このプロトコルは膵臓のβ細胞のmitophagyの量的な分析のための2つの方法を輪郭を描く: 最初に、細胞透過性のミトコンドリア特定の染料の組合せ、および二番目に、遺伝的にコードされたmitophagyのレポーター。これら2つの手法は補完的であり、特定のニーズに基づいて展開できるため、ミトコンドリアの品質管理に定量的に取り組む際の柔軟性と精度を高めることができます。
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この記事について
サマリー
要約
マイトファジーは、最適なミトコンドリア機能を維持するために必要な品質管理メカニズムです。機能不全のβ細胞マイトファジーは、不十分なインスリン放出をもたらします。マイトファジーの高度な定量的評価には、多くの場合、遺伝子レポーターの使用が必要です。ミトコンドリアを標的としたpH感受性二重励起レシオメトリックプローブを発現し、フローサイトメトリーでマイトファジーを定量化するmt-Keimaマウスモデルは、β細胞で最適化されています。酸性と中性のmt-Keima波長の放射の比率は、マイトファジーを頑健に定量化するために使用できます。しかし、複雑な遺伝子マウスモデルや、初代ヒト膵島などのトランスフェクションが困難な細胞を扱う場合、遺伝的マイトファジーレポーターの使用は困難な場合があります。このプロトコルはMtPhagyを使用して第一次膵島のβ細胞mitophagyを定量化する新しい補足の染料ベースの方法を記述する。MtPhagyは、ミトコンドリアに蓄積し、ミトコンドリアが低pH環境にあるとき(マイトファジー中のリソソームなど)に蛍光強度を増加させる、pH感受性の細胞透過性色素です。MtPhagy 色素を、β細胞を選択する Zn2+ インジケーターであるフルオジン-3-AM、およびミトコンドリア膜電位を評価するためのテトラメチルローダミン、エチルエステル(TMRE)と組み合わせることで、フローサイトメトリーを介してβ細胞内のマイトファジーフラックスを特異的に定量できます。これら2つのアプローチは高度に補完的であり、多数のβ細胞モデルにおけるミトコンドリアの品質管理の評価において柔軟性と精度を可能にします。
概要
膵臓のβ細胞は、代謝要求を満たすためにインスリンを産生および分泌し、β細胞機能障害は、1型糖尿病と2型糖尿病の両方で高血糖と糖尿病発症の原因となります。β細胞は、ミトコンドリアのエネルギーと代謝出力を介してグルコース代謝とインスリン分泌を結合し、機能的なミトコンドリア質量の予備力に依存します1,2,3。最適なβ細胞機能を維持するために、β細胞はミトコンドリアの品質管理メカニズムに依存して、老化または損傷したミトコンドリアを除去し、機能的なミトコンドリア質量を維持します4。選択的ミトコンドリアオートファジーは、マイトファジーとも呼ばれ、ミトコンドリア品質管理経路の重要な要素です。
生細胞におけるマイトファジーの評価は、マイトファジー中に起こるミトコンドリアpHの変化に依存することがよくあります。ミトコンドリアのpHはわずかにアルカリ性で、健康なミトコンドリアは通常、pH中性のサイトゾルに存在します。マイトファジーの間、損傷または機能不全のミトコンドリアは選択的にオートファゴソームに取り込まれ、最終的に酸性リソソーム内で除去されます5。mt-Keima6....
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プロトコル
このプロトコルで提示された動物実験は、ミシガン大学の施設的動物管理および使用委員会によってレビューおよび承認されました。この研究には、15週間の通常の脂肪食(RFD)または高脂肪食(HFD)のいずれかを摂取した20週齢の雄のC57BL / 6Jマウスを使用しました。
1. 色素ベースのMtPhagyアプローチによるマイトファジーの評価(方法1)
- マウス膵島の準備と治療
- 以下の手順に従って、膵島培養とバリノマイシン曝露を行います。
- 前述の方法に従って、通常の脂肪食(RFD)または高脂肪食(HFD、60 kcal%脂肪19)マウスのいずれかから膵島を分離します2,10。
- 100ユニット/mLの抗真菌性抗生物質、50ユニット/mLのペニシリン-ストレプトマイシン、1 mMピルビン酸ナトリウム、10 mMのHEPES、および10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したRPMI培地中で、37°Cで一晩培養した膵島サンプルを採取します( 資料表を参照)。この培地を「膵島培地」と呼ぶことにする。
- ピペットを使用して、条件ごとに100個の膵島を、2 mLの膵島培地中の6cm....
- 以下の手順に従って、膵島培養とバリノマイシン曝露を行います。
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結果
色素ベースのMtPhagyアプローチによるマイトファジーの評価
この色素ベースのアプローチは、Fluozin-3-AM、TMRE、MtPhagy、およびDAPIを使用して死細胞を除外し、遺伝子レポーターを必要とせずに初代マウスβ細胞内のマイトファジーフラックスを分析するように最適化されました。マイトファジーを誘導するためにこれらの染料をバリノマイシンと組み合わせることにより、このプロトコルは、一次マウスβ細胞18のマイトファジーフラックスを選択的に測定する染料ベースの方法を概説します。このMtPhagy法を用いて示したデータでは、通常の脂肪食(RFD)または高脂肪食(HFD、60 kcal%脂肪)を給餌したマウスから単離した膵島において、基礎マイトファジーとバリノマイシン誘発性マイトファジーの両方を分析し、マイトファジーフラックスに対する代謝ストレスの影響を評価しました。目的の集団を同定するために、未処理のRFD膵島を用いて細胞をゲーティングした。FSCとSSCの電圧は、まず、SSC-A対FSC-Aのプロットでセルが均等に分布するよ.......
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ディスカッション
このプロトコルは、分離された一次マウス膵島のマイトファジーフラックスを定量化する2つの補完的な方法を説明しました。mt-Keima法では、マイトファジーの増加は酸性(561 nm)/中性(405 nm)細胞の比率の増加として定量化され、MtPhagy法では、マイトファジーフラックスの増加は、フルオジン高MtPhagy高TMRE低細胞集団の増加として定量化されました。これらの方法により、マイトファジーフラックスの迅速、定量的、およびβ細胞特異的な評価が可能になります。
どちらの方法も簡単なアプローチです。ただし、このプロトコル内の特定のステップは、品質と再現性のある結果を得るために重要です。これらのステップには、(1)単一細胞懸濁液を得るための適切な膵島解離、ただし膵島生存率を確保するのに十分なほど穏やかであること、(2)目的の集団を正しく同定するためのゲートの慎重な確立、および(3)マイトファジーフラックスの偏りのない評価を確実にするためのソフトウェアツールによるフローサイトメトリーデータの客観的な定量化が含まれます.......
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開示事項
SASは、小野薬品工業株式会社から助成金を受けており、ノボノルディスクのコンサルタントを務めています。
謝辞
E.L-D.さんNIH(T32-AI007413およびT32-AG000114)からの支援を認める。SASは、JDRF(COE-2019-861)、NIH(R01 DK135268、R01 DK108921、R01 DK135032、R01 DK136547、U01 DK127747)、退役軍人省(I01 BX004444)、Brehmファミリー、Anthonyファミリーからの支援に感謝しています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | Thermofisher Scientific | A24858 | |
| ジメチルスルホキシ | ド Sigma-Aldrich | 317275 | |
| 脂肪酸 フリー ヒートショック BSA 粉末 | Equitech | BAH66 | |
| ウシ胎児血清 | Gemini Bio | 900-108 | |
| フルオジン-3AM | サーモフィッシャーサイエンティフィック | F24195 | 100 Μg Fluozin-3AM粉末を51 μL DMSO および 51 μL プルロニック F-127 が 1 mM ストックに達する。 |
| ギブコ RPMI 1640 ミディア | フィッシャー サイエンティフィ | 11-875-093 | |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MtPhagy 染料 | 同人堂 | MT02-10 | 5 μg MtPhagy粉末を50 μL DMSO が 100 μ に達するM株 |
| MtPhagy dye | Dojindo | MT02-10 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140-122 | 1x ddH2O リン酸緩衝生理食塩水で 1:10 を希釈することによりプロコトールに使用される 1x 溶液 |
| 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 1x 溶液を ddH2O |
| ピルビン酸ナトリウム (100x) | Life で 1:10 希釈することにより、プロコトールに使用されます。テクノロジー | 11360-070 | 5 μg MtPhagy粉末を50 μL DMSO が 100 μ に達するM株 |
| TMRE [テトラメチルローダミン、エチルエステル、過塩素酸塩] | Anaspec | AS-88061 | TMRE粉末をDMSOで再構成して100 μM株。 |
| トリプシン-EDTA(0.05%)、フェノールレッド | サーモフィッシャーサイエンティフィ | 25300054 | |
| バリノマイシン | シグマ | V0627 | バリノマイシン粉末をDMSOに再溶解して250nMストックに到達しました。 |
参考文献
- Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. 42, 91-104 (2015).
- Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility ge....
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再版と許可
