膵β細胞におけるマイトファジーフラックスを調べるための補完的アプローチ

膵臓のβ細胞は、代謝要求を満たすためにインスリンを産生および分泌し、β細胞機能障害は、1型糖尿病と2型糖尿病の両方で高血糖と糖尿病発症の原因となります。β細胞は、ミトコンドリアのエネルギーと代謝出力を介してグルコース代謝とインスリン分泌を結合し、機能的なミトコンドリア質量^の予備力に依存します^1,2,3。最適なβ細胞機能を維持するために、β細胞はミトコンドリアの品質管理メカニズムに依存して、老化または損傷したミトコンド^{リアを除去}し、機能的なミトコンドリア質量を維持します4。選択的ミトコンドリアオートファジーは、マイトファジーとも呼ばれ、ミトコンドリア品質管理経路の重要な要素です。

生細胞におけるマイトファジーの評価は、マイトファジー中に起こるミトコンドリアpHの変化に依存することがよくあります。ミトコンドリアのpHはわずかにアルカリ性で、健康なミトコンドリアは通常、pH中性のサイトゾルに存在します。マイトファジーの間、損傷または機能不全のミトコンドリアは選択的にオートファゴソームに取り込まれ、最終的に酸性リソソーム内で除去^{されます5。}mt-Keima⁶、mitoQC⁷、CMMR⁸などのいくつかのin vivoトランスジェニックマイトファジーレポーターマウスモデル、およびCox8-EGFP-mCherryプラスミド⁹などのトランスフェクタブルマイトファジープローブは、このpH変化を利用してマイトファジーの定量的評価を提供します。mt-Keima pH感受性二重励起レシオメトリックプローブを発現するトランスジェニックマウスの使用は、フローサイトメトリーによる膵島およびβ細胞のマイトファジー評価に最適化されています^10,11。酸性から中性へのmt-Keima波長発光の比(561 nmの酸性励起と480 nmの励起に対する酸性の割合)は、マイト^{ファジー6,12}の頑健な定量化に用いることができる。

このプロトコルはmtKeimaのtransgenicマウス^10,11から隔離される第一次膵島およびβセルのmitophagyの流束を査定するために最大限に活用されたアプローチを記述する。mt-Keimaは高感度プローブですが、複雑な動物育種スキームや細胞のトランスフェクションが必要であり、他の遺伝子モデルや初代ヒト膵島と組み合わせて作業する場合、困難な場合があります。さらに、中性細胞集団と酸性細胞集団を同定するために複数の蛍光レーザーと検出器を使用することで、他の蛍光レポーターのコンビナトリアル使用を制限することができます。

これらの課題を克服するために、このプロトコルでは、孤立したマウス膵島からのβ細胞のマイトファジーを強力に検出するための補完的な単一の蛍光チャネル、色素ベースの方法も説明します。MtPhagy法と呼ばれるこのアプローチは、3つの細胞透過性色素の組み合わせを利用して、β細胞を選択し、マイトファジーを活発に受けている細胞集団を定量し、ミトコンドリア膜電位(MMPまたはΔψm)を同時に評価します。

これらの色素の最初のものは、Ex/Em 494/516 nm¹³を有する細胞透過性Zn²⁺指示薬であるFluozin-3-AMです。マウス膵島は、α細胞、β細胞、δ細胞、PP細胞など、機能的に異なる細胞の不均一な集団で構成されています。β細胞はマウス膵島内の細胞の約80%を占め、インスリン顆粒内のZn²⁺濃度が高いため、他の膵島細胞タイプと区別することができ^14,15、フルオジン-3-AMの^高集団としてβ細胞の同定を可能にします。化学結合を介してミトコンドリアに固定化され、弱い蛍光を発するpH感受性染料であるMtPhagy色素もこのプロトコルで利用されています¹⁶。マイトファジー誘導により、損傷したミトコンドリアが酸性リソソームに取り込まれ、MtPhagy色素は低pH環境(Ex/Em 561/570-700 nm)内で蛍光強度を増加させます。

さらに、テトラメチルローダミン、エチルエステル(TMRE)は、MMPの評価に使用されます。TMREは細胞透過性の正電荷を帯びた色素(Ex/Em 552/575 nm)であり、膜電位によって維持される相対的な負電荷により、健康なミトコンドリアによって隔離される¹⁷。損傷したミトコンドリアや不健康なミトコンドリアは、膜電位を消散させ、TMREを隔離する能力を低下させます。これらの色素を併用すると、マイトファジーを起こしているβ細胞は、フローサイトメトリーによってフルオジン^{高MtPhagy高TMRE低}集団として識別できます。マイトファジーは静的プロセスではなく動的プロセスであるため、このプロトコルは、MMP¹⁸の消散後にマイトファジーを誘導するK ⁺-イオノフォアであるバリノマイシンを使用してマイトファジーフラックスを評価するように最適化されました。バリノマイシンの存在下と非存在下でのマイトファジーの比較により、異なるサンプルグループにおけるマイトファジーフラックスの評価が可能になります。

現在のアプローチは色素ベースの性質を持っているため、ヒト膵島やその他のトランスフェクションが困難な細胞タイプに外挿することができ、mt-Keimaプロトコルとは異なり、複雑な動物育種スキームの必要性を回避します。このプロトコルの包括的な目標は、2つの独立したフローサイトメトリーベースの方法を介して、単一細胞レベルでβ細胞のマイトファジーを定量化することです。まとめると、このプロトコルは、ミトコンドリアの品質管理の定量的研究における精度と柔軟性の両方を可能にする2つの強力で補完的な方法を説明しています。

このプロトコルで提示された動物実験は、ミシガン大学の施設的動物管理および使用委員会によってレビューおよび承認されました。この研究には、15週間の通常の脂肪食(RFD)または高脂肪食(HFD)のいずれかを摂取した20週齢の雄のC57BL / 6Jマウスを使用しました。

1. 色素ベースのMtPhagyアプローチによるマイトファジーの評価(方法1)

1. マウス膵島の準備と治療
   1. 以下の手順に従って、膵島培養とバリノマイシン曝露を行います。
      1. 前述の^{方法に従って}、通常の脂肪食(RFD)または高脂肪食(HFD、60 kcal%脂肪¹⁹)マウスのいずれかから膵島を分離します^2,10。
      2. 100ユニット/mLの抗真菌性抗生物質、50ユニット/mLのペニシリン-ストレプトマイシン、1 mMピルビン酸ナトリウム、10 mMのHEPES、および10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したRPMI培地中で、37°Cで一晩培養した膵島サンプルを採取します( 資料表を参照)。この培地を「膵島培地」と呼ぶことにする。
      3. ピペットを使用して、条件ごとに100個の膵島を、2 mLの膵島培地中の6cmシャーレに選びます。
         注:このプロトコルに使用される条件:(1)未染色対照:未染色RFD膵島;(2)DAPIのみのコントロール:DAPIで染色されたRFD膵島。(3)フルオジン-3-AMのみのコントロール:フルオジン-3-AMで染色されたRFD膵島。(4)MtPhagyのみのコントロール:MtPhagyで染色されたRFD膵島。(5)TMREのみのコントロール:TMREで染色されたRFD膵島。(6)未処理のRFD:MtPhagy、TMRE、Fluozin-3-AM、およびDAPIで染色されたRFD膵島。(7)バリノマイシン曝露RFD膵島:バリノマイシンに曝露され、MtPhagy、TMRE、フルオジン-3-AM、およびDAPIで染色されたRFD膵島。(8)未処理のHFD:MtPhagy、TMRE、Fluorozin-3-AM、およびDAPIで染色されたHFD膵島。(9)バリノマイシン曝露HFD膵島:バリノマイシンに曝露され、MtPhagy、TMRE、フルオジン-3-AM、およびDAPIで染色されたHFD膵島。
      4. バリノマイシンに曝露された条件(7)および(9)(上記の注を参照)では、2 μLの250 nΜのバリノマイシンストック( 材料表を参照)をペトリ皿の膵島に3時間添加し、マイトファジーを誘導します。
   2. 単一細胞の解離を実行します。
      1. バリノマイシンに3時間曝露した後、ピペットを使用して、各条件から100個の膵島を別々の微量遠心チューブに摘み取ります。
      2. 膵島を350 x g で10°Cで1分間スピンし、ピペットを使用して上清を廃棄します。
      3. サンプルを 1 mL の 1x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で 2 回洗浄し、各洗浄の間にスピンステップ(350 x g/1 分、10 °C)します。洗浄のたびにピペットで上清を廃棄してください。
      4. 膵島を単一細胞に解離させるには、500 μLの0.05%トリプシン(37°Cに予熱)を1つのサンプルの微量遠心チューブに添加して、膵島の過剰消化を防ぎます。膵島が目に見える形で分散するまで、繰り返し上下にピペットで移動します。
      5. 予熱した膵島培地1 mLを直ちに添加し、トリプシンを中和します。トリプシン処理と中和を各サンプルに対して1つずつ繰り返します。
      6. サンプルを 500 x g で 10 °C で 5 分間スピンします。 ペレットを乱さないように注意しながら、ピペットで上清を取り除きます。
         注:ペレットは、バリノマイシンに曝露されたサンプルではデリケートです。
      7. 100ユニット/mLの抗真菌性抗生物質、50ユニット/mLのペニシリン-ストレプトマイシン、1 mMピルビン酸ナトリウム、10 mMのHEPES、および10%ウシ血清アルブミン(BSA)を添加したRPMI培地、フェノールレッドなしでサンプルを2回洗浄します。この媒体を「膵島流動媒体」と呼ぶことにする。各洗浄の間にスピンステップ(350 x g/1分、10°C)を含めます。洗浄のたびにピペットで上清を廃棄してください。
   3. 細胞をMtPhagy、TMRE、Fluorozin-3-AM、およびDAPIで染色し、フローサイトメトリーの準備をします。
      1. 膵島サンプルを500 μLの膵島流動培地に再懸濁します。
      2. 0.25 μL の 100 μM MtPhagy ストック( 材料表を参照)を、MtPhagy 色素を投与するチューブに添加します(条件 4、6、7、8、9、ステップ 1.1.1 に注)。
      3. 0.25 μL の 100 μM TMRE ストック( 材料表を参照)を、TMRE 色素を添加するチューブに添加します(条件 5、6、7、8、9)。
      4. フルオジン-3-AM色素を添加するチューブに、0.25 μLの1 mM Fluorozin-3-AMストック( 材料表を参照)を添加します(条件3、6、7、8、9)。
      5. ボルテックスチューブを低速で5秒間混合します。
      6. 微量遠心チューブをアルミホイルで包んで光から保護し、37°Cで30分間インキュベートします。インキュベーションの途中で、ボルテックスチューブを低速で5〜10秒間混合します。
      7. インキュベーション後、サンプルを350 x g で10°Cで1分間遠心分離します。 上清はピペットで廃棄してください。
      8. サンプルを500 μLの膵島流動培地に再懸濁します。0.2 μg/mL の DAPI(材料表を参照)を条件 2、6、7、8、9 に添加します。
      9. サンプルを350 x g で10°Cで1分間スピンします。 ピペットを使用して上清を廃棄し、500 μLの膵島流動培地に再懸濁します。
      10. サンプルを氷の上に置きます。
2. フローサイトメトリー
   1. 装置を起動します( 材料表を参照)。
      注:適切なフィルターを備えたフローサイトメーターであれば、どれでも機能します。この試験では、以下のフィルターを使用しました:(1)DAPIのVL1:励起/発光-405 nm/440 nm(50 nm);(2)フルオジン-3-AMのBL1:励起/発光-488 nm/530 nm(30 nm);(3)MtPhagy色素のBL2:励起/発光 - 488 nm/590 nm(40 nm);(4) TMREのYL1:励起/発光 - 561 nm/585 nm (16 nm)。
   2. 前方散乱(FSC)と側方散乱(SSC)の電圧を調整して、細胞集団が散布図の中心になるようにします。このプロトコルでは、セルがFSC-A対FSC-A 内に均等に収まるようにするために、FSCで120V、SSCで260Vの電圧を使用しました。SSC-Aプロット(図1A)。
   3. 非単一セルを除外するには、FSC-H vs.FSC-Wの後にSSC-Hが続く vs.SSC-W(図1B、C)。
   4. DAPIの電圧と補償を調整して、ライブβセルをフィルタリングします。未染色のRFDサンプルに基づいて、使用する各蛍光色素の蛍光ゲートを設定します(図1D-F)。
      注:各チャネルに使用される電圧:(1)VL1:320-360 V;(2)BL1:300-340 V;(3)BL2:260-300 V;(4)YL1:300-340 V。
   5. ゲートが確立されたら、サンプルごとに 10,000 個のイベントを収集します。
      注:このゲーティングアプローチを利用して、基礎条件下およびバリノマイシン誘導時のマイトファジーレベルをRFD膵島とHFD膵島の両方で評価しました(図2)。
   6. 分析のためにデータをFCSファイルとして保存します。

2. 遺伝子コードmt-Keimaレポーターを用いたマイトファジーの評価(方法2)

1. マウス膵島調製と単一細胞解離
   1. 以下の手順に従って、膵島培養とバリノマイシン曝露を行います。
      1. 野生型(WT)およびmt-Keima/+(mt-Keima)マウスから膵島を単離する⁶.この方法では、20週齢の雄のWTまたはmt-Keima/+給餌RFDマウスを使用しました。
      2. 膵島培地中で37°Cで一晩培養した膵島サンプル。
      3. ピペットを使用して、条件ごとに100個の膵島を、2 mLの膵島培地を含む6cmのシャーレに選びます。
         注:このプロトコルに使用される条件:(1)染色されていないコントロール:染色されていないWT膵島;(2)DAPIのみのコントロール:DAPIで染色されたWT膵島。(3)フルオジン-3-AMのみのコントロール:フルオジン-3-AMで染色されたWT膵島。(4)mt-Keimaのみのコントロール:未染色のmt-Keima/+島。(5)未処理:フルオジン-3-AMおよびDAPIで染色されたmt-Keima/+膵島。(6)バリノマイシン:バリノマイシンに曝露され、フルオジン-3-AMおよびDAPIで染色されたmt-Keima/+膵島。
      4. 状態(6)のバリノマイシン曝露では、2 μLの250 nMバリノマイシンストックをペトリ皿の膵島に3時間添加し、マイトファジーを誘導します。
   2. 単一細胞の解離を実行します。
      1. ステップ1.1.2の説明に従って、単一細胞の解離ステップを実行します。
   3. 細胞をフルオジン-3-AMおよびDAPIで染色します。
      1. 膵島サンプルを500 μLの膵島流動培地に再懸濁します。
      2. 0.25 μL の 1 mM Fluorozin-3-AM ストックを、Fluorozin-3-AM 色素を添加したチューブに添加します(条件 3、5、6)。
      3. 細胞を37°Cでインキュベートし、ステップ1.1.3.5-1.3.10の説明に従ってDAPI処理に進みます。
2. フローサイトメトリー
   1. 測定器を起動します。適切なフィルターを備えたフローサイトメーターであれば、どれでも機能します。
      注:この研究では、次のフィルターを使用しました:(1)DAPIのVL1:励起/発光-405 nm/440 nm(50 nm);(2)フルオジン-3-AMのBL1:励起/発光-488 nm/530 nm(30 nm);(3) VL3 for mt-Keima neutral: 励起/発光 - 405 nm/603 nm (48 nm);(4) mt-Keima 酸の YL2: 励起/発光 - 561 nm/620 nm (15 nm)。
   2. FSCおよびSSC電圧を調整し、手順1.2.2-1.2.3の説明に従って非単一セルを除外します(図3A-C)。
   3. DAPI、フルオジン-3-AM、mt-Keimaの電圧と補正を、無染色および単一陽性コントロール(条件1〜4)を使用して調整し、蛍光陽性細胞集団が未染色細胞と区別できるようにします。各チャンネルに適切な補償を適用したら、DAPI負ゲートとフルオジン-3-AM正ゲートを設定して、生βセルをフィルタリングします(図3D-E)。
   4. mt-Keima陽性サンプル(条件4)を用いてトライアングルゲーティングスキームを設定し、酸性細胞集団と中性細胞集団を同定します(図3F)。
      注:電圧は通常各チャネルに使用されます:(1)VL1:320-340 V;(2)BL2:260-280 V;(3)VL3:280-300 V;(4)YL2:280-300 V。
   5. ゲートが確立されたら、サンプルごとに 10,000 個のイベントを収集します。条件5と6のゲーティングスキームを図3A-Gに示します。
   6. 分析のためにデータをFCSファイルとして保存します。

色素ベースのMtPhagyアプローチによるマイトファジーの評価
この色素ベースのアプローチは、Fluozin-3-AM、TMRE、MtPhagy、およびDAPIを使用して死細胞を除外し、遺伝子レポーターを必要とせずに初代マウスβ細胞内のマイトファジーフラックスを分析するように最適化されました。マイトファジーを誘導するためにこれらの染料をバリノマイシンと組み合わせることにより、このプロトコルは、一次マウスβ細胞18のマイトファジーフラックスを選択的に測定する染料ベースの方法を概説します。このMtPhagy法を用いて示したデータでは、通常の脂肪食(RFD)または高脂肪食(HFD、60 kcal%脂肪)を給餌したマウスから単離した膵島において、基礎マイトファジーとバリノマイシン誘発性マイトファジーの両方を分析し、マイトファジーフラックスに対する代謝ストレスの影響を評価しました。目的の集団を同定するために、未処理のRFD膵島を用いて細胞をゲーティングした。FSCとSSCの電圧は、まず、SSC-A対FSC-Aのプロットでセルが均等に分布するように調整しました(図1A)。単一セルを選択するには、FSC-H vsFSC-WおよびSSC-Hとの比較SSC-Wプロットを使用し、単一セルと比較して幅のシグナル値が高いため、マルチプレットを除外しました(図1B、C)。次に、DAPI陰性細胞を選択して、死細胞20を除外した(図1D)。一次ゲートを確立した後、単一染色コントロールを使用して、Fluorozin-3-AM、MtPhagy、およびTMREの蛍光ゲートを確立し(図1E-G)、およびマルチカラー蛍光フローサイトメトリーのコンペンセーションコントロールを確立しました。

これらの一次ゲートと蛍光ゲートが確立されると、マイトファジーの利用率が高いβ細胞は、バリノマイシン曝露のないRFDを使用して、第3象限(Q3)でフルオジン高MtPhagy高TMRE低集団として定義されました(図1H)。このゲーティング戦略を用いて、基礎マイシンおよびバリノマイシン誘発性マイトファジーレベルをRFDおよびHFD膵島の両方で特徴付けました(図2)。マイトファジーフラックスを定量化するには、基礎 vs.バリノマイシン誘発性マイトファジーレベルは、以下の比率を使用して比較されました。

この比率を用いて、マイトファジーフラックスを定量化し、RFDとRFD で比較した。肥満と末梢インスリン抵抗性の誘発後のマイトファジーの違いを評価するためのHFD β細胞。RFDにおけるマイトファジーフラックスの定量化 vs.HFDサンプルを 図2Eに示します。この結果は、単純な色素ベースのアプローチを使用してβ細胞のマイトファジーを定量するこのアッセイの実現可能性を強調しています。この方法は、ヒト膵島、トランスフェクションが困難な細胞、およびmt-Keimaトランスジェニックモデルとの交配が面倒な複雑な遺伝子モデルから単離された膵島にも適用できます。

遺伝子コードmt-Keimaレポーターを用いたマイトファジーの評価
Mt-Keimaは、ミトコンドリア内膜を標的とするCox8局在配列と融合した二重励起蛍光タンパク質です。mt-Keimaの二峰性蛍光特性により、細胞内コンパートメント6のpHに応じて、励起スペクトルを中性(405 nm)波長から酸性(561 nm)波長に切り替えることができます。これにより、マイトファジーの頑健なレシオメトリック蛍光分析が可能になり、酸性対中性比の増加はマイトファジーの誘導を示します。このプロトコルでは、Fluozin-3-AMがフローサイトメトリーによってβ細胞を選択するのにも使用されました。これらの代表的な研究では、RFD食を与えられたマウスから単離された膵島を使用してマイトファジーフラックスを評価しました10,11。FSCとSSCの電圧は、まずSSC-A対SSC-Aのセルの均等な分布を達成するように調整されました。FSC-Aプロット(図3A)。単一セルを選択するには、FSC-H vsFSC-WおよびSSC-Hとの比較SSC-Wプロットを使用し、単一セルと比較して幅のシグナル値が高いため、マルチプレットを除外しました(図3B、C)。DAPIおよびフルオジン-3-AMの電圧およびゲーティング戦略は、単一染色膵島を用いて決定しました(図3D、E)。次に、バリノマイシンに曝露していないmt-Keima陽性サンプルを使用して、酸性集団と中性集団の三角形のゲートを同定しました(図3F)。

これらの一次ゲートと蛍光ゲートが確立されると、mt-Keima蛍光における基礎およびバリノマイシンによる変化を用いてマイトファジーフラックスを評価しました(図3F、G)。マイトファジーフラックスを定量化するために、基礎マイトファジー vs.バリノマイシン誘発レベルは、以下の比率を使用して比較されました。

この比率を用いて、RFD細胞におけるマイトファジーフラックスを定量した。この結果の定量を 図 3H に示します。重要なことは、これらの結果は、MtPhagyアプローチを使用して生成されたRFD膵島の結果に匹敵することです(図3H)。

図1:MtPhagy法のゲーティングスキーム。 (A)すべてのセルに対して選択するゲーティングスキームを表示するフロープロット。(B) FSC-H vs.FSC-Wおよび(C)SSC-H vs.SSC-Wです。(D)DAPI陰性細胞をゲーティングして死細胞を除外する。(E)β細胞用に選択するフルオジン-3-AMハイセルのゲーティング。(F)MtPhagyhigh細胞集団とMtPhagy low細胞集団を同定するためのMtPhagy 色素のゲーティングスキーム。(g)TMRE高細胞集団およびTMRE低細胞集団を同定するためのTMREのゲーティングスキーム。(H)第3象限(Q3)のフルオジン高MtPhagy高TMRE低細胞をマイトファジーを受けているβ細胞として同定するために、未処理のRFD膵島で確立された象限ゲーティングスキーム。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2:MtPhagyゲーティングスキームを用いた代謝ストレス後のマウスβ細胞におけるマイトファジーフラックスの違いの評価。 (A)未処理のRFD β細胞、(B)未処理のHFD β細胞、(C)バリノマイシン曝露RFD β細胞、および(D)バリノマイシン曝露HFD β細胞の代表的なフローサイトメトリープロット。(E)RFDおよびHFDサンプルについて、バリノマイシンに曝露されたMtPhagy高TMRE低 細胞とバリノマイシンに曝露されていないMtPhagy高TMRE低 細胞の比率を使用して計算された、β細胞におけるマイトファジーフラックスの定量。*p < 0.05 は Student's unpaired t-test による。n = 3/グループ。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:mt-Keima法のゲーティング方式と両法の比較 (A)すべてのセルに対して選択するゲーティングスキームを表示するフロープロット。(B) FSC-H vs.FSC-Wおよび(C)SSC-H vs.SSC-Wです。(D)DAPI陰性細胞をゲーティングして死細胞を除外する。(E)β細胞用に選択するフルオジン-3-AMハイセルのゲーティング。(F)mt-Keima/+未処理細胞および(G)mt-Keima/+バリノマイシン曝露細胞の代表的なフローサイトメトリープロット。(H)mt-Keima法を用いて、バリノマイシンに曝露した酸性/中性細胞の比率と、バリノマイシンに曝露しなかった酸性/中性細胞の比率を用いて計算した、RFD給餌マウスのβ細胞におけるマイトファジーフラックスの定量、およびMtPhagy法と比較した(MtPhagyプロトコルのデータ、図2Eに最初に示されている)。n = 3/グループ。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

SASは、小野薬品工業株式会社から助成金を受けており、ノボノルディスクのコンサルタントを務めています。