器に種をまくことを示した¹³。この手法は、狭いウィンドウ内で再播種イベントのタイミングを決定し、再播種した腫瘍細胞を定量するためにも使用でき、再播種された細胞の器官向性および再播種を促進/防止するものの研究を容易にします。

ある蛍光タンパク質を別の蛍光タンパク質に恒久的に置き換える光変換および局所誘導性cre/loxシステムは、腫瘍細胞のマーキングと追跡に以前に使用されてきましたが^11,22,23、私たちの知る限り、腫瘍細胞の時空間マーキングのアプローチは、最も一般的な14の癌のいずれかと診断された男性と女性の間で最も一般的な転移部位の1つである肺を標的にするように最適化されていません²⁴.肺転移生成のためのあらゆるがん細胞タイプとプロトコルを私たちの手順で使用することができ、転移研究者にとって広く有用です。肺転移の生成に使用されるすべてのがん細胞は、光変換性または光切り替え可能なタンパク質を発現する必要があり、研究者は特定のニーズとリソースに基づいて使用するタンパク質を選択できます。本研究では、ヒストンH2Bにタグ付けされた光変換可能な緑色から赤色の蛍光タンパク質Dendra2(6DT1-Dendra2細胞)²⁵を安定に発現する6DT1乳癌細胞を用いた。雌のRag2^-/-マウスの4番目の乳腺脂肪パッドに5.0×10^{4 6DT1-Dendra2}細胞を注入した。原発腫瘍は注射後12〜16日の間に触知可能であり、実験期間中は切除されなかった。自然肺転移は、腫瘍細胞注射後19〜26日の間に発症した。光変換手術は、腫瘍細胞注射後26〜29日の間に行われました。マウスは、肺転移の負担のために術後72時間までに犠牲にされました。

プロトコル

このプロトコルに記載されているすべての手順は、アルバートアインシュタイン医科大学の施設動物管理および使用委員会による事前承認を含む、脊椎動物の使用に関するガイドラインおよび規制に従って実行されています。

手術に先立ち、光変換性/光スイッチ性タンパク質を発現するがん細胞を用いたマウスに肺転移を発生させます。肺転移生成のためのいくつかのプロトコルが公開されています^26,27,28。

1.手術の準備

1. マウスの準備(脱毛と挿管)、手術、および回復のために、個別の作業領域を準備します。
2. すべての手術器具をオートクレーブで滅菌します。
   注:この手術にはチップのみの技術が使用されるため、ホットビーズ滅菌器を使用して、その後の手順のために器具を再滅菌することができます。
3. 加熱された手術プラットフォームの電源を入れ、37〜40°Cに到達して安定させます。
4. 5%イソフルランで麻酔を誘発し、イソフルランを3%に下げます。麻酔の妥当性を評価するために、手順全体を通して定期的につま先のつまみテストを実行します。
5. 麻酔をかけたマウスを右外側褥瘡の位置に置きます。左上胸/脇腹の毛を取り除きます( 図1Aを参照)その部分に脱毛クリームを塗ります。ガーゼまたはペーパータオルを水で湿らせ、髪と脱毛クリームを拭き取ります。すべての髪の毛が手術野から取り除かれるまで、必要に応じて繰り返します。
   注意: 脱毛クリームをマウスに20秒以上放置すると、皮膚に損傷を与える可能性があるため、マウスに放置しないでください。
6. 22Gのカテーテルの基部から~3mm上に2-0のシルク縫合糸でダブルノットを結びます。2インチの長さの尾を残します。
7. 前述のように、このカテーテルでマウスを挿管します^29,30。挿管が成功したことを確認するには、カテーテルの端に膨張バルブを取り付け、静かに絞ります。
   注:挿管に成功したマウスは、球根の圧迫で両側の胸部上昇を経験します。
8. 2-0のシルク縫合糸をマウスの鼻の周りに二重の結び目でしっかりと固定し、挿管カテーテルを所定の位置に保ちます。

2.肺を露出させる手術

注:光変換を含む手術のすべてのステップ(図1)は、手術野の汚染を避けるために、フードまたは層流キャビネットで行ってください。

1. 消毒石鹸で手を洗い、新しい滅菌手袋を着用してください。
   注:この手術にはチップのみの技術が使用されるため、非滅菌手袋を使用することもできます。非滅菌手袋をアルコールベースの消毒剤で消毒することをお勧めします。
2. 0.1 mg / kg用量のブプレノルフィン(0.03 mg / mL)を準備し、鎮痛のために皮下注射します。.
   注:局所鎮痛薬や非ステロイド性抗炎症薬を含むマルチモーダル鎮痛薬は、関心のある生物学に干渉することが予想されない場合は、ブプレノルフィンと組み合わせて使用する必要があります。.
3. 角膜の損傷を防ぐために、マウスの両目に眼軟膏を塗布します。
4. マウスを加熱された手術プラットフォームの右外側褥瘡位置に置きます。
5. 人工呼吸器を挿管カテーテルに接続します。わずかな動きでもカテーテルの留置が乱れ、換気が悪くなる可能性があるため、カテーテルを安定させるように注意してください。
6. 安定した、人工呼吸器で制御された、両側の胸部の上昇と下降を観察します。
7. 手足をラベリングテープで手術台に固定します。マウスの背中に沿って別のテープを貼り、背側の皮膚と毛皮を手術台に固定して、手術野を安定させます(図1A)。
8. 滅菌した手術器具を開きます。
9. クロルヘキシジン溶液をマウスの皮膚に塗布して、手術部位を滅菌します。
10. 胸骨の左側に~7mm、肋骨下縁から~7mm上の領域を特定します。鉗子でこの部分の皮膚を持ち上げ、鋭利なマイクロ解剖ハサミを使用して~10mmの円形切開を行い、皮膚だけを切断するように注意します。
11. 胸郭の上の軟部組織を切除します(図1B)。両端の主要な血管を焼灼ペンで焼灼します。
    注:皮膚の10mm円形切開の下にあるすべての軟部組織を切除することに加えて、周囲からいくつかの追加の非筋肉軟部組織を取り除くと、手順の将来のステップが容易になります。
12. 片手で鉗子を使用して、6^番目 または7^番目の 肋骨を持ち上げます。もう一方の手では、鈍いマイクロ解剖ハサミの1枚刃(胸壁に平行な角度を付け、丸みを帯びたエッジを下に向けて)を使用し、6^番目 または7^番目の 肋間筋を慎重に突き刺して胸腔に入ります(図1C)。必要に応じてハサミを静かに回転させ、肺組織に触れたり肋骨を切ったりしないように注意しながら、肋間腔に~10mmの切開を行うようにカットします。
13. 肋間切開部に向かって圧縮空気を繊細に排出し、肺と胸壁の間のスペースを増やします。最初に手首または手で空気を排出して適切な流動強度を見つけ、ノズルから破片を取り除き、次に切開部で短時間バーストして肺の損傷を防ぎます。
14. 片手で鉗子を使用して、6^番目 または7^番目の 肋骨を持ち上げます。もう一方の手で、リトラクターを閉じたまま、肋間切開に挿入します。リトラクターのブレードは、肺自体に触れないように注意しながら、胸壁と平行になるように向けます(図1D)。
15. リトラクターが所定の位置に収まったら、ハンドルをゆっくりと放し、リトラクターを開いて肺を露出させます(図1E)。 図2A は、広視野照明使用時のFITC(緑、非光変換)およびTRITC(赤、光変換)蛍光チャンネルでどのように見えるかを含む、光変換前の露出肺転移の代表的な画像を示しています。

3.肺転移光変換

注: 次の手順の詳細とバリエーションについては、ディスカッションを参照してください。

1. 乾燥を防ぐために、露出した肺組織に37°Cに温めた滅菌PBSを2〜3滴静かに塗布します。
2. マウスの上に小さな切り欠きのある滅菌アルミホイルを置きます。露出した肺組織の上に切り欠きを直接配置し、胸部の開いた部分と周囲の軟部組織と皮膚の数ミリメートルのみを露出させるようにサイズを調整し、露出した肺のみの光変換を確実にします。
3. マウスとアルミホイルの上に切り欠きのある箱を置きます。切り欠きが露出した肺の真上にあることを確認してください。
4. 箱の切り欠きの上に光変換ランプを真上に置きます(図1F)。
5. 光変換ランプをオンにし、露出した肺組織を6分間連続的に照らします。
   注意: 人工呼吸器の生理学的モニタリングプログラムを使用して、マウスのバイタルサインを監視します。
6. 光変換後、ランプをオフにし、ランプ、ボックス、アルミホイルマスクをマウスから取り外します。

4.胸壁を閉じる手順

1. 手順2.13を繰り返して、肺を胸壁から分離します。
2. リトラクターハンドルを慎重につかみ、握ってブレードを閉じます。
3. 閉じたリトラクターを肋間腔から取り出し、肺組織に触れないように注意してください。
4. 5-0シルク縫合糸を使用して、切開部の両側に肋骨を組み込んだ単純な連続縫合パターンで肋間切開部を閉じます(図1G)。縫合糸をしっかりと引っ張って、創傷縁が同位であることを確認し、胸壁の完全性を再確立します(図1H)。縫合糸を締めすぎると肋間筋が裂けるので注意が必要です。
5. 縫合糸の両端を4回結び、縫合糸を固定します。縫合糸の尾をできるだけ結び目の近くで切ります。
6. 外科用ステープルで皮膚を閉じます。
7. 28Gの針を取り付けた1mLのインスリン注射器で胸腔から余分な空気を取り除きます。剣状突起を触覚的に見つけ、針をすぐ下に挿入し、左肩に向かって前進して横隔膜から胸腔に入ります。シリンジを~1 mLまで引き戻します。マウスから針を抜き、シリンジから空気を排出します。このプロセスを3〜4回繰り返します。
   注意: 内臓に穴を開けないように注意してください。さらに、大容量のシリンジを使用して一度にすべての空気を除去しようとするのではなく、1 mLのシリンジを使用して手順を3〜4回繰り返すことが重要です。大容量のシリンジを使用すると、胸腔内の真空が大きすぎて、肺組織の膨張や損傷につながる可能性があります。.
8. イソフルランをオフにします。
9. マウスが覚醒の兆候を示すまで、100%酸素で換気を続けます。
10. マウスに覚醒の兆候が見られたら、挿管カテーテルを人工呼吸器から外し、鼻の周りの縫合糸を切断し、マウスを抜管します。
11. マウスのテープを外し、ヒートランプの下に~2フィート下に設置された清潔なケージに移します。完全に回復するまで監視します。マウスに呼吸困難や可動性の欠如の兆候が見られる場合は、5%イソフルランで5分間麻酔をかけ、つま先をつまんだときに反射の喪失を観察して適切な麻酔を確保し、子宮頸部脱臼で安楽死させます。.
12. マウスが麻酔から完全に目覚めて動き始めたら、さらに0.1 mg / kg用量のブプレノルフィンを準備し、術後鎮痛のために皮下注射します。.
13. 手術後、マウスが個別に飼育されていることを確認してください。飲料水に抗生物質を投与します(エンロフロキサシン、最終濃度0.4 mg / mL)。
14. 手術後3日間は、1日2回マウスに苦痛の兆候がないかチェックします。疼痛管理のために、0.1 mg / kgブプレノルフィン(0.03 mg / mL)を4〜6時間ごとに皮下投与します。.マウスが感染、不動、または呼吸困難の兆候を示している場合は、安楽死させます。3日目以降は、1日1回マウスをチェックできます。

5. 組織透明化による光変換細胞のサンプル処理と検出

1. 光変換手術後3〜5日(または所望の期間)の間に、マウスに5%イソフルランを麻酔し、導入後にイソフルランを5%から2.5%に減らし、つま先をつまんだときに反射の喪失を観察して適切な麻酔を確保し、10mLの室温PBSで終末経心灌流を行い、続いて10mLの4%パラホルムアルデヒドを4°Cに冷却した³¹。
2. 関心のある臓器を収集し、前述のように光学的に除去します³¹。
3. 前述のように、透明化した組織をライトシート顕微鏡で画像化します³¹。あるいは、透明化した組織をガラス底の皿に入れ、FITCおよびTRITCチャンネルで画像化し、共焦点顕微鏡、回転円盤顕微鏡、または多光子顕微鏡を使用して緑色(非光変換)および赤色(光変換)細胞を可視化します。

6. 組織解離による光変換細胞の試料処理と検出

1. マウスに5%イソフルランを5分間麻酔し、つま先をつまんだときに反射の喪失を観察して適切な麻酔を確保し、光変換の3〜5日後に子宮頸部脱臼で犠牲にします。
2. 前述のように、目的の臓器を収集して消化します¹³.
3. 消化された組織をプレートにかけ、インキュベーターに入れて、前述のように一晩接着します¹³。
4. 翌日、FITCおよびTRITCチャネルでプレーティングされた細胞を画像化し、前述のように緑(非光変換)および赤(光変換)細胞を可視化します¹³。

結果

このプロトコルで説明されている手術の手順を 図1に示します。簡単に言うと、マウスに麻酔をかけ、左胸部から毛を取り除きます。その後、マウスに挿管と換気を行い、胸腔が開いている間にマウスに酸素を供給できるようにします。軟部組織を切除して胸郭を露出させ、6^番目 または7^番目の 肋間筋を切開します。リトラクターは肋間裂孔に挿入され、隣接する肋骨を広げ、左肺とその上の光変換性転移を露出させるために解放されます。次に、肺と転移を青色光に曝露し、露出した病変を光変換します。光変換後、リトラクターを除去し、肋骨を縫合し直し、上にある皮膚を閉じます。最後に、胸腔から余分な空気を除去して肺への圧力を軽減し、マウスが独立した自発呼吸を再開できるようにします。

ここに記述されているプロトコルはいくつかの異なったphotoconvertible/photo-switchable蛋白質に合わせることができる。光変換された細胞が光変換されたチャネルでピーク蛍光強度に達するようにすることで、他の臓器での同定を容...

ディスカッション

この論文では、肺の腫瘍細胞の選択的光変換のための外科的プロトコルについて説明します。この技術により、研究者は肺の腫瘍細胞を選択的にマークし、後で全身で腫瘍細胞を再識別することでその運命を追跡することができ、肺転移からの転移の研究が容易になります。このプロトコルを用いて、光変換手術を行ったマウスの脳、肝臓、非光変換右肺の光変換細胞を可視化することができ、これらの細胞が光変換された肺転移からこれらの三次部位に再播種したことが示されました。マウスの臓器には光変換を受けていない赤血球は見つからず、細胞内の自然自家蛍光は光変換された腫瘍細胞と混同されるほど明るくないことを示しています。

実験の特定の側面に細心の注意を払うことで、この手順の成功率を高めることができます。まず、肺転移を発生させる場合、転移発生のプロトコルと光変換性/光切り替え性タンパク質を考慮する必要があります。一部の蛍光タンパク質は免疫原性があることが報告されています^33,34,35,36...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0-30 V、0-3 A 電源	MPJA	9616 PS
12 VDC、1.2 A 非安定化プラグ電源	MPJA	17563 PD
28 G 1 mL BD インスリンシリンジ	BD	329410
400 nm 発光ダイオードアレイランプ	LedEngin Inc.	897-LZPD0UA00	光変換ランプ、特注品(個別部品は下記参照)
5-0 RB-1カッティングニードル付きシルク編組縫合	Ethicon, Inc.	774B
9 cm 2-0 シルクタイ	エチコン社	LA55G
Baytril 100 (エンロフロキサシン)	Bayer (Santa Cruz Biotechnology)	sc-362890Rx	飲料水で使用される抗生物質
Buprenorphine	Hospira	0409-2012-32	鎮痛
ケーブル (ケーブル アセンブリ) 2.5 JK-ST 72" ZIP CD	Mouser	172-0250
クロルヘキシジン溶液	Durvet	7-45801-10258-3	クロルヘキシジン消毒液
圧縮空気キャニスター	ファルコン	DPSJB-12
極細マイクロ解剖ハサミ 4インチ ストレートシャープ/シャープ 24mm	ロボズ サージカル	RS-5912	シャープマイクロ解剖ハサミ
光ファイバーイルミネーター	O.C. ホワイトカンパニー	FL3000	マウス挿管時に使用
ジェミニ焼灼キット	ハーバード大学装置	726067	焼灼ペン
Germinator 500	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	ビーズ滅菌器
Graefe 鉗子	Roboz	RS-5135
ハイパワー LED - 単色紫外線 90 ワット	マウザー	LZP-D0UA00
赤外線ヒートランプ	Braintree Scientific	HL-1
イソフルラン SOL 250 mL PVL	Covetrus	29405	麻酔薬
イソフルラン気化器	SurgiVet	VCT302
ロック付きジェイコブソンニードルホルダー	カルソンサージカル	T1-140
ラベリングテープ	フィッシャーサイエンティフィック	S68702
LED照明リフレクター CREE MP-L SNGL レンズリフレクター &LOC PIN	Mouser	928-C11395TM
ロング コットン チップ アプリケーター	Medline Industries	MDS202055
Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4/Celeron 最大 3.4GHz / ボールベアリング / 銅コア / CPU 冷却ファン	CompUSA	#S457-1023
マイクロ解剖はさみ 4 インチ ストレート 鈍/鈍	Roboz 外科	用 RS-5980	鈍いマイクロ 解剖はさみ
マウス用人工呼吸器	Kent Scientific	PS-02	PhysioSuite
Nair 脱毛ローション	Amazon	B001RVMR7K	脱毛クリーム
Personnet mini retractor	Roboz	RS-6504	Retractor
Phosphate Buffered Saline 1x	Fisher Scientific	14190144	PBS
pLenti.CAG.H2B-Dendra2.W	Addgene	51005	Dendra2 lentivirus
Puralube	HenrySchein Animal Health	008897	Eye Lubricant
げっ歯類挿管スタンド	Braintree Scientific	RIS 100
小動物肺膨張球根	ハーバード装置	72-9083
SurgiSuite マウス用多機能手術プラットフォーム、温暖化付き	Kent Scientific	SURGI-M02	加熱手術プラットフォーム
テストリード 48インチ テストリード バナナ - ブラック	マウ	ザー565-1440-48-0
テストリード48インチテストリードバナナ-レッド	マウ	ザー565-1440-48-2
気管カテーテル	Exelint International	26746	22 Gカテーテル
傷閉鎖システム獣医キット	クレイアダムス	IN015	獣医外科ステープルキット