方法論記事

2次元(2D)単一培養から3次元(3D)多文化まで、さまざまな用途に対応するスキンモデルの構築

DOI：

10.3791/65773

⸱

2023年10月20日

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1Chair of Drug and Cosmetics Biotechnology, Faculty of Chemistry, Warsaw University of Technology, 2Department of Histology and Embryology, Medical University of Warsaw

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、細胞培養ラボでの日常的な研究のためのさまざまな3Dスキンモデルを導入するための安価で簡単な手順を紹介します。研究者は、市販のモデルに頼ることなく、自分のニーズに合わせたモデルを作成することができます。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

皮膚の複雑な構造と重要な機能のために、それは化粧品、製薬、および医療業界にとって興味深い研究モデルです。欧州連合(EU)では、化粧品とその成分の動物実験が全面的に禁止されています。医学や医薬品の場合、この可能性も常に限られています。3Rの原則に従って、人工的に作成されたモデル上で個々の化合物だけでなく、全体の製剤をテストすることがますます一般的になっています。最も安価で最も広く使用されているのは2Dモデルで、これは細胞単層で構成されていますが、組織内の細胞間の実際の相互作用を反映していません。市販の3Dモデルは組織をよりよく表現していますが、大規模には使用されていません。これは、高価で待ち時間がかなり長く、利用可能なモデルが通常使用されるものだけに制限されることが多いためです。

実施した研究をより高いレベルに引き上げるために、さまざまな3Dスキンモデル製剤の手順を最適化しました。記載されている手順は、細胞培養のさまざまな経験を持つ多くの研究室や研究者が適用できるため、安価で簡単に調製できます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

皮膚は、この複雑な臓器の適切な機能と恒常性を明らかにする多細胞相互作用を伴う連続構造です。それは形態学的に異なる層から構築されています:内側の層 - 真皮、そして外側の層 - 表皮。表皮の上に、角質層(平らにされた死んだ細胞 - 角質細胞からなる)をさらに区別し、外部環境に対して最大の保護を提供します。皮膚の最も重要な受動的および能動的機能のいくつかは、外的要因に対する身体の保護、免疫学的プロセスへの参加、分泌、吸収、体温調節、およびセンシング1,2,3です。それは体内で最大の臓器の1つと考えられているため、さまざまな病原体、アレルゲン、化学物質、および紫外線(UV)放射との接触を避けることは不可能です。したがって、特定の機能を持つ多くの種類の細胞で構成されています。表皮に存在する細胞の主な種類は、ケラチノサイト(全細胞のほぼ90%、表皮の深部に構造的および免疫学的機能を持つが、後に角質化プロセスを経て表皮の最上層の角質細胞に変わる)、メラノサイト(表皮細胞集団のわずか3%〜7%で、UV保護色素メラニンを産生する)およびランゲルハンス細胞(免疫系から)です。真皮の場合、主な細胞は線維芽細胞(成長因子とタンパク質を産生する)、樹状細胞、および肥満細胞(免疫系の細胞タイプ)である4,5,6。さらに、皮膚にはいくつかの細胞外タンパク質(I型およびIV型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンなど)が備わっています。図1)タンパク質繊維(コラーゲンとエラスチン)は、皮膚の特定の構造を確保するだけでなく、細胞結合、細胞接着、およびその他の相互作用を促進します7。

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図 1: スキン構造を示す概略図。 皮膚の構造は、その個々の層で発生する4つの基本的な細胞タイプを示し、細胞外マトリックスのタンパク質を区別しました。この図はMS PowerPointで作成されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

化粧品や医薬品の安全性は非常に重要な問題であり、消費者と患者の健康を保護することは優先事項です8。最近まで、動物で行われた研究を含む多数のテストによって保証されることになっていました。残念ながら、これらはしばしば抜本的な方法の使用を必要とし、研究目的で使用される動物(多くの場合、マウス、ラット、ブタ)に痛みと苦しみを引き起こしました。1959年、人道的実験技術の原則(3Rの原則)が導入されました:(1 - 交換)研究中の動物を in vitro、 in sillico、 または ex vivo モデルに置き換える、(2 - 削減)研究に使用する動物の数を減らす、(3 - 改良)研究にまだ必要な動物の健康を改善すると同時に、開発された代替方法を改善する9.さらに、欧州連合(EU)では、動物に対する化粧品試験は法律で規制されています。2004年9月11日から、動物実験による化粧品の禁止が施行されました。2009年3月11日、EUは化粧品原料の動物実験を禁止しました。新たに動物実験された成分で作られた化粧品の販売は許可されていませんでした。しかし、反復投与毒性、生殖毒性、トキシコキネティクスなどの複雑なヒトの健康問題について、動物で製品をテストすることは依然として許容されていました。2013年3月11日以降、EUでは、完成品またはその成分が動物実験された化粧品の販売は違法です10。そのため、現在、美容学では、 in vitro (細胞)、ex vivo (実組織)、 in vivo (ボランティア)の3つのレベルで研究が行われています11。医薬品の場合、動物実験の必要性は依然として残っています。ただし、大幅に削減され、厳密に管理されています12。

動物実験の代替方法として、また新規有効成分の有効性の初期評価には、 in vitro 皮膚細胞培養が使用されます。さまざまな種類の皮膚細胞を分離し、無菌の実験室条件でそれらを培養することで、活性物質の安全性と毒性を評価できます。また、皮膚細胞株は、認定企業から販売されており、その結果を異なる研究室で比較できるため、研究のモデルとして広く認識されています。これらの試験は通常、ヒト皮膚細胞の単一培養の単純な2Dモデルで実施されます。より高度なモデルのいくつかは、それらの共培養(例えば、線維芽細胞を有するケラチノサイトおよびメラノサイトを有するケラチノサイトなど)であり、ならびに、足場フリー培養(球体)および表皮、真皮、あるいは皮膚の全層代替品の足場ベースの皮膚同等物を含む3次元モデルである13。最後のタイプ(皮膚同等物)を除いて、残りは市販されておらず、必要に応じて科学者が自分で準備する必要があることに言及する価値があります。

これらのモデルの多くが維持され、今日では日常的に販売されていますが(表1)、ほとんどの結果を検証するためには常に追加のモデルが必要です。したがって、新たに設計されたモデルは、人体で起こっている実際の相互作用をよりよく再現する必要があります。このようなモデルを形成するために異なる種類の細胞の混合物を用いると、生体 内で の組織の多細胞性側面の再現が達成できます。その結果、器官型培養物が開発されます(図2)。

名前形容
普通肌エピスキン再構築されたヒト表皮 - コラーゲン膜上のケラチノサイト
スキンエシックRHE再構築されたヒト表皮 - ポリカーボネート膜上のケラチノサイト
スキンエシック RHE-LCヒト表皮モデルランゲルハンス細胞 - ポリカーボネート膜上のケラチノサイトとランゲルハンス細胞
SkinEthic RHPEの再構築されたヒト色素性表皮 - ポリカーボネート膜上のケラチノサイトとメラノサイト
Tスキン再構築されたヒト全層皮膚モデル - ポリカーボネート膜上に成長した線維芽細胞の層上のケラチノサイト
フェニオンFTスキンモデルハイドロゲル中のケラチノサイトと線維芽細胞
病気のある肌メラノーマFTスキンモデル正常なヒト由来のケラチノサイトおよびヒト悪性黒色腫細胞株A375の線維芽細胞
乾癬組織モデル正常なヒトケラチノサイトと線維芽細胞

表1:さまざまな研究で最も人気のある市販の皮膚同等物。

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図2:さまざまな in vitro モデルの複雑さ。 生物を再現するためのさまざまな in vitro モデルの複雑さと、人体で直接発生する実際の相互作用との関係。この図は、セルヴィエ(https://smart.servier.com/)のセルヴィエメディカルアートのセット「微生物学と細胞培養」から変更されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

商用の同等物の最も重要な制限の1つは、数種類の細胞(通常は1〜2個、まれに3個)を持つ非常に一般的な研究モデルのみが利用できることです。それでも、皮膚にはさらに多くの細胞が存在し、それらの相互作用により、さまざまな成分の耐性が良好または悪くなる可能性があります14。一部の免疫成分が不足していると、免疫療法を含むいくつかの種類の研究でその価値が低下する可能性があります。黒色腫は、転移が早期に発症し、適用された治療に対する頻繁な耐性により生命を脅かす皮膚がんです15。人工皮膚モデルを改善するために、研究者は免疫細胞と細胞株およびオルガノイドとの共培養を確立しようと試みています16、これは研究されたモデルの大きな改善と考えられています。例えば、肥満細胞は、皮膚における多くの生理学的(創傷治癒、組織リモデリング)および病理学的(炎症、血管新生、および腫瘍進行)プロセスに関与している17。したがって、モデル内でのそれらの発生は、調査対象の化合物に対するモデルの応答を大幅に変化させる可能性があります。最後に、肌に関する情報はまだたくさん欠けており、それは基礎研究を行うことによってのみ発見することができます。そのため、さまざまな人工皮膚モデル(表2)を作成し、改良することが非常に重要な取り組みです。この記事では、球体やスキン同等物など、高度なスキン モデルを作成するためのいくつかの手順について説明します。

in vitro 皮膚モデル組織内で発生する相互作用の再現を試みる使用したセルの例
2Dまたは3D細胞培養表皮ケラチノサイト
メラノサイト
ケラチノサイト + メラノサイト
真皮線維芽細胞
肥満細胞
線維芽細胞+肥満細胞
皮膚ケラチノサイト+線維芽細胞
ケラチノサイト+マスト細胞
メラノサイト + 線維芽細胞
メラノサイト + マスト細胞
ケラチノサイト + 線維芽細胞 + メラノサイト
ケラチノサイト + 線維芽細胞 + 肥満細胞

表2:2Dおよび3D培養で皮膚組織を再現するための細胞型混合物の例。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、ヘルシンキ宣言のガイドラインに従って実施され、ワルシャワ医科大学の倫理委員会 (KB/7/2022) によって承認されました。インフォームドコンセントは、研究に関与するすべての被験者から得られました。

注:高度な皮膚モデル調製物に記載されている手順は、市販の初代皮膚細胞および細胞株のいずれかを使用して、または患者から単離された初代細胞を用いて実施することができる。市販のセルには関連文書が付属しており、ほとんどの国での研究での使用には追加の承認は必要ありません。ただし、一部の国では義務であるため、地方倫理委員会の規則で確認する必要があります。患者から単離された初代細胞を研究に使用する必要がある場合、まず、研究は地元の倫理委員会によって承認されなければならず、それは彼らの厳格なガイドラインに従って実施される必要があります。さらに、書面によるインフォームドコンセントは、すべての皮膚組織ドナーから収集する必要があります。初代皮膚細胞の単離は本稿の主題ではなかったが、例示的な単離手順は、Kostenら(ケラチノサイト)18、Ścieżyńskaら(メラノサイト)19、Krögerら(線維芽細胞および肥満細胞)20に見出すことができる。正常な皮膚細胞と細胞株のほとんどは、BSL1クラスの安全性レベルを持っています。彼らは脅威を引き起こさない。ただし、使用される実験装置は、制御された条件下での動物およびヒトの細胞培養の基準を満たす必要があります。

1. 皮膚細胞培養

注:皮膚細胞の培養は、接着細胞または浮遊細胞専用のフラスコ(細胞の種類によって異なります)で、インキュベーター内で37°C、二酸化炭素含有量5%で実施する必要があります。それらの栽培および研究のための使用に関連する活動は、無菌状態を必要とし、紫外線C(UVC)に15〜30分間さらされた後、層流チャンバーで行わなければなりません。細胞懸濁液を採取し、それを用いて二次元モデルおよび三次元モデルを作成するには、細胞の種類に応じた手順を実施する必要があります(ケラチノサイト、線維芽細胞、メラノサイトなどの接着細胞の場合はステップ1.1、肥満細胞の非接着細胞の場合はステップ1.2)(図3)。異なる培養フラスコサイズについて、記載されている方法で使用したすべての試薬(培地、リン酸緩衝生理食塩水、トリプシン溶液など)の容量を 表3に示します。細胞の種類(試薬の濃度と組成、遠心分離方法など)に依存するパラメータを 表4に示します。播種に用いた細胞密度を 表5に示します。これらの表はすべて、このセクションの最後にあります。

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図3:接着細胞培養と非接着細胞培養。 接着細胞培養と非接着細胞培養の一般的なステップバイステップの手順(番号はステップ1.1および1.2の説明に対応しています)。図はMS PowerPointで作成されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

  1. 接着細胞の懸濁液を得る
    1. 培養フラスコから培地を取り出します。
    2. リン酸緩衝生理食塩水で細胞を穏やかに洗浄します(PBS、 表3)。
    3. エチレンジアミンテトラ酢酸にトリプシン溶液を添加します(トリプシン-EDTA溶液、 表3)。フラスコを37°Cでインキュベートし、光学顕微鏡で表面からの細胞の剥離を制御します。
    4. 分離した細胞を少なくとも2倍の全増殖培地またはトリプシン中和剤に懸濁して、トリプシン(2:1)を不活性化します(容量については表3を、試薬については 表4を参照してください)。フラスコの内容物を15mLチューブに定量的に移します。
    5. 少量(20 μL)の細胞懸濁液を1.5 mLチューブに取り、手動または自動の血球計算盤で細胞をカウントします。
    6. チューブを遠心分離し( 表4のパラメータ)、上清の大部分を取り除き、細胞ペレットを残りの液体の少量に再懸濁します。次に、細胞密度が新しい培地の必要量を播種または再計算するのに適切な場合は、遠心分離前の容量( 表3の容量)を得るのに十分な新鮮な培地を追加します。
      注:メラノサイトなどの一部の細胞は遠心分離に非常に敏感であるため、短時間の距離で再度遠心分離する必要がなくなります。
    7. 実験(皮膚細胞の2D/3D単培養または多培養)に必要な密度(細胞/mL、 表5の細胞密度)の細胞懸濁液を調製します。
      注:細胞をさらに培養する場合は、5,000〜8,000細胞/ mLを新しいフラスコに戻し、新しい培地( 表3の容量)を追加します。
  2. 非接着性細胞の懸濁液を得る
    1. 細胞懸濁液を入れた培地を培養フラスコから取り出し、15 mLチューブに定量的に移します。
    2. 少量(20 μL)の細胞懸濁液を新しい1.5 mLチューブに取ります。手動または自動の血球計算盤で細胞をカウントします。
    3. チューブを遠心分離し( 表4のパラメータ)、上清の大部分を取り除き、細胞を残りの液体の少量に再懸濁します。次に、新しい培地の必要量を播種または再計算するのに細胞密度が適切である場合は、新鮮な培地を添加して予備遠心分離容量( 表3を参照)を得ます。
    4. 実験(皮膚細胞の2D/3D単培養または多培養)に必要な密度( 表5で提案されているように、mLあたりの細胞数)の細胞懸濁液を調製します。
      注:細胞をさらに培養する場合は、5,000〜8,000細胞/ mLを新しいフラスコに戻し、新しい培地を追加します。

    

25 cm2 カルチャーフラスコ75 cm2 カルチャーフラスコ
培地 [mL]4–58–12
PBS樹脂 [mL]510
トリプシン-EDTA [mL]0.5–11–2
中和媒体 [mL]1–22–4

表3:細胞懸濁液の培養および調製中に使用される試薬の量。

皮膚細胞の単一培養トリプシントリプシン不活性化剤遠心分離2Dモノカルチャー用のミディアムタイプ
ケラチノサイト0.25%トリプシン中和剤付き300 x g、5分、室温ケラチノサイト増殖培地2
線維芽細胞0.25%ミディアム付き300 x g、5分、室温




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結果

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研究室で皮膚モデルの作成を開始する前に、使用する細胞の種類(初代/細胞株)と、これらの細胞に適した培地の選択を決定する必要があります。ほとんどのセルバンクは、すべてのタイプの細胞培養に培地を推奨し、提供することができます。多重培養モデルの場合、培養物に存在するすべての細胞タイプに適した培地を1つ選択する必要があります。初代皮膚細胞培養および最も一般的な皮膚細胞株の両方に使用されるいくつかの典型的な細胞培地を、表8 18,19,20,25,26,27にまとめました。初代細胞培養に使用される一般的な培地は、かなり高価であり、その組成は複雑です。一方、細胞株は通常、単純な組成の培地で満足します。いくつかの細胞タイプ(主に線維芽細胞および肥満細胞)は、他の細胞(ケラチノサイトおよびメラノサイトなど)の増殖を刺激する因子を産生および分泌することができる28,29。モデルにそれらが存在することが計画されている場合、培地の追加補充は必要ありません。

細胞の種類セル名中程度参考
ケラチノサイトHaCaTセルラインDMEM、10% FBS、100 U/mL ペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシン売り手によると
一次正常ヒト表皮ケラチノサイト(NHEK)ケラチノサイト増殖培地2(基礎培地+サプリメントミックス)売り手によると
一次ヒト表皮ケラチノサイト;ノーマル、アダルト(HEKa)Dermal Cell Basal Medium、0.4% ウシ下垂体抽出物、0.5 ng/mL rh-トランスフォーミング成長因子-α、6 mM L-グルタミン、100 ng/mLヒドロコルチゾンヘミスコハク酸、5 mg/mL rh-インスリン、1 mM エピネフリン、5 mg/mL アポトランスフェリン、100 U/mL ペニシリン(必要な場合)、100 μg/mL ストレプトマイシン(必要な場合)売り手によると
初代ケラチノサイトDMEM/F-12 (3:1)、1% Ultroser G、1 μM ヒドロコルチゾン、1 μM イソプロテレノール、0.1 μM インスリン、1 ng/mL ケラチノサイト成長因子、1% ペニシリン-ストレプトマイシン18
メラノサイト初代メラノサイトミディアム 254、PMA フリーのヒト メラノサイト成長サプリメント-2、1% 抗生物質溶液19
初代メラノサイトRPMI-1640、10% FBS、14.7 μg/mL フェノールレッド溶液、1% L-グルタミン、1% ペニシリン/ストレプトマイシン27
HEMa-LP細胞株中程度 254、5 μg/mL rh-インスリン、50 μg/mL アスコルビン酸、6 mM L-グルタミン、1 μM エピネフリン、1.5 mM 塩化カルシウム、100 U/mL ペニシリン (必要な場合)、100 μg/mL ストレプトマイシン (必要な場合)売り手によると
一次正常ヒト表皮メラノサイト(NHEM)メラノサイト増殖培地(基礎培地+サプリメントミックス)売り手によると
線維芽細胞一次ヒトほぞ線維芽細胞(HTF)EMEM、5% FBS、5 ng/mL rh-塩基性線維芽細胞増殖因子、5 μg/mL rh-インスリン、50 μg/mL アスコルビン酸、7 mM L-グルタミン、100 U/mL ペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシン、0.25 μg/mL アムホテリシン B28
プライマリ HTF、およびDMEM、10% FBS、100 U/mL ペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシン、0.25 μg/mL アムホテリシン B20.28
一次ヒト真皮線維芽細胞
HFF-1細胞株DMEM、15% FBS、100 U/mL ペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシン売り手によると
BJ細胞株EMEM、10% FBS、100 U/mL ペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシン売り手によると
肥満細胞初代ヒト皮膚肥満細胞(hsMC)IMDM、10% FBS、1% 非必須アミノ酸、226 μM α-モノチオグリセロール、100 U/mL ペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシン20
LAD2細胞株StemPro-34、2.5% StemPro-34 栄養補助食品、2 mM L-グルタミン、100 ng/mL rh-幹細胞因子、100 U/mL ペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシン29
HMC-1.1 および 1.2 細胞株IMDM、10% FBS、2 mM L-グルタミン、25 mM HEPES、100 U/mL ペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシン29

表8:初代皮膚細胞および細胞株の培養に最も使用されている培地の概要。
凡例:ダルベッコの最小エッセンシャルミディアム(DMEM)、イーグルの最小エッセンシャルミディアム(EMEM)、ウシ胎児血清(FBS)、栄養混合物ハムのF-12(F12)、イスコーブの修正ダルベッコ培地(IMDM)、組換えヒト(rh)、ロズウェルパークメモリアルインスティテュート(RPMI)。

この記事では、ケラチノサイト、メラノサイト、線維芽細胞、および肥満細胞の初代細胞を使用して皮膚モデルを作成しました。これらの培地は細胞株よりもわずかに要求が厳しく、シングルセル培養に使用された彼らの培養に推奨される培地は、補充されたケラチノサイト増殖培地2(ケラチノサイト用)、補充された培地254(メラノサイト用)、補充されたDMEM培地(線維芽細胞用)、および補充されたIMDM培地(肥満細胞用)です。これらの培地では、細胞はそのタイプに割り当てられた典型的な形態を示します(代表的な画像を 図8に示します)。2種類以上の細胞型の多重培養の場合、すべての培養細胞型が増殖できる培地を選択することが重要でした。数回のテストの後、10% FBS と 1% の抗生物質混合物を含む DMEM 培地を選択し、球体と同等物のより高度な 3D モデルを調製しました。

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図8:皮膚細胞は、2Dモノカルチャー中に観察された異なる形態を示します。 スケールバー:100μmこの 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

球体(一般にスフェロイドと呼ばれる)は、細胞および組織工学の研究者によって開発された最も単純な3Dモデルの1つですが、皮膚細胞から作成された球体はそれほど人気がありません。このモデル内では、単一文化と多文化の両方の球体の作成が可能です。球体調製のための複数の方法(例えば、吊り下げ滴を用いる、細胞接着を制限する、磁気浮上、回転、マイクロ流体工学など)が文献30に記載されている。調製の容易さ、低コスト、容易に入手できる材料と機器により、最初の2つの方法は3次元(3D)細胞モデルの初心者に推奨され、その性能に関するプロトコルは上記(ステップ2.1および2.2)にあります。文献31,32によると、これらの方法で最も重要なパラメータは、細胞数、細胞懸濁液の量、およびインキュベーション時間です。

球体は異なる数の細胞で作製できますが、播種用の細胞密度は、細胞共培養だけでなく、細胞タイプごとに個別に最適化する必要があります。ケラチノサイトと線維芽細胞の単一培養に対して実施した最適化プロセスにより、ウェルごとに1 x 104 細胞を播種すると、両方の細胞タイプに最良の結果が得られることが明らかになりました。 図9 に示す球体は、U底プレート内の細胞接着を制限する方法(ステップ2.2)を使用して調製しました。技術的な繰り返しで少なくとも4つのウェルを準備することをお勧めします(最適は6ウェルです)。1 x 104 個の細胞からなる球体は、ウェルで見えるため、操作が容易でした。その結果、アッセイ中に球体を排出することなく、古い培地をウェルから取り除くことさえ可能でした。説明された操作の後、球体の形状はほとんど変化せず、再現性がありました。プロセス中、大きな球体の安定性は低かった。また、異なる細胞タイプが異なる色の球体を形成する可能性があることにも言及する価値があります(たとえば、 ケラチノサイトはより暗い球体を形成しますが、線維芽細胞球は著しく明るい)。

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図9:球体の作成。 制限細胞接着法を使用して、さまざまな種類と数の皮膚細胞によって作成された球体。スケールバー(トップパネル):200μm。スケールバー(下部パネル):100μmこの 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

吊り下げ方法(ステップ2.1)で述べたように、ある時点で球体を蓋からウェルに移す必要があります。このプロセスは、球体に損傷を与える可能性があります。したがって、このステップでは、作業の精度が高くなります。作成された球体は、慎重に取り扱わないと、適切な形状を失う傾向があります(図10)。最初の画像(図10A)は、すべての辺が均等に丸みを帯びた良好な球体を示しています。2番目と3番目の画像(図10B、C)では、球体による形状の緩やかな損失が観察されましたが、細胞凝集体は丸みを帯びたままです。最後の 3 つの画像 (図 10D-F) は、球体の損傷のさまざまなフェーズを示しています。作成した球体の形状や構造の再現性を得るためには、経験を積む必要があります。球体を開発する最初の試みでは、経験の浅い研究者のために細胞接着を制限する方法(ステップ2.2)を使用することをお勧めします。これは、研究者の活動の影響が限定的でより比較可能な結果を提供するためです。

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図10:蓋から井戸への球体の移動に起こりうる困難 - 吊り下げ式 (A)良好な球体、(B,C)わずかに損傷した球体、(D-F)高度に損傷した球体。画像は転送から24時間後に撮影されました。スケールバー:200μmこの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

同等のものは、球体よりもはるかに高度な人工皮膚の3Dモデルです。皮膚モデルの構築過程では、モデル内の層数(表皮のみ、真皮のみ、表皮と角質層を持つ真皮)、使用される細胞の種類、適用材料、同等の望ましいサイズ、それがさらに使用される研究の種類など、さまざまな側面を考慮する必要があります14。スキン同等物は、所望のサイズ(96ウェル、48ウェル、24ウェルなど)の標準的なマルチウェルプレートに配置された特別なインサートに配置できます。インサートは、あるウェルから別のウェルへの移し替えや培地交換の際に容易ですが、同等品を損傷することはありません。彼らはかなり高価です。モデルが角質層の存在を必要としない場合、より安価な解決策は、マルチウェルプレートのウェルに同等のものを調製することです。

人工真皮層は、典型的には、天然(ゼラチン、コラーゲン、フィブリン、ヒアルロン酸、キトサン-アルギン酸など)または合成(ポリエチレングリコールジアクリレートおよびポリ乳酸)ハイドロゲル33を使用して、足場ベースのモデルとして構築される。実際の皮膚の真皮に類似するためには、この層は、細胞結合、細胞間相互作用、および他の細胞作用を媒介するいくつかの細胞外マトリックス(ECM)成分(コラーゲンまたはフィブロネクチンを含む)を含む主に水を含んでいなければならない34。本研究では、I型コラーゲンはハイドロゲルの形で調製が容易で、その柔軟な構造により、さらなる研究活動(例えば、ある皿から別の皿への等価物の移し替え)が容易であるため、I型コラーゲンを選択した。ラットテールから得られるI型コラーゲンの溶液は、通常、20mM酢酸に粉末溶解して調製します。コラーゲン重合ステップを達成するためには、6.5〜7.5の範囲の適切なpH条件を提供する必要があります。これは、厳密な量の水酸化ナトリウムを添加することで保証できます。手軽さのために、一部の企業は特定の計算を導入しており、これはそのようなハイドロゲルの調製に必要な正確な量を決定するのに役立つ場合があります(表6)。文献では、ハイドロゲル中のコラーゲンの濃度が異なることがありますが(例えば、0.5-2 mg/mL35;5-30 mg/mL36;低コラーゲン含有量と高コラーゲン含有量37)、記載されたモデルでは、ハイドロゲルがまだ柔軟な構造を持っていたため、2 mg/mL溶液が使用されましたが、必要に応じてウェルから移動できるほどコンパクトでした。

非常に現実的な全層の皮膚を準備するには、同等の細胞を、おそらく私たちの体に存在するこの比率に近い割合で播種する必要があります。表皮の場合、体の部位にもよりますが、メラノサイトと関連するケラチノサイトのプールとの関係は約1:36の比率であり、これは表皮メラニンユニット(EMU)38として定義されます。したがって、人工表皮に適用された割合は、15個のケラチノサイトに対して1個のメラノサイトでした(表5)。人工真皮層を作製するために、線維芽細胞と肥満細胞を線維芽細胞10個に対して肥満細胞1個の割合で組み込んだコラーゲン1型ハイドロゲルを用いた。構成された等価物の各層は、観察された試料の深さを変更することにより、倒立光学顕微鏡上でリアルタイムに監視することが可能です(例示的な画像を 図11に示します)。

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図11:明視野顕微鏡で可視化された、(A)偽真皮および(B)偽表皮)に形成された全層皮膚相当物の特定の層における異なる細胞のリアルタイム観察。スケールバー:50μmこの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

モデルの意図された構造を得ることの確認を伴うより正確な観察は、同等の染色を行うことによって行うことができる。固定等価物は、最初にパラフィンに包埋し、次にミクロトームにカットする必要があります。薄い人工組織を含むスライドは、後でヘマトキシリンやエオシンなどのさまざまな色素で染色できます(医療検査室で行われる基本的な染色)。この作用により、人工真皮と表皮を同等物で区別したり、個々の皮膚細胞を同定したりすることが可能になります(図12)。図12では、特定の細胞タイプが示されているだけでなく、細胞分裂プロセスの異なる段階(終期および中期)のケラチノサイトを見ることも可能である。肥満細胞の場合、特定の顆粒は細胞内でよく認識できます。これらの画像は、最初に、作成された皮膚同等物が生きていること(細胞がその中で成長していること)と、開発されたモデルで正常に機能できることを確認します。ただし、皮膚の3D表皮モデルと全層モデルでは、得られたコンストラクトの品質と機能を確認することが特に重要です。角質層の透過性を確認するには、経上皮電気抵抗(TEER)測定またはLucifer-Yellow染色を適用する必要があります39,40。さらに、適切に構成された人工皮膚には、分化マーカー(例えば、フィラグリン、インボルクリン、ロリクリン、ケラチン10、ケラチン5、セラミドを含む脂質クラス)、真皮-表皮接合マーカー(例えば、IV型コラーゲン、ラミニンV、アルファ6ベータ4-インテグリン、BP抗原)41、表皮層のタイトジャンクションマーカー(例えば、クローディン-1、オクルージン、ゾヌラオクルーデンスタンパク質(ZO)-1)42基底層増殖マーカー(Ki67)41。

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図12:皮膚細胞の形態と機能。 ヘマトキシリンとエオシンで染色した全層皮膚当量における皮膚細胞の形態と機能(細胞分裂の観察)の概要。スケールバー:100μm(トップパネル)、50μm(中央パネル、左)、100μm(中央パネル、右)、50μm(ボトムパネル)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

バイオマーカーの存在を確認するために最も頻繁に使用される方法は、免疫組織化学や免疫蛍光などの特異的染色を行うことです。モデル内の特定の細胞を顕微鏡で可視化するために、さまざまな抗体や蛍光色素を適用することができます。培養中の細胞の例示的な染色の結果は、 図13に見ることができる。ケラチノサイトを観察するために、サイトケラチン14に対する抗体を使用しました。メラノサイトの場合、それはメランA特異的抗体でした。コラーゲン1A2抗体を使用して線維芽細胞を染色し、アビジンと結合した蛍光スルフォロダミン101は肥満細胞に存在するヘパリンを検出しました。

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図13:蛍光細胞染色の結果(A)ケラチノサイト中のサイトケラチン14。スケールバー:50μm.(B)メラノサイト中のMelan-A。スケールバー:50μm.(C)線維芽細胞中のコラーゲン1A2。スケールバー:100μm.(D)肥満細胞中のヘパリン。スケールバー:10μmこの図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

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この記事では、独自の高度な人工皮膚モデルを準備するために適用できる方法論を紹介します。これは、計画された研究が厳密に定義された研究モデルを必要とする場合、市場で入手できなかったり、非常に高価であることが判明したりする場合に適したソリューションです。前述のように、いくつかの市販の皮膚同等物が市場で入手できます(例: EpiSkin、EpiDerm FT)。しかし、そのコスト(1個あたり100ユーロから400ユーロ)と納期(数日から数週間)は、研究者が自分でそのようなモデルを準備しようとすることを奨励するかもしれません。提案された手順は、経験の浅い科学者でも簡単に実行できると同時に、非常に高度な皮膚モデルを取得することができます。特定のモデルの細胞組成に関する決定は、研究者に完全に依存していることを強調する価値があります。作成されたモデルとは別に、さらに開発および改善することができ、まったく新しい研究の視点が開かれます。市販モデルの場合は、別の同等品を購入する必要があります。

3D細胞培養は、複数の細胞タイプで進行し、取り扱いが容易でアクセスしやすいかもしれませんが、それらはまだ人工的なモデルに過ぎず、組織の複雑さと機能(免疫機能、血管新生など)を完全に再現することはできません。そのため、ほとんどの研究では、得られた結果を確認するためにいくつかのモデルが必要です。これらのモデルのいくつかの長所と短所、およびそれらの制限を 表9にまとめました。一方、商用モデルは、実験の再現性とラボ間のデータの比較可能性を備えた高い定性基準を保証します。新しい化合物を研究に使用するためには、適切な市販の同等物を購入する必要があります。しかし、準備段階では、このような自作の皮膚の3Dモデル(マルチセルタイプの球体または同等のもの)は、市販の同等物に対して実施する必要がある実験の数を減らすのに役立ちます。記載されているモデルを作成および使用する目標は、認定された研究モデルを適用する必要性を回避することではなく、研究を促進し、関連費用を削減することです。

モデルのペアの比較利点欠点
細胞培養 vs. 動物動物の苦しみを最小限に抑えたテストされた因子が全身に及ぼす影響に関する限られた情報
実験の標準化性が高い - 結果の再現性が向上単一のモデルでは、体内で発生するプロセスを反映するには不十分です
生物全体に対する副作用はありません-
実験の条件をより適切に制御-
自動化の可能性(バイオプリンティングなど)-
コストの削減-
必要なサンプルの小さなサイズ-
発生する廃棄物の量が限られている-
3D培養と2D培養完全な生物をよりよく反映する時間のかかる文化
機能的な組織を作成する可能性コストの高騰
実施される研究のニーズに合わせたモデルを作成する可能性3D構造の自発的な形成はほとんど不可能です
-さまざまな化合物の影響を定量化するための標準化されたテストの欠如
-市場に出回っているさまざまな3Dカルチャーへのアクセスが限られている
細胞株 vs. 初代細胞認定および承認されたモデル限られた数の細胞株のみが利用可能です
実験の標準化性が高い - 結果の再現性が向上同じドナーから数種類の細胞を採取する可能性が限られている
より長い寿命ネイティブセルから変更されたプロパティを持っている可能性があります
かなり速い増殖速度細胞の機能が頻繁に乱される
いくつかの活動(凍結、遠心分離など)に対する感度が低い-

表9:研究におけるさまざまなモデルの使用の比較-長所と短所

いくつかの記事は、3Dスキンモデルを準備する方法を説明しています(市販のモデル14、43、44を要約したレビュー記事は別として、それらは通常、球体45 または同等のもの46を得るための単一の方法論に焦点を当てています)。

この記事では、皮膚細胞による球体形成について2つの方法論について説明しました。吊り下げ式は広く用いられていますが、その再現性や安定性が不十分な場合もあります。ほとんどのステップでは、移送中に液滴から水が蒸発するため、高速作業を行うなど、特定のアクションが必要です。穏やかな動きも推奨されます、そのようなスキルの欠如は細胞凝集体の損傷を引き起こす可能性があるためです31,32。したがって、球体調製のより簡単な方法は、細胞接着を制限することに焦点を当てています。細胞接着に適した表面がないと、細胞間の相互作用が高くなります。その結果、セル凝集体が生成されます。球体転送の必要がないため、その再現性ははるかに高くなります。これらの方法により、球体を作るのに最適な皮膚細胞の数は、1 x 104細胞/球体に確立されました。

次に、皮膚同等物の調製について説明する手順が示されました。研究におけるそれらの外観と機能は、細胞(表2)、足場、培地など、それらが構成される要素に強く依存する可能性があります。人工皮膚の調製に使用される3D足場は、合成ヒドロゲルと天然源から形成されたものに分けることができます。ヒドロゲルを構成するために使用される材料とその特性によっては、培地を追加で補充する必要が生じる場合があります。合成ハイドロゲルは、特定の細胞機能を媒介するために、生物活性分子(タンパク質、酵素、および成長因子)を合成ハイドロゲルネットワークに組み込む必要がある47。ハイドロゲルへの成長因子の制御された送達を達成するための文献で提示された主なアプローチには、直接ローディング、静電相互作用、共有結合、およびキャリアの使用が含まれる48。ECMタンパク質やポリマーなどの天然源から形成されたハイドロゲルは、3D足場全体に流体経路を生成し、栄養素の分布を加速します。したがって、培地の追加補給の必要はありません。研究により、低分子(サイトカインや成長因子など)と高分子(グリコサミノグリカンやプロテオグリカンを含む)は、拡散によってECMを介して輸送できることが示されています47。しかし、酸素、栄養素、その他の生理活性分子の分子拡散は、ECMハイドロゲル自体の特性によって妨げられる可能性があります。拡散率が低いことは、ヒドロゲルの厚さが高いことだけでなく、コラーゲンの濃度が非常に高いこととも相関していました37。この研究では、皮膚同等物を作成するために、2 mg / mLに等しい低コラーゲン濃度が使用されました。これは、ハイドロゲルを介した分子拡散が良好で迅速であるべきであることを示唆しています。したがって、この段階では、培地への追加の補充もハイドロゲル自体への添加も提供されませんでした。真皮を模倣するために、肥満細胞と線維芽細胞(1:10)をコラーゲンハイドロゲルに埋め込みました。次に、メラノサイトとケラチノサイト(1:15)をハイドロゲルに播種し、全当量を培地で培養しました。特筆すべきは、塩基性培地はいくつかのアミノ酸、無機酸、ビタミンで構成されており、さらに血清(細胞、脂質、ホルモン、栄養素、エネルギー源、キャリア、結合および移動タンパク質などの成長因子および付着因子からなる)が補充されていることです。表皮の適切な構造を達成するために、培地に異なるサプリメントを特定の時間に追加する必要があります。表皮の分化を開始するための最も重要な刺激因子は、細胞内シグナル伝達を活性化するカルシウムです。アスコルビン酸は、カルシウムによって媒介されるものと同様のシグナル伝達経路を刺激するが、その効果はアスコルビン酸の輸送の増強と親水性抗酸化物質の枯渇の防止も伴う41。さらに、他の成分(カフェイン、ヒドロコルチゾン、トリヨードチロニン、アデニン、コレラ毒素など)を培地に添加すると、細胞の分化が改善された41,44。準備したモデルは、適切な層に特定の細胞タイプが存在するかどうかを常にチェックすることが重要です。H&E染色により、作製した同等物の構造に4種類の皮膚細胞すべてが存在することを確認しました。

遭遇する最も一般的な問題は、取得したモデルの取り扱いにおける繊細さと直感です。いくつかの困難は、細胞球の形成およびヒドロゲル調製に関連している可能性があります。細胞培養中に、他のいくつかの問題も発生する可能性があります。これには、微生物感染、細胞の低増殖率、モデルに使用した初代細胞の老化、初代細胞と細胞株から再構築された2Dおよび3Dモデルの最大培養時間などが含まれます。 表10では、次のいずれかの問題が発生した場合の対処方法について、いくつかの実践的なアドバイスが集められています。

細胞培養における一般的な問題提案
微生物感染細胞を含むフラスコ/ディッシュの1つで微生物感染が発生した場合は、感染した培養物をできるだけ早く取り除くことをお勧めします(残りのフラスコ/ディッシュを細胞で汚染しないようにするため)。新しいバイアルを細胞で再凍結します。 感染が再発した場合は、適用された抗生物質のスペクトルを広げて、それらの濃度を上げるように試みるのが良いでしょう。
細胞の増殖率が低い一部の細胞は倍加時間が長いです。それらの増殖を刺激するために、いくつかの細胞特異的成長因子を塩基性培地に添加することができます。また、基礎培地中のFBSまたはL-グルタミンの濃度を上げると、細胞の成長を刺激するのに役立つ可能性があります。
モデルに使用した初代細胞の老化数回の継代の後、初代細胞は老化に入り、分裂を停止します。モデルでこの問題を解決するには、できるだけ早い時期に継代したセルを使用してモデルを構築することをお勧めします。
初代細胞と細胞株から再構築された2Dおよび3Dモデルの最大培養時間モデルの培養時間は、使用する細胞の種類に大きく依存します。初代細胞では、寿命が短いため、培養時間が短くなります。
細胞球形成の難しさ一部の細胞は、球体の形成に長い時間を必要とする場合があります。さらに数日経っても球体が形成されない場合は、サンプルから細胞を採取し、例えばトリパンブルー染色で生存率を確認します。
球体の安定性の問題球体が安定しておらず、取り扱い中に破壊される場合は、より少ない数のセルから球体を作成してみてください。球体が成長している皿は常にそっと移すようにしてください。
ハイドロゲル調製の問題成分(水、PBS[10x]、NaOH、コラーゲン1型)の割合が正しいか確認してください。コラーゲンの原液は通常、非常に密度が高いため、ゆっくりとピペッティングするようにしてください。気泡はハイドロゲルの形態を乱すため、ゲルのリバースピペッティングがこの問題を解決するのに役立つ場合があります。

表10:細胞培養のトラブルシューティング

(1)医薬品や化粧品に利用するための生物活性を有する新規化合物の細胞毒性・遺伝毒性実験49、(2)種々の因子刺激実験50、(3)皮膚細胞、その生体機能、他の細胞や環境との相互作用に関する知識を深める基礎研究51、52、(4)特定の種類の細胞を作成されたモデルに導入できる選択された疾患実体に関する研究(癌細胞、特定の遺伝子に変異を持つ細胞など14,53)など。言うまでもなく、これらのモデルの適用は、製品試験や科学研究における動物のより倫理的な使用のための3Rの原則と一致しており、化粧品の動物試験の禁止法に違反していないことは言うまでもありません。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、ワルシャワ工科大学が「Excellence Initiative - Research University」プログラムから、POB BIB BIOTECHMED-2 start(no. 1820/2/ZO1/POB4/2021)と学長の学生研究グループ助成金(SKIN-ART, no. 1820/116/Z16/2021)の2つの助成金の形で財政支援を提供してくれたことに感謝しています。さらに、著者らは、ワルシャワ工科大学化学科のJoanna Cieśla教授とDrug and Cosmetics BiotechnologyのChair、およびBiotechnology Science Club 'Herbion'から受けた支援に感謝したいと思います。特に、コンパウンドPluronic F-127を提供してくださったMichał Stepulak博士に感謝します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
接着細胞培養用24ウェルプレートBiologix Europe GmbH07-6024-35
%–38% HCLChempur115752837-60
mm 細胞培養ペトリ皿 ネスト705001-
アビディン&マイナス;スルフォロダミン 101Sigma AldrichA2348-5MG-
明視野倒立顕微鏡オリンパスCKX41-
塩化カルシウムAvantor874870116-
細胞接着細胞用培養フラスコ T75ジェノプラストG77080033
-遠心チューブ 15 mLGoogLab ScientificG66010522-CO2
インキュベーターヒールフォースギャラクシー170R-Col1A2
抗体NovusNBP2-92790-Corning
(R) Transwell(R) ポリカーボネートコーニングCLS3422-48EA-Cytokeratin
14抗体 マウスで産生NovusNBP1-79069-DPX
組織学用マウンタントSigma Aldrich06522-100ML-
ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム(DMEM)VWRケミカルズL0102-500-Eosine
YKolchem-0.5%水溶液
エッペンドルフチューブ1.5mLルスタット72.690.001-
エッペンドルフチューブ2mLスタット72.691-
エチルアルコール絶対99.8%アバントール396480111超純水で必要に希釈濃度 
ウシ胎児血清Gibco10270106-
蛍光倒立顕微鏡 オリンパスIX71-
ヤギ抗マウス二次抗体 FITCSigma AldrichF0257-1mL
ギ抗ウサギ二次抗体 FITCNovusNB7159-Harris
HematoxylinKolchem-1mg/mL 95% エタノール
Hoechst 33342ThermoFisherH3570-Laminar
チャンバーHeal ForceHFSafe-1200-Melan-A
抗体 マウスで産生Santa Cruz Biotechnologysc-20032-Microtome
MicromHM355S-NaOH
 アバントール810981997
-パラフィントローチシグマ アルドリッチ1.07164-
パラホルムアルデヒドシグマ アルドリッチ1581227-
ペニシリン/ストレプトマイシン溶液シグマ アルドリッチP4333-
ピペット チップ、1000 & マイクロ;LSarstedt70.305-
ピペットチップ、20 & マイクロ;LSarstedt70.3021-
ピペットチップ、200 & マイクロ;LSarstedt70.303-Pluronic
F-127BASF50401036
-血清学的ピペット 10 mLGoogLab ScientificG33270011
-血清学的ピペット 25 mLGoogLab ScientificG33280011
-血清学的ピペット 5 mLGoogLab ScientificG33260011-
重炭酸ナトリウムSigmaAldrichS5761-
重炭酸ナトリウムChempur118105307
トリプシン-EDTA 0.25% 溶液、フェノールレッドSigma Aldrich25200072-Type
1 コラーゲンIBIDI50201-U-bottom
96-well plateSarstedt83.3925500-
キシレンSigma Aldrich534056-
ウサギで産生されたされた ザサル ヤ で結合

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